專利名稱：以葉片為外植體的光葉薔薇植株的再生方法
技術領域：
本發明涉及以葉片為外植體的光葉薔薇植株的再生方法，屬于植物組織與細胞培養技術領域。
背景技術：
光葉薔薇(Rosawichuriana Crep.)屬于薔薇科(Rosaceae)薔薇屬(Rosa)攀援灌木，是現代月季原始親本之一。主要分布在我國的浙江、廣東、廣西、福建、臺灣等省及日本、朝鮮等國。現已培育出很多園藝品種，并廣泛栽培。目前，尚未見到光葉薔薇及其雜交種的體細胞再生途徑研究的系統報道，制約了研究者對月季優良性狀的深入研究和應用。Lloyd等(1988)在僅含有BA和NAA的培養基 上直接從光葉薔薇的葉上誘導出不定芽，但未報道誘導率。郭艷超等(2008)通過類原球莖途徑以光葉薔薇的葉片為外植體得到了類原球莖，但未報道得到再生植株。

發明內容
本發明的目的在于克服現有技術的缺陷，提供一種以葉片為外植體的光葉薔薇植株的再生方法，以光葉薔薇頂生幼嫩小葉為材料，通過體器官發生途徑，建立光葉薔薇再生體系的方法，同時本發明方法所獲得的胚性愈傷組織，可作為光葉薔薇遺傳轉化的材料。本發明通過下列技術方案實現一種以葉片為外植體的光葉薔薇植株的再生方法，其特征在于經過下列各步驟
(O將光葉薔薇的健壯幼嫩枝條滅菌后切成單芽莖段，接種于下列培養基上MS基本培養基 +1. 0mg/L6-BA+0. lmg/LNAA+6. 5g/L 瓊脂 +30g/L 蔗糖，ρΗ=5· 8 6. 0，于 24 士 2°C,光照強度為1500 20001χ，光照時間為16h/d的條件下，繼代培養2 4周，得到光葉薔薇的無菌苗；
(2)切取步驟(I)所得光葉薔薇無菌苗的頂生幼嫩小葉，將其接種于下列誘導培養基上MS基本培養基+5. O 9. Omg/L α -萘乙酸+30. Og/L葡萄糖+2. 5g/L植物凝膠，pH=5. 8 6. 0，并將葉背朝向培養基，在24 士 2°C的黑暗條件下，培養至誘導出胚性愈傷組織；
(3)將步驟(2)得到的胚性愈傷組織接種到下列增殖分化培養基上MS基本培養基+3. O 6. Omg/L N-苯基-N，-1, 2，3-噻重氮-5-基脲+30g/L葡萄糖+2. 5g/L植物凝膠，pH=5. 8 6. 0，先在24 士 2°C的黑暗條件下培養10 11天，然后在24 士 2°C、光照強度為1500 20001x、光照時間為16h/d的條件下，培養至分化出不定芽；
(4)切下步驟(3)得到的不定芽，接種到下列成苗培養基上MS基本培養基+0.1 1. 0mg/L 6-芐基腺嘌呤+0. 01 0. lmg/L α -萘乙酸+30. 0g/L蔗糖+6. 5g/L瓊脂粉，pH=5. 8 6. 0，在溫度為24 士 2°C、光照強度為1500 20001x、光照時間為16h/d的條件下，培養至不定芽再生出植株；
(5)將步驟(4)得到的植株接種到下列生根培養基上1/2MS基本培養基+0.Olmg/La-萘乙酸+30. Og/L蔗糖+6. 5g/L瓊脂粉，pH=5. 8 6. 0，在溫度為24 士 2°C、光照強度為1500 20001x、光照時間為16h/d的條件下，進行生根培養，直至培養出完整的植株。所述步驟(I)的莖段滅菌是先用1%的洗衣粉漂洗lOmin，再在自來水下沖洗60min,然后用1%升萊消毒8min,再以無菌水洗4 5次。作為優選方案，所述步驟(2)的誘導培養基中的a -萘乙酸為5. Omg/L
作為優選方案，所述步驟(3)的增殖分化培養基中N-苯基-N’ -1, 2，3-噻重氮-5-基脲(TDZ)為 5. Omg/L ο作為優選方案，所述步驟(3)的黑暗培養天數為10天。作為優選方案，所述步驟(4)的成苗培養基中6-芐基腺嘌呤為O. lmg/L、a -萘乙酸為 O. 05mg/L。 所述的植物激素定義及簡稱如下植物生長調節物質包括a -萘乙酸(NAA)，植物細胞分裂素包括N-苯基-N’ -1, 2，3-噻重氮-5-基脲(TDZ)、6-芐基腺嘌呤(6-BA)。所述植物凝膠為市購產品，作為培養基的凝固劑，其作用類似于瓊脂。本發明以光葉薔薇葉片為外植體，通過器官發生途徑進行光葉薔薇植株再生，以光葉薔薇頂生幼嫩小葉為外植體，直接誘導胚性愈傷組織，繼而分化不定芽得到完整的再生植株；這些胚性愈傷組織為農桿菌介導的遺傳轉化提供了良好的受體；同時，該再生體系也是光葉薔薇遺傳轉化的理想受體并為研究轉基因月季新品種奠定了一定的技術基礎。本發明具備的優點和效果是
(1)本發明所采用的外植體來源不受季節限制，可以周年進行光葉薔薇的組織和細胞培養；
(2)本發明得到的胚性愈傷組織，可以作為遺傳轉化的良好受體，為光葉薔薇遺傳轉化體系的建立提供受體；
(3)本發明建立的再生體系可以解決光葉薔薇繁殖上的難題，以更好的保護和利用該資源。
具體實施例方式下面通過實施例對本發明做進一步說明。實驗材料光葉薔薇采自云南省昆明市云南農業科學院花卉研究所雨樹村野生資源圃，為通過光葉薔薇培育出的園藝雜交品種‘Rosa wichuraina ‘Basye’ s Thornless’，二倍體，該種引種于美國A&M大學。該材料具有一年一次開花，花白色，五瓣花，莖干無皮刺，匍匐，抗白粉病等性狀特點，是研究薔薇屬植株性狀發育的理想模式材料，并已在月季花發育研究領域得到廣泛應用。實施例1
(1)將上述光葉薔薇的健壯幼嫩枝條先用1%的洗衣粉漂洗lOmin，再在自來水下沖洗60min,然后在超凈工作臺上用1%升汞消毒8min，再以無菌水洗5次后，切成單芽莖段，接種于下列培養基上MS基本培養基+1. 0mg/L6-BA+0. lmg/LNAA+6. 5g/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH=6.0，于25°C、光照強度為15001x、光照時間為16h/d的條件下，進行繼代培養2周，得到光葉薔薇的無菌苗；
(2)切取步驟(I)所得光葉薔薇無菌苗的頂生幼嫩小葉，自小葉柄處將其切成帶有小葉柄的單葉，將其接種于誘導培養基上MS基本培養基+5. Omg/L α -萘乙酸+30. Og/L葡萄糖+2. 5g/L植物凝膠，pH=6. 0，并將葉背朝向培養基，在溫度為24°C的黑暗條件下，培養誘導胚性愈傷組織，培養25天后小葉柄處形成胚性愈傷；
(3)將步驟(2)得到的胚性愈傷組織接種到增殖分化培養基上MS基本培養基+5.Omg/L N-苯基-N，-1, 2，3-噻重氮-5-基脲(TDZ)+30g/L葡萄糖+2. 5g/L植物凝膠，pH=6. O,先在溫度為24°C的黑暗條件下培養10天，然后在溫度24°C、光照強度為20001x、光照時間為16h/d的條件下，進行分化培養25天，得到I 2cm的不定芽；
(4)將步驟(3)得到的不定芽從外植體上切下接種到成苗培養基上MS基本培養基+0. lmg/L 6-芐基腺嘌呤 +0. 05mg/L α -萘乙酸 +30. Og/L 蔗糖 +6. 5g/L 瓊脂粉，ρΗ=6· O,在溫度為24°C、光照強度為20001x、光照時間為16h/d的的條件下，培養2周，使其再生出2 3cm植株；
(5)將步驟(4)中得到的植株接種到生根培養基上1/2MS基本培養基+0.01mg/La -萘 乙酸+30. Og/L蔗糖+6. 5g/L瓊脂粉，pH=6. 0，在溫度為24°C、光照強度為20001x、光照時間為16h/d的條件下，進行生根培養2周，得到完整的根系發育良好的光葉薔薇植株；
(6 )將步驟(5 )的光葉薔薇植株在散射光下煉苗一周，然后移栽到經高壓滅菌的泥炭土中室內種植，成活后移到室外。
實施例2
(1)將上述光葉薔薇的健壯幼嫩枝條先用1%的洗衣粉漂洗lOmin，再在自來水下沖洗60min,然后在超凈工作臺上用1%升汞消毒8min，再以無菌水洗4次后，切成單芽莖段，接種于下列培養基上MS基本培養基+1. 0mg/L6-BA+0. lmg/LNAA+6. 5g/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH=5.8，于22°C、光照強度為18001x、光照時間為16h/d的條件下，進行繼代培養3周，得到光葉薔薇的無菌苗；
(2)切取步驟(I)所得光葉薔薇無菌苗的頂生幼嫩小葉，將其接種于誘導培養基上MS基本培養基+不同濃度7. 0mg/L的a -萘乙酸+30. 0g/L葡萄糖+2. 5g/L植物凝膠，pH=5. 8，并將葉背朝向培養基，在溫度為26°C的黑暗條件下，培養21天后小葉柄處有胚性愈傷形成；
(3)將步驟(2)得到的胚性愈傷組織接種到增殖分化培養基上MS基本培養基+6.Omg/L N-苯基-N，-1, 2，3-噻重氮-5-基脲(TDZ)+30g/L葡萄糖+2. 5g/L植物凝膠，pH=5. 8，先在溫度為26°C的黑暗條件下培養11天，然后在溫度為26°C、光照強度為18001x、光照時間為16h/d的條件下，進行分化培養21天，得到不定芽；
(4)將步驟(3)得到的不定芽接種到成苗培養基上MS基本培養基+0.5mg/L 6-芐基腺嘌呤+0. O lmg/L α-萘乙酸+30. 0g/L蔗糖+6. 5g/L瓊脂粉，ρΗ=5· 8，在溫度為26°C、光照強度為15001x、光照時間為16h/d的條件下，培養2周，使其再生出2 3cm植株；
(5)將步驟(4)中得到的植株接種到生根培養基上1/2MS基本培養基+0.01mg/La -萘乙酸+30. 0g/L蔗糖+6. 5g/L瓊脂粉，pH=5. 8，在溫度為26°C、光照強度為15001x、光照時間為16h/d的條件下，進行生根培養，2周后可獲得完整的植株。實施例3
(O將光葉薔薇的健壯幼嫩枝條先用1%的洗衣粉漂洗lOmin，再在自來水下沖洗60min,然后在超凈工作臺上用1%升汞消毒8min，再以無菌水洗5次后，切成單芽莖段，接種于下列培養基上MS基本培養基+1. 0mg/L6-BA+0. lmg/LNAA+6. 5g/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH=5. 9，于溫度為24°C、光照強度為20001x光照時間為16h/d的條件下，進行繼代培養4周得到光葉薔薇的無菌苗；
(2)切取步驟(I)所得光葉薔薇無菌苗的頂生幼嫩小葉，將其接種于誘導培養基上MS基本培養基+9. Omg/L α -萘乙酸+30. Og/L葡萄糖+2. 5g/L植物凝膠，pH=6. O,并將葉背朝向培養基，在溫度為22°C的黑暗條件下，培養24天誘導胚性愈傷組織；
(3)將步驟(2)得到的胚性愈傷組織接種到增殖分化培養基上MS基本培養基+4.Omg/L的N-苯基-N，-1, 2，3-噻重氮-5-基脲(TDZ)+30g/L葡萄糖+2. 5g/L植物凝膠，pH=6. 0，先在溫度22°C的黑暗條件下培養10天，然后在溫度22°C、光照強度為15001x光照時間為16h/d的條件下培養24天后得到不定芽；
(4)將步驟(3)得到的不定芽接種到成苗培養基上MS基本培養基+1.Omg/L 6-芐基腺嘌呤+0. lmg/L α -萘乙酸+30. Og/L蔗糖+6. 5g/L瓊脂粉，pH=6. 0，在溫度22°C的光照強 度為18001x光照時間為16h/d的條件下，培養2周，使其再生出2 3cm植株；
(5)將步驟(4)中得到的植株接種到生根培養基上1/2MS基本培養基+0.01mg/La -萘乙酸+30. 0g/L蔗糖+6. 5g/L瓊脂粉，pH=5. 9，在溫度22°C、光照強度為18001x光照時間為16h/d的條件下進行生根培養，2周后即可得到完整的植株。實施例4
(O將光葉薔薇的健壯幼嫩枝條先用1%的洗衣粉漂洗lOmin，再在自來水下沖洗60min,然后在超凈工作臺上用1%升汞消毒8min，再以無菌水洗5次后，切成單芽莖段，接種于下列培養基上MS基本培養基+1. 0mg/L6-BA+0. lmg/LNAA+6. 5g/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH=6. O,于26°C光照強度為20001x，光照時間16h/d的條件下，進行繼代培養2周得到光葉薔薇的無菌苗；
(2)切取步驟(I)所得光葉薔薇無菌苗的頂生幼嫩小葉，將其接種于誘導培養基上MS基本培養基+8. 0mg/L a -萘乙酸+30. 0g/L葡萄糖+2. 5g/L植物凝膠，pH=6. O,并將葉背朝向培養基，在溫度25°C的黑暗條件下培養誘導胚性愈傷組織；
(3)將步驟(2)得到的胚性愈傷組織接種到增殖分化培養基上MS基本培養基+3.Omg/L N-苯基-N，-1, 2，3-噻重氮-5-基脲(TDZ) +30g/L葡萄糖+2. 5g/L植物凝膠，pH=6. 0，先在溫度25°C的黑暗條件下培養11天，然后在溫度25°C、光照強度為20001x光照時間為16h/d的條件下培養25天可得到不定芽；
(4)將步驟(3)得到的不定芽接種到成苗培養基上MS基本培養基+0.5mg/L 6-芐基腺嘌呤+0. 05mg/L a -萘乙酸+30. 0g/L蔗糖+6. 5g/L瓊脂粉，ρΗ=5· 8，在溫度為25°C，光照強度為20001x光照時間為16h/d的條件下培養，使其生長成植株；
(5)將步驟(4)中得到的植株接種到生根培養基上1/2MS基本培養基+0.01mg/La -萘乙酸+30. 0g/L蔗糖+6. 5g/L瓊脂粉，pH=5. 8，在溫度25°C、光照強度為20001x光照時間為16h/d的條件下生根培養，2周后即可得到完整的植株。實施例5
(O將光葉薔薇的健壯幼嫩枝條先用1%的洗衣粉漂洗lOmin，再在自來水下沖洗60min,然后在超凈工作臺上用1%升汞消毒8min，再以無菌水洗5次后，切成單芽莖段，接種于下列培養基上MS基本培養基+1. 0mg/L6-BA+0. lmg/LNAA+6. 5g/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH=5.8，于溫度為26°C、光照強度為20001x、光照時間為16h/d的條件下，進行繼代培養4周得到光葉薔薇的無菌苗；
(2)切取步驟(I)所得光葉薔薇無菌苗的頂生幼嫩小葉，將其接種于誘導培養基上MS基本培養基+9. Omg/L α -萘乙酸+30. Og/L葡萄糖+2. 5g/L植物凝膠，pH=5. 8，并將葉背朝向培養基，在溫度25°C的黑暗條件下，培養23天誘導胚性愈傷組織；
(3)將步驟(2)得到的胚性愈傷組織接種到增殖分化培養基上MS基本培養基+3.Omg/L N-苯基-N’-1，2，3-噻重氮-5-基脲(TDZ)+30g/L葡萄糖+2. 5g/L植物凝膠，pH=5. 9，先在溫度25°C的黑暗條件下培養10天，然后在溫度25°C、光照強度為20001x光照時間為16小時的條件下培養25天，可得到不定芽；
(4)將步驟(3)得到的不定芽接種到成苗培養基上MS基本培養基+0.5mg/L 6-芐基 腺嘌呤+0. lmg/L α -萘乙酸+30. Og/L蔗糖+6. 5g/L瓊脂粉，pH=5. 9，在溫度25°C、光照強度為20001x光照時間為16h/d的條件下培養，使其生長為植株；
(5)將步驟(4)中得到的植株接種到生根培養基上1/2MS基本培養基+0.01mg/La -萘乙酸+30. Og/L蔗糖+6. 5g/L瓊脂粉，pH=5. 8，在溫度25°C、光照強度為20001x光照時間為16小時的條件下進行生根培養，2周即得到完整的植株。
權利要求
1.一種以葉片為外植體的光葉薔薇植株的再生方法，其特征在于經過下列各步驟(O將光葉薔薇的健壯幼嫩枝條滅菌后切成單芽莖段，接種于下列培養基上MS基本培養基 +1. 0mg/L6-BA+0. lmg/LNAA+6. 5g/L 瓊脂 +30g/L 蔗糖，ρΗ=5· 8 6. O，于 24 士 2°C, 光照強度為1500 20001χ，光照時間為16h/d的條件下，繼代培養2-4周，得到光葉薔薇的無菌苗；(2)切取步驟(I)所得光葉薔薇無菌苗的頂生幼嫩小葉，將其接種于下列誘導培養基上MS基本培養基+5. O 9. Omg/L α -萘乙酸+30. Og/L葡萄糖+2. 5g/L植物凝膠， pH=5. 8 6. 0，并將葉背朝向培養基，在24 士 2°C的黑暗條件下，培養至誘導出胚性愈傷組織；(3)將步驟(2)得到的胚性愈傷組織接種到下列增殖分化培養基上MS基本培養基 +3. O 6. Omg/L N-苯基-N，-1, 2，3-噻重氮-5-基脲+30g/L葡萄糖+2. 5g/L植物凝膠， pH=5. 8 6. 0，先在24 士 2°C的黑暗條件下培養10 11天，然后在24 士 2°C、光照強度為 1500 20001x、光照時間為16h/d的條件下，培養至分化出不定芽；(4)切下步驟(3)得到的不定芽，接種到下列成苗培養基上MS基本培養基+0.1 1.Omg/L 6-芐基腺嘌呤+0. 01 O. lmg/L α -萘乙酸+30. Og/L蔗糖+6. 5g/L瓊脂粉， pH=5. 8 6. 0，在溫度為24 士 2°C、光照強度為1500 20001x、光照時間為16h/d的條件下，培養至不定芽再生出植株；(5)將步驟(4)得到的植株接種到下列生根培養基上1/2MS基本培養基+0.Olmg/ L α -萘乙酸+30. 0g/L蔗糖+6. 5g/L瓊脂粉，pH=5. 8 6. 0，在溫度為24 士 2°C、光照強度為1500 20001x、光照時間為16h/d的條件下，進行生根培養，直至培養出完整的植株。
2.根據權利要求1所述的以葉片為外植體的光葉薔薇植株的再生方法，其特征在于所述步驟(I)的莖段滅菌是先用1%的洗衣粉漂洗lOmin，再在自來水下沖洗60min，然后用 1%升萊消毒8min,再以無菌水洗4 5次。
全文摘要
本發明涉及一種以葉片為外植體的光葉薔薇植株的再生方法，先在繼代培養基上培養出無菌苗，再在誘導培養基上培養愈傷組織，又在增殖分化培養基上培養分化出不定芽，在成苗培養基上培養再生出植株，最后在生根培養基上培養得到完整的植株。本發明的方法具有外植體來源廣泛、取材方便等優點。所得到的胚性愈傷組織可以作為農桿菌介導的遺傳轉化的良好受體，可用于光葉薔薇遺傳轉化的研究。本發明還涉及用于該方法的培養基組成。
文檔編號A01H4/00GK103004600SQ20121056194
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月22日 優先權日2012年12月22日
發明者呂經娟, 唐開學, 李淑斌, 蹇洪英, 晏慧君, 周寧寧, 張顥 申請人:云南省農業科學院花卉研究所