一種來源于巨桉的多逆境誘導(dǎo)型啟動子pG5及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體公開了一種來源于巨桉的多逆境誘導(dǎo)型啟動子pG5及其應(yīng)用。所述啟動子具體為巨桉品種EG6的多逆境誘導(dǎo)型基因G6PDH的啟動子。所述啟動子的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。本發(fā)明的啟動子的調(diào)控元件包含有涉及低溫脅迫應(yīng)答、干旱脅迫應(yīng)答、光應(yīng)答、激素應(yīng)答等等元件。所述啟動子可被低溫、干旱等逆境所誘導(dǎo)表達(dá)，能用于植物源的誘導(dǎo)型表達(dá)載體，在生物工程領(lǐng)域中具有廣泛的適用性和很好的應(yīng)用前景。
【專利說明】一種來源于巨桉的多逆境誘導(dǎo)型啟動子PG5及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地，涉及一種來源于巨桉的多逆境誘導(dǎo)型啟動子PG5及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]戊糖磷酸途徑是植物體內(nèi)糖代謝的重要途徑，其主要生理功能是為生物合成提供還原力NADPH和為核酸的合成提供五碳糖，以及部分中間產(chǎn)物可參與氨基酸和脂肪酸合成等等。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶是其關(guān)鍵性調(diào)控限速酶(林元震.2006.甜楊葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的基因克隆及結(jié)構(gòu)分析與功能鑒定.博士學(xué)位論文，北京林業(yè)大學(xué)，導(dǎo)師:張志毅，pp.44-66)，涉及了多種環(huán)境脅迫引起的植物應(yīng)答反應(yīng)，比如與一些金屬離子(如Al3+)的脅迫、水分脅迫、鹽脅迫、低溫脅迫、病原菌侵染等有關(guān)，說明多種逆境脅迫可誘導(dǎo)G6TOH的表達(dá)，G6TOH基因啟動子區(qū)域可能含有涉及多種環(huán)境脅迫應(yīng)答的調(diào)控元件。
[0003]啟動子是一段能與RNA聚合酶及其轉(zhuǎn)錄因子特異結(jié)合、決定基因轉(zhuǎn)錄起始的DNA序列，其類型直接決定了外源基因表達(dá)的時空效應(yīng)(侯丙凱，夏光敏，陳正華.2001.植物基因工程表達(dá)載體的改進和優(yōu)化策略.遺傳，23(5):492- 497)。植物基因啟動子中往往包含許多不同的順式作用元件，可在轉(zhuǎn)錄水平上參與調(diào)控下游相應(yīng)基因表達(dá)，從而使植物增強抵御外界環(huán)境脅迫的能力(聶麗娜，夏蘭琴，徐兆師，高東堯，李琳，于卓，陳明，李連城，馬有志.2008.植物基因啟動子的克隆及其功能研究進展.植物遺傳資源學(xué)報，9(3): 385-391)。因此分離與弄清楚植物啟動子的分子本質(zhì)不僅是研究基因表達(dá)調(diào)控機制的重要內(nèi)容，而且也是構(gòu)建基因工程表達(dá)載體的關(guān)鍵。
[0004]每年，非生物逆境給農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟損失，主要原因是逆境嚴(yán)重影響了植物的正常生長發(fā)育。近年來，隨著植物抗寒生理生化及分子機理研究的深入，科學(xué)家們已相繼從多種植物中分離出抗逆境基因，并通過基因工程的途徑，顯著提高了農(nóng)林作物對非生物逆境的抵抗能力。但是，在植物抗逆基因工程中，目前大多使用組成型的強啟動子。對于雙子葉植物，一般使用花椰菜葉病毒CaMV 35S啟動子或胭脂堿氨酸合成酶Nos啟動子；對于單子葉植物,最常用的是水稻肌動蛋白Actl啟動子、玉米泛素Ubi啟動子及35S啟動子(夏江東，程在全，吳渝生，季鵬章.2006.高等植物啟動子功能和結(jié)構(gòu)研究進展.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，21 (I): 7-14)。雖然這些啟動子能使外源基因在植物中高效表達(dá)，轉(zhuǎn)基因植物的抗逆性雖然得到了提高，但往往抑制了植物的生長發(fā)育。根據(jù)Kasuga等報道，組成型啟動子CaMV 35S驅(qū)動DREB基因轉(zhuǎn)化擬南芥，雖轉(zhuǎn)基因植株提高了抗逆性，但植株生長受到抑制，表現(xiàn)為植株矮化、生長畸形、籽粒數(shù)減少(Kasuga M, Liu Q,Miura S， Yamaguch1-Shinozaki K， Shinozaki K.1999.1mproving plant drought,salt and freezing tolerance by gene transfer of a single stress—inducibletranscription factor.Nat Biotechnolj 17: 287 - 291);而由誘導(dǎo)型啟動子rd29A驅(qū)動DREB基因在擬南芥中表達(dá)，不僅提高了植株的抗逆性，而且也避免了對植株生長的負(fù)面影口向(Kasuga Mj Miura S， Shinozaki K， Yamaguch1-Shinozaki K.2004.A combinationof the Arabidopsis DREBlA gene and stress—inducible rd29A promoter improveddrought-and low—temperature stress tolerance in tobacco by gene transfer.PlantCell Physiol, 45 (3):346-350)。因此，尋找特異的新誘導(dǎo)型啟動子，來驅(qū)動外源基因定向、定位表達(dá)成為當(dāng)前植物分子生物學(xué)的研究熱點之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的為了克服現(xiàn)有技術(shù)中特異的新誘導(dǎo)型啟動子資源匱乏的缺陷，提供一種來源于巨桉的多逆境誘導(dǎo)型啟動子PG5。
[0006]本發(fā)明的另一個目的是提供一種來源于巨桉的多逆境誘導(dǎo)型啟動子pG5在啟動目的基因表達(dá)中的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)上述目的:
一種來源于巨桉的多逆境誘導(dǎo)型啟動子PG5，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0008]所述啟動子pG5受低溫、干旱等逆境環(huán)境誘導(dǎo)。
[0009]一種重組載體，所述重組載體為在出發(fā)載體的多克隆位點插入如上所述啟動子pG5的(SEQ ID N0:1)序列。所述出發(fā)載體可以是本【技術(shù)領(lǐng)域】中經(jīng)常用到的所有類型的表達(dá)載體，優(yōu)選地，本發(fā)明所用到的出發(fā)載體為PBI121載體，得到的重組載體為pBI121:pG5。
[0010]一種包含如上所述重組載體(優(yōu)選為重組載體PBI121:pG5)的重組菌。
[0011]一種包含如上所述重組載體(優(yōu)選為重組載體pBI121:pG5)的細(xì)胞系。
[0012]用于擴增啟動子pG5 (序列如SEQ `ID NO:1)的全長或其任意片段的引物對也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0013]如上所述啟動子pG5在啟動目的基因表達(dá)中的應(yīng)用；所述目的基因的表達(dá)受低溫、干旱誘導(dǎo)。優(yōu)選地，所述目的基因為GUS基因。
[0014]一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，具體步驟為:將含有如上所述啟動子PG5的重組載體導(dǎo)入所述出發(fā)植物，從而得到利用啟動子PG5啟動目的基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植物；所述目的基因的表達(dá)受低溫、干旱誘導(dǎo)。
[0015]所述出發(fā)植物為煙草；所述低溫為4 °C，24 h ;干旱為25% PEG 6000,24 h。
[0016]所述目的基因為⑶S基因。
[0017]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果:
1、本發(fā)明所述啟動子pG5的調(diào)控元件包含有涉及低溫脅迫應(yīng)答、干旱脅迫應(yīng)答、光應(yīng)答、激素應(yīng)答等等元件，可受低溫、干旱等多種逆境誘導(dǎo)；啟動子序列區(qū)域內(nèi)未含有常見的酶切位點如Xbal、SacI, EcoRI, HindIII等，無需使用其他價格較昂貴的限制性內(nèi)切酶，便于表達(dá)載體的構(gòu)建，節(jié)約經(jīng)費；該啟動子可被低溫、干旱等逆境所誘導(dǎo)表達(dá)，可廣泛用于植物源的誘導(dǎo)型表達(dá)載體，也可用于單啟動子驅(qū)動多基因的誘導(dǎo)表達(dá)，綜合提高受體植物的抗多種逆境能力；同時還可作為高大喬木基因工程內(nèi)的誘導(dǎo)型啟動子資源匱乏的一個補充。
[0018]2、本發(fā)明所述的多逆境誘導(dǎo)型啟動子pG5是從桉樹上獲得的第一個G6PDH基因啟動子。該啟動子在國際上是首次報道。而且，該啟動子可被低溫、干旱等逆境所誘導(dǎo)表達(dá)，能用于植物源的誘導(dǎo)型表達(dá)載體，在生物工程領(lǐng)域中具有廣泛的適用性和很好的應(yīng)用前景。
[0019]說明書附圖圖1.啟動子PG5的核苷酸序列編號示意圖。
[0020]圖2.啟動子pG5的調(diào)控元件示意圖。
[0021]圖3.轉(zhuǎn)基因煙草葉片染色結(jié)果；A =RpBI 121煙草葉片；B:轉(zhuǎn)pG5-GUS煙草葉片。
[0022]圖4.轉(zhuǎn)基因煙草葉片在不同溫度、干旱處理下⑶S基因的表達(dá)量柱形圖；A:轉(zhuǎn)基因煙草葉片在不同溫度處理下GUS基因的表達(dá)量；B:轉(zhuǎn)基因煙草葉片在干旱處理下GUS基因的表達(dá)量。
【具體實施方式】
[0023]下面結(jié)合附圖和具體實施例進一步詳細(xì)說明本發(fā)明。除非特別說明，實施例中采用的試劑和方法為本領(lǐng)域常規(guī)使用的試劑和方法。
[0024]巨桉(品種EG6):從國家林業(yè)局桉樹研究開發(fā)中心獲得。
[0025]煙草(品種NC89):華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，林業(yè)生物技術(shù)實驗室組培苗。
[0026]pBI 121載體:來源于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)；參考文獻:余云舟，金寧一，王罡，季靜，王萍，李昌.2004.HIV-1 gag基因和gpl20基因轉(zhuǎn)化番茄及轉(zhuǎn)基因植株再生.中國生物工程雜志，2: 37-40。
[0027]農(nóng)桿菌LBA 4404:來源于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)；參考文獻:聞雙勇，智慶文，劉欣潔，張紅偉，譚振波，李仕貴.2004.水稻T-DNA插入突變體庫的構(gòu)建及突變類型的分析.遺傳學(xué)報，31 (12): 1388-1394。
[0028]實施例1 啟動子的發(fā)現(xiàn)
提取巨桉(品種EG6)的基因組DNA，桉樹基因組DNA的提取參照本領(lǐng)域常規(guī)方法。設(shè)計特異件引物(Pl:5’ -TCATTCTAGAGCGTAATTGCTGTC GCACCC-3’，如 SEQ ID NO:2，下劃線為Xba I 酶切位點)和(P2:5’ -GCTCAAGCTTCGAGAAGGAATCGCTTCTGA-3’,如 SEQ ID N0:3，下劃線為Sac I酶切位點)對基因組DNA進行擴增，將片段回收、克隆后進行DNA測序，獲得一個720bp的DNA片段，720bp的DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。對擴增的SEQID NO:1所示的序列進行調(diào)控區(qū)的分析，鑒定出基因的起始密碼子ATG，去除結(jié)構(gòu)基因的部分。獲得基因的5’端的調(diào)控序列，啟動子的調(diào)控元件如圖2所示，TATA盒位于-150~-155區(qū)，與低溫脅迫相關(guān)的LTR元件位于-384~-389區(qū)，與干旱脅迫相關(guān)的MBS元件位于-61~-66區(qū)，與光應(yīng)答相關(guān)的MNFl元件位于-33~-50、-425~-442區(qū)，Spl元件位于-345~-354區(qū)。另外有大量的激素調(diào)控元件分布于啟動子區(qū)段，如與GA(赤霉素)相關(guān)的GARE元件位于-124~-130區(qū)、P-Box元件位于-462~-467區(qū)，與ABA(脫落酸)相關(guān)的MYB元件位于-334~-339區(qū)，與MeJA (茉莉酸)相關(guān)的TGACG元件位于-307~-401、- 605~-609區(qū)。SEQ ID NO:1所示的序列就是啟動子的序列。啟動子命名為PG5。因為起始密碼子ATG的編號從I開始，所以啟動子的序列編號從-660~+60 (如圖1所示)。將啟動子pG5與pGEM-T easy載體連接得到的重組質(zhì)粒命名為pGEM_T:pG5。
[0029]實施例2
一、啟動子pG5的低溫、干旱誘導(dǎo)活性驗證重組表達(dá)載體的構(gòu)建
1、用限制性內(nèi)切酶Xba I和Sac I酶切實施例1制備的pGEM_T:pG5，回收酶切產(chǎn)物(pG5)。
[0030]2、用限制性內(nèi)切酶Xba I和Sac I酶切雙元載體pBI 121，獲得去除CaMV 35S啟動子的PBI 121載體骨架。
[0031]3、將步驟I的酶切產(chǎn)物和步驟2的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒，進行測序驗證，測序結(jié)果表明，得到了目的質(zhì)粒PG5-GUS (用SEQ ID NO:1所示序列的pG5取代pBI 121的Xba I和Sac I酶切識別位點間的小片段)。
[0032]二、瞬時表達(dá)轉(zhuǎn)化煙草
將含有PG5-GUS和pBI 121-GUS表達(dá)載體的農(nóng)桿菌分別用YEB液體培養(yǎng)基搖菌，28°C>200 rpm,過夜培養(yǎng)至OD6qq=L O。4 V、5000 rpm離心10 min,收集農(nóng)桿菌,重新懸浮于10 mM MES緩沖液(pH 5.6，IOmM MgS04, 100 μΜ乙酰丁香酮)。室溫靜置3小時后，輕搖混勻，用2mL注射器將菌液沿?zé)煵萑~片遠(yuǎn)軸面主葉脈側(cè)端注射入葉片中。48小時后，收集處理的葉片，進行GUS染色實驗。
[0033]三、啟動子的功能驗證:啟動子的活性檢測通過GUS活性測定實驗進行，實驗方法如下:將步驟二得到的煙草葉片(轉(zhuǎn)PG5-GUS煙草葉片或轉(zhuǎn)pBI 121煙草葉片)切割后放入一個印pedorf離心管中，加入X-Gluc染色液，25 °C培養(yǎng)箱暗處過夜。第二天觀察葉片的染色。染色結(jié)果見圖3。圖3A顯示，轉(zhuǎn)pBI 121煙草葉片呈現(xiàn)大片的藍(lán)色，表明⑶S基因已經(jīng)大量表達(dá)。圖3B顯示，轉(zhuǎn)pG5-GUS煙草葉片也呈現(xiàn)藍(lán)色，表明⑶S基因也已經(jīng)表達(dá)。結(jié)果說明，PG5和CaMV 35S 啟動子一樣具有啟動基因轉(zhuǎn)錄的活性。
[0034]四、啟動子的低溫、干旱誘導(dǎo)活性驗證
根據(jù)GUS基因的序列，設(shè)計特異性GPl和GP2，利用Actin基因作為內(nèi)標(biāo)基因。
[0035]⑶SPl:5’ -CTGCGACGCTCACACCGATACC-3’，SEQ ID NO:4 ；
⑶SP2: 5’ -TCACCGAAGTTCATGCCAGTCCAG-3’，SEQ ID NO:5。
[0036]ActinPl:5/ -CTGCTGGAATTCACGAAACA-3' ,SEQ ID NO:6 ；
ActinP2:5/ -GCCACCACCTTGATCTTCAT-3'，SEQ ID NO:7。
[0037]將步驟二得到的煙草葉片(轉(zhuǎn)PG5-GUS煙草葉片或轉(zhuǎn)pBI121煙草葉片)各分為兩組，低溫誘導(dǎo)組為常溫(25 V )和低溫(4 V )下處理2小時；干旱誘導(dǎo)組為清水(25 V )和25% PEG6000 (25 °C )處理2小時。分別提取總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA。利用上述引物對不同脅迫處理下的cDNA樣品進行Real-time PCR檢測(Roche Lightcycler 48011)。以轉(zhuǎn)pBI121煙草葉片在室溫下或清水處理2小時的⑶S基因表達(dá)量為1，將兩組煙草葉片在不同溫度、干旱處理下⑶S基因的表達(dá)量繪制柱形圖，見圖4。圖4A顯示:低溫處理組，在常溫下的轉(zhuǎn)PG5-GUS煙草葉片，⑶S基因的表達(dá)量很少(相對表達(dá)量為0.336)，而低溫下的轉(zhuǎn)化煙草葉片有大量的GUS基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(相對表達(dá)量為0.950)，差異量達(dá)到近3倍，差異顯著(P〈0.05);在常溫下的轉(zhuǎn)PBI121煙草葉片，⑶S基因的表達(dá)量為1，而低溫處理后的轉(zhuǎn)化煙草，GUS基因的相對表達(dá)量為1.06，差異量不顯著。圖4B顯示:干旱處理組，在清水處理下的轉(zhuǎn)PG5-GUS煙草葉片，⑶S基因的表達(dá)量很少(相對表達(dá)量為0.316)，而干旱處理下的轉(zhuǎn)化煙草葉片有大量的⑶S基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(相對表達(dá)量為0.850)，差異達(dá)到顯著(P〈0.05);在清水處理下的轉(zhuǎn)PBI121煙草葉片，⑶S基因的表達(dá)量為1，而干旱處理后的轉(zhuǎn)化煙草，GUS基因的相對表達(dá)量為1.02，兩者差異量不顯著。上述結(jié)果表明，啟動子pG5具有低溫、干旱誘導(dǎo)特性。實施例2的`實驗重復(fù)進行三次，都得到了同樣的結(jié)果。
【權(quán)利要求】
1.一種來源于巨桉的多逆境誘導(dǎo)型啟動子PG5，其特征在于，核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述啟動子pG5，其特征在于，所述啟動子pG5受低溫或干旱誘導(dǎo)。
3.—種重組載體，其特征在于，所述重組載體為在出發(fā)載體的多克隆位點插入權(quán)利要求I所述啟動子序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述重組載體，其特征在于，所述重組載體為pBI121:pG5。
5.一種包含權(quán)利要求3或4所述重組載體的重組菌。
6.一種包含權(quán)利要求3或4所述重組載體的細(xì)胞系。
7.權(quán)利要求1所述啟動子pG5在啟動目的基因表達(dá)中的應(yīng)用；所述目的基因的表達(dá)受低溫、干旱誘導(dǎo)。
8.一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，其特征在于，將含有權(quán)利要求1所述啟動子的重組載體導(dǎo)入所述出發(fā)植物，從而得到利用權(quán)利要求1所述啟動子啟動目的基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植物；所述目的基因的表達(dá)受低溫、干旱誘導(dǎo)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述方法，其特征在于，所述出發(fā)植物為煙草；所述低溫為4°C,24h ;干旱為 25% PEG 6000,24 h。
10.根據(jù)權(quán)利要求8 所述方法，其特征在于:所述目的基因為GUS基因。
【文檔編號】A01H5/00GK103589724SQ201310348484
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年8月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月12日
【發(fā)明者】林元震, 莫曉勇, 楊小紅, 楊會肖, 周瑋, 陳曉陽 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)