專利名稱：一種提高煙草青枯病抗性的方法
技術領域：
本發明涉及一種提高煙草青枯病抗性的方法，具體涉及利用叢枝菌根真菌提高煙草青枯病抗性的方法。
背景技術：
青枯病是煙草生長中最常見的病患之一，它是由茄科勞爾氏菌引起的一種細菌性土傳病害。近年來，該病在我國云南、重慶、湖南、福建等長江以南各煙區普遍發生。在旱地重病煙田，青枯病發病率可達30%-80%，造成大片煙株枯死甚至絕收，嚴重影響煙草的產量和質量，帶來了巨大的經濟損失。目前，煙草生產中防治青枯病主要采用各種拮抗菌制備的微生物制劑，如一種抗煙草青枯病的枯草芽孢桿菌菌劑的制備方法(CN201110195718.7)、用于防除連作煙草青枯病的拮抗菌NJL-14 (CN201010222337.9)或者一些植物成分，如一種防治煙草青枯病的植物源殺菌劑(CN201110317994.6)，或者農藥，如溴菌腈.壬菌銅復配制劑及其防治煙草青枯病的應用(CN201110410302.2)，這些方法在使用中都引入了大量的外源物質或者生物，對生態環境、煙草植株造成污染，如何安全且有效的提高煙草青枯病抗性還有待解決。

發明內容
本發明的目的是為了有效降低煙草的青枯病的發病率和病情指數。本發明的目的是通過以下措施實現的:一種提高煙草青枯病抗性的方法，包括每種叢枝菌根真菌初始菌種單獨擴繁，混合擴繁后的叢枝菌根真菌制備混合叢枝菌根真菌菌劑侵染煙草；所述叢枝菌根真菌擴繁的初始菌種包括蜜色無梗囊霉(A caulospora mellea)、摩西球囊霉(Glomus mosseae)、根內球囊霉(Glomus intraradices);擴繁后的蜜色無梗囊霉(Acaulospora mellea)、摩西球囊霉(Glomus mosseae)、根內球囊霉(Glomus intraradices)的混合比例為 0.5 1:1:1,以重量比計。初始菌種的接種量是擴繁基質的3% 5%，以重量比計。所述叢枝菌根真菌菌劑形成的群落接近于自然狀態，菌種間協同配合更好的發揮提高煙草青枯病抗性的作用。為了提高菌群質量，并提高叢枝菌根真菌的侵染效率，上述混合叢枝菌根真菌菌劑的密度為:孢子密度>20個/克干土。為了有利于菌群各種菌種的共同生長發育，并保有良好的健康狀態，上述叢枝菌根真菌擴繁基質包括3:1的河沙和土壤。進一步地，所述叢枝菌根真菌擴繁基質還包括尿素和過磷酸I丐,按每IOOkg河沙混入5 IOg尿素和20 40g過磷酸I丐的配比量配成基質。為了保證營養的充分有效利用，上述河沙和土壤過Imm篩，121° C高壓蒸汽滅菌或160 170°C干熱滅菌，2小時(h)。上述每種叢枝菌根真菌初始菌種單獨擴繁包括以下步驟:以三葉草或玉米為宿主植物；3:1的河沙和土壤過Imm篩，121° C高壓蒸汽滅菌或160 170° C干熱滅菌2h，每IOOkg河沙再加入5 IOg尿素和20 40g過磷酸|丐配成基質；在基質中分別接種上述叢枝菌根真菌初始菌種進行每種菌種的單獨擴繁，接種量為3% 5%，用層施法或混施法拌勻，然后在基質中加入18% 22%的水，播種宿主植物的種子，常規管理，3 4個月后即可收獲擴繁后的叢枝菌根真菌，收獲的方法是把宿主植物的地上部剪去，剪碎根段混勻，含有宿主植物根段、叢枝菌根真菌孢子、根外菌絲的風干基質即為擴繁后的叢枝菌根真菌。上述提高煙草青枯病抗性的方法，包括下列步驟:( 1)擴繁叢枝囷根真囷，制備混合叢枝囷根真囷囷劑:叢枝囷根真囷初始囷種為蜜色無梗囊霉(Acaulospora mellea)、摩西球囊霉(Glomus mosseae)、根內球囊霉(Glomusintraradices);以三葉草或玉米為宿主植物；3:1的河沙和土壤過Imm篩，121°C高壓蒸汽滅菌或160 170°C干熱滅菌2h,每IOOkg河沙再加入5 IOg尿素和20 40g過磷酸鈣配成基質，在基質中接入3% 5%的所述叢枝菌根真菌初始菌種，用層施法或混施法拌勻，然后在基質中加入18% 22%的水，播種宿主植物的種子，常規管理，3 4個月后即可收獲擴繁后的叢枝菌根真菌，收獲的方法是把宿主植物的地上部剪去，剪碎根段混勻，含有宿主植物根段、叢枝菌根真菌孢子、根外菌絲的風干基質即為擴繁后的叢枝菌根真菌；然后混合擴繁后的叢枝菌根真菌制備混合叢枝菌根真菌菌劑侵染煙草，混合比例為蜜色無梗囊霉(Acaulospora mellea):摩西球囊霉(Glomus mosseae):根內球囊霉(Glomusintraradices) =0.5 1:1:1,以重量比計,含有叢枝菌根真菌孢子、菌絲及被侵染根段。(2)菌根化煙苗的培養:在泡沫漂浮孔穴育苗盤中加入步驟(I)制得的混合叢枝菌根真菌菌劑，其中，以過Imm篩，121° C高壓蒸汽滅菌或160-170° C干熱滅菌2h的河沙作為育苗基質，每100 g育苗基質加入10 g混合叢枝菌根真菌菌劑，播種煙草種子，使育苗盤下半部分浸入自來水中，待種子出苗后間苗，每孔留苗I棵，并把自來水更換成1/5 1/2質量濃度的霍格蘭 (Hoagland)營養液，每天補足減少的水分，每2 3周更換一次營養液；生長60 70天取煙苗，當根系菌根侵染率大于30%時即可用于移栽；為了混合叢枝菌根真菌與煙草能更好的和諧共生，每IOOg育苗基質加入10 g混合叢枝菌根真菌菌劑。(3)將步驟(2)得到的菌根化煙苗在田間進行移栽。根據土壤肥力進行施肥管理，同時進行水分、雜草等田間管理，使植物正常生長。所述的叢枝菌根真菌菌劑的使用方法是采用育苗器育苗的方法施用于植物。所述擴繁后侵染煙草的叢枝菌根真菌的密度為:孢子密度>20個/克干土。密度過低時，通過延長收獲期或在菌劑中再次播種宿主植物以使叢枝菌根真菌的繁殖體擴增；在冬季溫度低時，擴繁過程在溫室內進行。本發明的有益效果1.本發明的叢枝菌根真菌在自然狀態下能夠與煙草共生，通過改善煙草的營養狀況尤其是磷營養來提高煙草的產量和品質，可有效提高煙草的抗旱性、抗鹽堿、抗重金屬等。本發明通過試驗證實,叢枝菌根真菌和煙草形成叢枝菌根共生體后,所述共生體可以改善煙草的礦質營養狀況，促進煙草生長，提高煙草抗病有關酶的活性，煙草的青枯病的發病率減少了 50%以上，病情指數減少了 34%以上，從而提高了煙草對青枯病的抗性。2.本發明采用純天然的方法，幾乎未使用化學藥劑，簡單實用，綠色環保。
具體實施方式
下面結合實施例與具體實施方式
對本發明作進一步詳細說明:實施例1:( I)擴繁叢枝菌根真菌，制備混合叢枝菌根真菌菌劑:叢枝菌根真菌初始菌種為蜜色無梗囊霉(Acaulospora mellea)、摩西球囊霉(Glomus mosseae)、根內球囊霉(Glomus intraradices);以三葉草或玉米為宿主植物；3:1的河沙和土壤過Imm篩，121°C高壓蒸汽滅菌2h，每IOOkg河沙再加入IOg尿素和40g過磷酸鈣配成基質，在基質中接入5%的所述叢枝菌根真菌初始菌種，用層施法或混施法拌勻，然后在基質中加入22%的水，播種宿主植物的種子，常規管理，3個月后即可收獲擴繁后的叢枝菌根真菌，收獲的方法是把宿主植物的地上部剪去，剪碎根段混勻，含有宿主植物根段、叢枝菌根真菌孢子、根外菌絲的風干基質即為擴繁后的叢枝菌根真菌；然后混合擴繁后的叢枝菌根真菌制備混合叢枝菌根真菌菌劑侵染煙草，混合比例為蜜色無梗囊霉(Acaulospora mellea):摩西球囊霉(Glomus mosseae):根內球囊霉(Glomusintraradices) =0.5:1:1,以重量比計,含有叢枝菌根真菌孢子、菌絲及被侵染根段。(2)菌根化煙苗的培養:在泡沫漂浮孔穴育苗盤中加入步驟⑴制得的混合叢枝菌根真菌菌劑，其中，以過Imm篩，121° C高壓蒸汽滅菌，每100 g育苗基質加入10 g混合叢枝菌根真菌菌劑，播種煙草種子，使育苗盤下半部分浸入自來水中，待種子出苗后間苗，每孔留苗I棵，并把自來水更換成1/5強度的霍格蘭(Hoagland)營養液，每天補足減少的水分，每2周更換一次營養液；生長60天取煙苗，當根系菌根侵染率大于30%時即可用于移栽；(3)試驗處理:把120 0g風干的農田土壤進行粉碎，過Icm篩，裝入IL的陶瓷盆中。每盆移栽一株菌根化煙草幼苗，同時移栽一株不接種叢枝菌根真菌的煙苗，共2個處理。每個處理重復20次。對照處理接種60g不含有菌根結構的滅菌菌劑和菌劑濾液。生長40天后接種青枯病原菌，采用灌根法，將濃度為107cfu/ml的孢子懸液I mL稀釋100倍澆灌到植株根部。10天后收獲植物，進行測定分析。本發明使用的蜜色無梗囊霉(Acaulospora mellea)、摩西球囊霉(Glomusmosseae)、根內球囊霉(Glomus intraradices)分別購買于北京市農林科學研究院“叢枝菌根真菌種質在資源庫”、中國農業大學科研機構。本發明的病情指數按照Garabedian的標準方法計算(Garabedian S, Grund S DV.Use of Avermectins for the control of Meloidogyne incognita on tomatoes.Journal of Nematology, 1983,15 (4): 503 — 509)。過氧化物酶的測定按照陳建勵的方法進行測定(陳建勛，王曉峰.植物生理學實驗指導(第二版)[M].廣州:華南理工大學出版社.2006.72-74.)結果表明，接種處理的植物菌根侵染率遠高于對照處理的植物菌根侵染率，植物生物量顯著增加，病情指數和發病率(見表I)顯著降低。過氧化物酶酶活性顯著高于對照植株(表2)。這意味著接種叢枝菌根真菌可以有效促進煙苗生長，提聞抗病有關酶活性，提高煙草對青枯病的抗性。表I植物收獲后不同接種處理煙草青枯病的發病情況(單位:％)
權利要求
1.一種提高煙草青枯病抗性的方法，包括每種叢枝菌根真菌初始菌種單獨擴繁，混合擴繁后的叢枝菌根真菌制備混合叢枝菌根真菌菌劑侵染煙草；所述叢枝菌根真菌擴繁的初始菌種包括蜜色無梗囊霉( eBea)、摩西球囊霉(Glomus fflosseae)、根內球囊霉(Glomus in traradices);擴繁后的蜜色無梗囊霉摩西球囊霉(Glomus fflosseae)、根內球囊霉(Glomus intraradices)的混合比例為 0.5 1:1:1,以重量比計。
2.如權利要求1所述的提高煙草青枯病抗性的方法，其特征在于所述初始菌種的接種量是擴繁基質的3% 5%。
3.如權利要求1或2所述的提高煙草青枯病抗性的方法，其特征在于所述擴繁后侵染煙草的叢枝菌根真菌的密度為:孢子密度>20個/克干土。
4.如權利要求1 3所述的提高煙草青枯病抗性的方法，所述叢枝菌根真菌擴繁基質包括3:1的河沙和土壤。
5.如權利要求4所述的提高煙草青枯病抗性的方法，所述叢枝菌根真菌擴繁基質還包括尿素和過磷酸韓，每IOOkg河沙加入5 IOg尿素和20 40g過磷酸隹丐。
6.如權利要求4或5所述的提高煙草青枯病抗性的方法，所述河沙和土壤過Imm篩，121°C高壓蒸汽滅菌2h或160 170°C干熱滅菌2h。
7.如權利要求1 6任一所述的提高煙草青枯病抗性的方法，所述每種叢枝菌根真菌初始菌種單獨擴繁包括以下步驟:以三葉草或玉米為宿主植物；3:1的河沙和土壤過Imm篩，121°C高壓蒸汽滅菌或160 170°C干熱滅菌2h，每IOOkg河沙再加入5 IOg尿素和20 40g過磷酸鈣配成基質；在基質中分別接種上述叢枝菌根真菌初始菌種進行每種菌種的單獨擴繁，接種量為3% 5%，用層施法或混施法拌勻，然后在基質中加入18% 22%的水，播種宿主植物的種子，常規管理，3 4個月后即可收獲擴繁后的叢枝菌根真菌，收獲的方法是把宿主植物的地上部剪去,剪碎根段混勻。
8.如權利要求1 7任一所述的提高煙草青枯病抗性的方法，所述提高煙草青枯病抗性的方法，包括下列步驟: (1)擴繁叢枝囷根真囷，制備混合叢枝囷根真囷囷劑:叢枝囷根真囷初始囷種為蜜色無梗囊霉i Acaulospora eBea)、摩西球囊霉(Glomus fflosseae)、根內球囊霉(Glomusintraradices);以三葉草或玉米為宿主植物；3:1的河沙和土壤過Imm篩，121 °C高壓蒸汽滅菌或160 170°C干熱滅菌2h,每IOOkg河沙再加入5 IOg尿素和20 40g過磷酸鈣配成基質，在基質中接入3% 5%的所述叢枝菌根真菌初始菌種，用層施法或混施法拌勻，然后在基質中加入18% 22%的水，播種宿主植物的種子，常規管理，3 4個月后即可收獲擴繁后的叢枝菌根真菌，收獲的方法是把宿主植物的地上部剪去，剪碎根段混勻，含有宿主植物根段、叢枝菌根真菌孢子、根外菌絲的風干基質即為擴繁后的叢枝菌根真菌；然后混合擴繁后的叢枝菌根真菌制備混合叢枝菌根真菌菌劑侵染煙草，混合比例為蜜色無梗囊霉(me I lea):摩西球囊霉(Glomus mosseae):根內球囊霉(Glomusintraradices") =0.5 1:1:1,以重量比計,含有叢枝菌根真菌孢子、菌絲及被侵染根段； (2)菌根化煙苗的培養:在泡沫漂浮孔穴育苗盤中加入步驟(I)制得的混合叢枝菌根真菌菌劑，以過Imm篩，121°C高壓蒸汽滅菌或160-170°C干熱滅菌2h的河沙作為育苗基質，每100 g育苗基質加入 10 g混合叢枝菌根真菌菌劑，播種煙草種子，使育苗盤下半部分浸入自來水中，待種子出苗后間苗，每孔留苗I棵，并把自來水更換成1/5 1/2質量濃度的霍格蘭(Hoagland)營養液,每天補足減少的水分，每2 3周更換一次營養液；生長60 70天取煙苗，當根系菌根侵染率大于30%時即可用于移栽； (3)將步驟(2)得到的菌根化煙苗在田間進行移栽；根據土壤肥力進行施肥管理，同時進行水分、雜草等田間 管理，使植物正常生長。
全文摘要
本發明提供了一種提高煙草青枯病抗性的方法，包括每種叢枝菌根真菌初始菌種單獨擴繁，混合擴繁后的叢枝菌根真菌制備混合叢枝菌根真菌菌劑侵染煙草；所述叢枝菌根真菌擴繁的初始菌種包括蜜色無梗囊霉(Acaulosporamellea)、摩西球囊霉(Glomusmosseae)、根內球囊霉(Glomusintraradices)；擴繁后的蜜色無梗囊霉(Acaulosporamellea)、摩西球囊霉(Glomusmosseae)、根內球囊霉(Glomusintraradices)的混合比例為0.5～1:1:1，以重量比計。本發明促進煙草生長，有效降低煙草的青枯病的發病率和病情指數，從而提高了煙草對青枯病的抗性。
文檔編號A01G1/00GK103155815SQ20131008611
公開日2013年6月19日 申請日期2013年3月18日 優先權日2013年3月18日
發明者郭濤, 習向銀 申請人:西南大學