一株高抗逆性屎腸球菌及其培養(yǎng)方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一株高抗逆性屎腸球菌及其培養(yǎng)方法和應(yīng)用。屎腸球菌WEI-10分離自60日齡仔豬糞便，能夠耐受低pH環(huán)境和高濃度豬膽鹽，可以在胃腸消化液中長時(shí)間保持活性，而且對大腸桿菌、沙門氏菌、藤黃微球菌、金黃色葡萄球菌均有抑菌作用，抑菌圈直徑達(dá)到30-40mm。將上述發(fā)酵液通過高速管式離心機(jī)收集菌體后，與專用保護(hù)劑混合，真空冷凍干燥凍干44h后結(jié)束，獲得的干燥菌粉用粉碎機(jī)破碎后與同樣粒度的麩皮按照一定比例混合，獲得微生態(tài)制劑產(chǎn)品。該產(chǎn)品用作微生物飼料添加劑添加于畜禽飼料中，可以調(diào)節(jié)畜禽腸道微生態(tài)平衡，提高畜禽的生產(chǎn)性能和抗病能力，有望成為飼用抗生素的替代產(chǎn)品。
【專利說明】一株高抗逆性屎腸球菌及其培養(yǎng)方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一株屎腸球菌，特別是涉及一株高抗逆性屎腸球菌及其培養(yǎng)方法和應(yīng)用。
[0002]背景介紹
[0003]飼料是動(dòng)物的食品和人類的間接食品，飼料安全工程無疑是食品安全工程的重要一環(huán)。我國已啟動(dòng)“飼料安全工程”，并禁用了一批毒性和殘留較大的飼料添加劑產(chǎn)品。加快新型飼料添加劑的開發(fā)與生產(chǎn)，特別是是替代飼用抗生素的飼料添加劑的生產(chǎn)是實(shí)現(xiàn)健康養(yǎng)殖及養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的有力保障。微生態(tài)制劑作為一種綠色、安全的飼料添加劑成為產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的熱點(diǎn)，是替代飼用抗生素的主要產(chǎn)品之一，已成為研制熱點(diǎn)和未來的發(fā)展方向。
[0004]目前市售微生態(tài)制劑產(chǎn)品良莠不齊，很多產(chǎn)品所用菌種對胃腸消化液、膽鹽耐受能力差，真正能夠到達(dá)小腸發(fā)揮功效的菌種很少。另一方面，很多產(chǎn)品的活菌數(shù)并未達(dá)到其標(biāo)注的最低活菌數(shù)，致使產(chǎn)品的效果也會大打折扣。究其原因是所用菌種未經(jīng)嚴(yán)格篩選，菌種發(fā)酵時(shí)未能實(shí)現(xiàn)低成本、高產(chǎn)量的優(yōu)化培養(yǎng)，進(jìn)而導(dǎo)致菌種的益生功效不明顯，發(fā)酵結(jié)束時(shí)活菌數(shù)達(dá)不到預(yù)期要求。此外，為了保證微生態(tài)制劑產(chǎn)品的活性，發(fā)酵后的菌體必須經(jīng)過適當(dāng)?shù)暮筇幚聿拍鼙ＷC產(chǎn)品在保藏、運(yùn)輸和使用過程中微生物活性不會損失太大。針對乳酸菌而言，太過激烈的后處理?xiàng)l件，如噴霧干燥、流化床干燥等常規(guī)干燥方法會導(dǎo)致菌體的大量死亡。最適合乳酸菌后處理的工藝是真空冷凍干燥法，這種方法雖然成本稍高，但是可以保證干燥后活菌數(shù)損失 最小，保存時(shí)間最長。因此，分離、篩選對胃腸消化液和膽鹽具有高度耐受性的優(yōu)良益生菌株，并優(yōu)化優(yōu)良菌株的低成本、高產(chǎn)量的發(fā)酵工藝和后處理工藝是開發(fā)乳酸菌微生態(tài)制劑的必由之路。
[0005]屎腸球菌是農(nóng)業(yè)部《飼料添加劑品種目錄》所列菌種，是微生態(tài)制劑常用乳酸菌菌種。屎腸球菌產(chǎn)酸，能夠調(diào)節(jié)腸道菌群，維持腸道微生態(tài)平衡。在動(dòng)物體內(nèi)對病原微生物有拮抗作用，能夠增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體的免疫功能，產(chǎn)生有益的代謝產(chǎn)物，激活酸性蛋白酶的活性，參與機(jī)體的新陳代謝，防止有害物質(zhì)產(chǎn)生。
[0006]因此，篩選一株高抗逆性屎腸球菌，并開發(fā)一種低成本、高產(chǎn)量，能長期保持活性的屎腸球菌微生態(tài)制劑，對于發(fā)展綠色飼料，保證食品安全具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供了一株高抗逆性屎腸球菌(Enterococcus faecium)WE1-10CGMCC No7746。
[0008]從健康仔豬糞便中分離、篩選得到一株乳酸菌，經(jīng)16S rDNA測序鑒定為屎腸球菌(Enterococcus faecium) WE1-10,并于2013年6月19日送中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，編號為CGMCC N0.7746，保藏地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院中科院微生物研究所郵編:100101電話:86-10-64807596。
[0009]屎腸球菌(Enterococcusfaecium)WE1-10CGMCC N0.7746 屬革蘭氏陽性細(xì)菌，圓形或橢圓形，呈鏈狀排列，無芽孢，無鞭毛。生長溫度范圍在30-40°C，適宜pH值的范圍
6.0-8.0，是兼性厭氧乳酸菌。該菌株在MRS培養(yǎng)基中生長良好，繁殖速度快，生長曲線如圖1所示，2h后進(jìn)入對數(shù)期，12h菌數(shù)增殖達(dá)到最高，穩(wěn)定期活菌數(shù)為6.5X 108-7.8X IO8CFU /mL。
[0010]屎腸球菌(Enterococcusfaecium) WE1-10CGMCC N0.7746 在 pH 為 2-3 的人工胃液中保持3h，存活率85%;在人工胃腸消化液中保持26h，活菌數(shù)可以維持在IO7CFU / mL,這個(gè)時(shí)間符合腸道生理周期，能夠保證菌體發(fā)揮益生作用；在豬膽鹽濃度為20g/L的人工豬膽鹽溶液中，保持3h，存活率為65%，這個(gè)膽鹽濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于動(dòng)物體內(nèi)的0.3g/L的平均膽鹽濃度。
[0011]上述特性評價(jià)試驗(yàn)中，所述人工胃液包括如下成分:每1000mL水中含有胃蛋白酶3g，NaC12g，調(diào)pH至2-3 ;所述人工胃腸消化液包括如下成分:人工胃液pH調(diào)至3，人工腸液包括如下成分:每1000mL水中含有胰蛋白酶10g，KH2P047gJ pH至7.5，測試過程中，菌體在人工胃液中保持2h，然后接入人工腸液中保持24h ;所述人工豬膽鹽溶液成分包括:每1000mL水中含有胰蛋白酶lg，豬膽鹽20g，NaC15g，調(diào)pH至7.0。
[0012]屎腸球菌(Ent erococcusfaecium) WE1-10CGMCC N0.7746對大腸桿菌、沙門氏菌、藤黃微球菌、金黃色葡萄球菌均有抑菌作用，抑菌圈直徑達(dá)到30-40mm。
[0013]本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供了一株高抗逆性屎腸球菌(Enterococcus faecium)WE1-10CGMCC N0.7746的大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)方法。
[0014]本發(fā)明所提供的屎腸球菌(Enterococcusfaecium) WE1-10CGMCC N0.7746 的大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)方法，是將屎腸球菌(Enterococcus faecium) WE1-10CGMCC N0.7746接種到該菌的專用液體培養(yǎng)基中，30-40°C下靜置或不通氣培養(yǎng)。所述專用液體培養(yǎng)基的配方為:每1000mL水中含有:糖蜜10-30g，玉米漿粉20-40g，檸檬酸銨l_3g，三水合乙酸鈉2_8g，七水合硫酸鎂0.1-0.5g，一水合硫酸錳0.02-0.08g，三水合磷酸氫二鉀l-3g，吐溫800.5-1.5g，pH 值為 8-8.5。
[0015]在上述培養(yǎng)方法中，接種比例為I 培養(yǎng)溫度為37°C;靜置或不通氣培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為 10-12h。
[0016]優(yōu)選的專用液體培養(yǎng)基的配方為:每1000mL水中含有:糖蜜21.88g，玉米漿粉31.56g，檸檬酸銨2g，三水合乙酸鈉5g，七水合硫酸鎂0.2g，一水合硫酸錳0.05g,三水合磷酸氫二鉀2g，吐溫801.04g, pH值為8。
[0017]在50L發(fā)酵罐條件下，利用上述培養(yǎng)基在37°C，50rpm，不通氣條件下發(fā)酵獲得的屎腸球菌(Enterococcus faecium) WE1-10CGMCC N0.7746發(fā)酵液活菌數(shù)達(dá)到
2X 109-3 X IO9CFU / mL,而在同樣條件下，屎腸球菌(Enterococcus faecium) WE1-10CGMCCN0.7746在MRS培養(yǎng)基中的活菌數(shù)為7.2X108CFU / mL，優(yōu)化后的培養(yǎng)基使得活菌數(shù)提高
2.7-4 倍。
[0018]本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供屎腸球菌(Enterococcus faecium)WE1-10CGMCCN0.7746作為微生態(tài)制劑的制備方法,其特征在于:將屎腸球菌(Enterococcus faecium)WE1-lOCGMCCN0.7746按照上述培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件發(fā)酵獲得的發(fā)酵液通過高速管式離心機(jī)收集菌體后，與保護(hù)劑混合均勻，先于_70°C預(yù)凍，然后置于真空冷凍干燥機(jī)中干燥后獲得活性菌粉，活菌數(shù)為2X 10n-3X IO11CFU / g，以同樣粒度的麩皮為載體可以稀釋為含有不同活菌數(shù)的微生態(tài)制劑產(chǎn)品。
[0019]所述管式離心機(jī)收集菌體的轉(zhuǎn)速為15000-20000rpm。
[0020]所述用于真空冷凍干燥處理的菌體保護(hù)劑配方為每1000mL水中含有:脫脂奶粉100g，谷氨酸鈉10g，海藻糖10g，甘油30g。保護(hù)劑與離心后的菌泥按照體積質(zhì)量比5: I混合均勻，于_70°C預(yù)凍2-3h，然后置于真空冷凍干燥機(jī)中真空凍干44h后結(jié)束，凍干參數(shù)如下:真空度小于30Pa，冷阱溫度為-40°C至_50°C。
[0021]基于上述特性，本發(fā)明提供的屎腸球菌(Enterococcus faecium)WE1-10CGMCCN0.7746具有顯著的益生特性，動(dòng)物服用后可以通過胃液和膽鹽，并在腸道中存活。按照上述培養(yǎng)方法和后處理方法制備的微生態(tài)制劑產(chǎn)品，用作畜禽微生物飼料添加劑，可以調(diào)節(jié)畜禽腸道微生態(tài)平衡，提高畜禽生產(chǎn)能力、抗病能力，最終減少飼用抗生素的使用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1 為屎腸球菌(Enterococcus faecium) WE1-10CGMCC N0.7746 在 MRS 培養(yǎng)基中的生長曲線。
[0023]圖2 為屎腸球菌(Enterococcus faecium) WE1-10CGMCC N0.7746 對人工胃腸消化液的耐受性。圖中前2h是菌株在人工胃液中的存活曲線，隨后的24h是菌株從人工胃液轉(zhuǎn)接至人工腸液后的存活曲線。
[0024]圖3 為尿腸球菌(Enterococcus faecium) WE1-10CGMCC N0.7746 最適發(fā)酵初始 pH值的優(yōu)化。
[0025]圖4 為尿腸球菌(Enterococcus faecium) WE1-10CGMCC N0.7746 最適發(fā)酵溫度的優(yōu)化。
[0026]圖5 為尿腸球菌(Enterococcus faecium) WE1-10CGMCC N0.7746 最適工業(yè)級復(fù)合碳源的優(yōu)化。
[0027] 圖6 為尿腸球菌(Enterococcus faecium) WE1-10CGMCC N0.7746 最適氣源的優(yōu)化。
[0028]圖7 為屎腸球菌(Enterococcus faecium) WE1-10CGMCC N0.7746 在 50L 發(fā)酵罐條件下的生長曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0029]實(shí)施例一:屎腸球菌(Enterococcusfaecium)WE1-10CGMCC N0.7746 的分離和鑒
定
[0030]稱取60日齡健康仔豬的糞便lg，放入盛有99mL滅菌的0.85%生理鹽水的三角瓶中(三角瓶中預(yù)先放入20粒無菌玻璃珠)，37°C，180rpm震蕩30min，吸取ImL懸濁液做十倍遞增梯度稀釋，選取2-3個(gè)適宜稀釋度，吸取ImL稀釋液于無菌培養(yǎng)皿中，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平行；向加有稀釋液的培養(yǎng)皿中加入融化后冷卻至46°C的MRS瓊脂培養(yǎng)基，小心轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿使試樣與培養(yǎng)基充分混合，37°C培養(yǎng)48-72h。從培養(yǎng)皿上挑選不同形態(tài)的菌落劃線純化，分別保藏并進(jìn)行16S rDNA的測序鑒定。
[0031]實(shí)施例二:屎腸球菌(Enterococcusfaecium) WE1-10CGMCC N0.7746 耐受低 pH 胃液、人工胃腸消化液和豬膽鹽[0032]從屎腸球菌(Enterococcusfaecium) WE1-10CGMCC N0.7746 的保藏斜面(MRS 培養(yǎng)基)挑一環(huán)菌苔接于裝有IOOmL液體MRS培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于37°C，靜置培養(yǎng)12h，將菌液在6000rpm的條件下離心10min，棄去上清，用滅菌的0.85%的生理鹽水洗滌一次，再用同體積生理鹽水懸浮。吸取IOmL懸浮菌液分別接于裝有90mL pH分別為1、2、
3、4、5的人工胃液和90mL人工豬膽鹽溶液的250mL三角瓶中，豬膽鹽濃度分別為3g / L、5g/L、10g/L、15g / L、20g / L，以不加膽鹽的樣品為對照。然后在37°C，靜置培養(yǎng)180min，分別于初始接種、30min、60min、120min、180min對培養(yǎng)物進(jìn)行活菌計(jì)數(shù),繪制活菌數(shù)變化曲線，計(jì)算菌株在不同PH人工胃液和不同濃度人工膽鹽中保溫180min時(shí)的存活率。菌液在人工胃液中保溫2h后吸取IOmL菌懸液接于裝有90mL人工腸液的250mL三角瓶中，同樣在37°C，靜置培養(yǎng)，分別于初始接種、3h、6h、21h、24h對培養(yǎng)物進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，繪制活菌數(shù)變化曲線。測定結(jié)果顯不，屎腸球菌(Enterococcus faecium)WE1-10CGMCC N0.7746 在 pH 高于I的人工胃液中保持180min(3h)，存活率達(dá)到80%以上；在濃度為20g / L的人工豬膽鹽溶液中保持180min(3h)，存活率超過60% ;在人工胃腸消化液中保持26h，活菌數(shù)可以維持在IO7CFU / mL，這個(gè)時(shí)間符合腸道生理周期，能夠保證菌體發(fā)揮益生作用。上述結(jié)果表明，屎腸球菌(Enterococcus faecium)WE1-10CGMCC N0.7746能夠耐受酸性環(huán)境,耐受高濃度豬膽鹽，并且能夠在胃腸消化液中保持足夠長的存活時(shí)間，說明屎腸球菌(EnterococcusFaecium) WE1-10CGMCC N0.7746是一株高抗逆性益生乳酸菌，可以經(jīng)過畜禽的胃、十二指腸后保持活性，并最終進(jìn)入小腸定殖。
[0033]實(shí)施例三:屎腸球菌(Enterococcusfaecium)WE1-10CGMCC N0.7746 的抑菌活性
[0034]1.培養(yǎng)液上清的制備
[0035]從屎腸球菌(EnterococcusFaecium) WE1-10CGMCC N0.7746 的保藏斜面(MRS 培養(yǎng)基)挑一環(huán)菌苔接種 于液體MRS培養(yǎng)基中，37°C，靜置培養(yǎng)12h，取ImL菌液12000rpm離心Imin,取上清液。
[0036]2.抑菌活性檢測平板的制備
[0037]將15mL完全熔化的LB瓊脂培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，待其凝固后垂直放上牛津杯；另取完全熔化的LB瓊脂培養(yǎng)基，待其冷卻到55°C時(shí)加入指示菌混勻，取IOmL混有指示菌的培養(yǎng)基倒入放有牛津杯的培養(yǎng)皿中，待完全凝固后拔出牛津杯，制成檢測平板。所述指示菌包括大腸桿菌、沙門氏菌、藤黃微球菌、金黃色葡萄球菌。
[0038]3.抑菌活性的測定
[0039]取200 μ L培養(yǎng)液上清加入檢測平板的孔中，4°C放置24h后放入37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20h，測量抑菌圈直徑大小為30-40mm。
[0040]實(shí)施例四:尿腸球菌(Enterococcusfaecium)WE1-10CGMCC N0.7746 的最適發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化
[0041]一、尿腸球菌(Enterococcus faecium)WE1-10CGMCC N0.7746 的最適生長環(huán)境條件的優(yōu)化
[0042]1、最適初始pH值的優(yōu)化
[0043]考察不同初始pH 值對屎腸球菌(Enterococcus faecium) WE1-10CGMCC N0.7746生長的影響。從屎腸球菌(Enterococcus faecium) WE1-10CGMCC N0.7746的保藏斜面(MRS培養(yǎng)基)挑一環(huán)菌苔接于裝有IOOmL液體MRS培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于37°C，靜置培養(yǎng)llh，以I %的接種量分別接于裝有300mL pH為5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5的液體MRS培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，于37°C，靜置培養(yǎng)16h，開始培養(yǎng)后分別于2h、4h、6h、10h、12h、14h、16h取樣測定0D600，并于培養(yǎng)結(jié)束時(shí)測定每個(gè)樣品的活菌數(shù)。優(yōu)化結(jié)果表明，屎腸球菌(Enterococcus faecium) WE1-10CGMCC N0.7746 最適生長初始 pH 值范圍為 8.0-8.5。
[0044]2、最適發(fā)酵溫度的優(yōu)化
[0045]考察不同溫度對尿腸球菌(Enterococcusfaecium)WE1-10CGMCC N0.7746 生長的影響。從屎腸球菌(Enterococcus faecium)WE1-10CGMCC N0.7746 的保藏斜面(MRS 培養(yǎng)基)挑一環(huán)菌苔接于裝有IOOmL液體MRS培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于37°C，靜置培養(yǎng)llh，以I %的接種量接于裝有300mL pH為8.0的液體MRS培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，分別于 25°C、30°C、37°C、40°C、42 V、45°C、48 V，靜置培養(yǎng) IOh，開始培養(yǎng)后分別于 2h、4h、6h、8h、10h取樣測定0D600，并于培養(yǎng)結(jié)束時(shí)測定每個(gè)樣品的活菌數(shù)。優(yōu)化結(jié)果表明，屎腸球菌(Enterococcus faecium) WE1-10CGMCC N0.7746 最適生長溫度范圍為 37_40°C。
[0046]3、最適轉(zhuǎn)速的優(yōu)化
[0047]考察不同轉(zhuǎn)速對尿腸球菌(Enterococcusfaecium)WE1-10CGMCC N0.7746生長的影響。從屎腸球菌(Enterococcus faecium)WE1-10CGMCC N0.7746 的保藏斜面(MRS 培養(yǎng)基)挑一環(huán)菌苔接 于裝有IOOmL液體MRS培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于37°C，靜置培養(yǎng)Ilh，以I %的接種量接于裝有300mL pH為8.0的液體MRS培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，于37°C，轉(zhuǎn)速分別調(diào)至50rpm、100rpm、200rpm，并以靜置培養(yǎng)為對照，培養(yǎng)10h，開始培養(yǎng)后分別于2h、4h、6h、8h、10h取樣測定OD6c?，并于培養(yǎng)結(jié)束時(shí)測定每個(gè)樣品的活菌數(shù)。優(yōu)化結(jié)果表明，不同轉(zhuǎn)速對屎腸球菌(Enterococcus faecium)WE1-10CGMCC N0.7746生長的影響沒有顯著差異，表明屎腸球菌(Enterococcus faecium)WE1-10CGMCC N0.7746的生長對氧氣的需求不顯著，實(shí)際發(fā)酵過程中為了節(jié)省能源，可以在無需通氣的條件下發(fā)酵。
[0048]二、尿腸球菌(Enterococcus faecium)WE1-10CGMCC N0.7746 的最適發(fā)酵培養(yǎng)基組分的優(yōu)化
[0049]1、最適碳源的優(yōu)化
[0050]米用上述最適生長條件，考察了屎腸球菌(Enterococcus faecium)WE1-10CGMCCN0.7746對單一碳源，包括葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、甘油和工業(yè)上常用的復(fù)合碳源，包括糖蜜、乳清粉、葡萄糖漿、低聚異麥芽糖和糊精的利用情況。采用與上述同樣的接種方法，固定氮源為蛋白胨IOg / L，牛肉粉5g / L，酵母粉5g / L，含有不同碳源(含量均為20g /L)的培養(yǎng)基的pH值均為8.0，培養(yǎng)溫度為37°C，靜置培養(yǎng)10h，開始培養(yǎng)后分別于2h、4h、6h、8h、IOh取樣測定0D_，并于培養(yǎng)結(jié)束時(shí)測定每個(gè)樣品的活菌數(shù)。綜合考慮原料成本和菌體生長情況，最終確定屎腸球菌(Enterococcus faecium)WE1-10CGMCC N0.7746生長的最適碳源為糖蜜。
[0051]2、最適氮源的優(yōu)化
[0052]米用上述最適生長條件，考察了屎腸球菌(Enterococcus faecium)WE1-10CGMCCN0.7746對蛋白胨、牛肉膏、玉米漿、玉米漿粉、酵母膏、尿素、硝酸鈉和硫酸銨等幾種氮源的利用情況。采用與上述同樣的接種方法，固定碳源為蔗糖20g / L，含有不同氮源(含量按照每種氮源的含氮量與MRS培養(yǎng)基中的含氮量一致的原則進(jìn)行換算)的培養(yǎng)基的pH值均為
8.0，培養(yǎng)溫度為37°C，靜置培養(yǎng)10h，開始培養(yǎng)后分別于2h、4h、6h、8h、10h取樣測定OD6tltl,并于培養(yǎng)結(jié)束時(shí)測定每個(gè)樣品的活菌數(shù)。綜合考慮原料成本和菌體生長情況，最終確定屎腸球菌(Enterococcus faecium)WE1-10CGMCC N0.7746生長的最適氮源為玉米漿粉。
[0053]3、Plackett-Burman 試驗(yàn)
[0054]用于培養(yǎng)屎腸球菌(Enterococcusfaecium) WE1-10CGMCC N0.7746 的發(fā)酵培養(yǎng)基中含有8種組分,利用Plackett-Burman設(shè)計(jì)從8種原料中篩選出對活菌產(chǎn)量有顯著影響的因素。各因素及其水平見表1，Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2,數(shù)據(jù)的回歸分析及顯著性分析見表3。表3的分析結(jié)果表明，玉米漿粉是影響屎腸球菌(Enterococcusfaecium)WE1-10CGMCC N0.7746發(fā)酵活菌產(chǎn)量的最顯著因素，其余因素的影響作用依次為糖蜜、吐溫80、三水合磷酸氫二鉀、一水合硫酸錳、七水合硫酸鎂、檸檬酸銨、三水合乙酸鈉。其中糖蜜、玉米漿粉、七水合硫酸鎂、吐溫80對活菌數(shù)的影響是正相關(guān)，檸檬酸銨、三水合乙酸鈉、一水合硫酸錳、三水合磷酸氫二鉀對活菌數(shù)的影響是負(fù)相關(guān)。選取糖蜜、玉米漿粉和吐溫80做進(jìn)一步優(yōu)化試驗(yàn)。
[0055]表1Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)因子水平
[0056]
【權(quán)利要求】
1.一株高抗逆性屎腸球菌及其培養(yǎng)方法和應(yīng)用，其特征在于所述的屎腸球菌(Enterococcus faecium)為 WE1-10，保藏標(biāo)號為 CGMCC N0.7746。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一株高抗逆性屎腸球菌及其培養(yǎng)方法和應(yīng)用，其特征在于所述的屎腸球菌WE1-10的培養(yǎng)方法，是將屎腸球菌(Enterococcus faecium) WE1-10CGMCCN0.7746接種到該菌的專用液體培養(yǎng)基中，30-40°C下靜置或不通氣培養(yǎng)。所述專用液體培養(yǎng)基的配方為:每1000mL水中含有:糖蜜10-30g，玉米漿粉20-40g，檸檬酸銨l_3g，三水合乙酸鈉2-8g，七水合硫酸鎂0.1-0.5g，一水合硫酸錳0.02-0.08g,三水合磷酸氫二鉀l_3g，吐溫 800.5-1.5g，pH 值為 8-8.5。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)方法，其特征在于:所述專用液體培養(yǎng)基的優(yōu)選配方為:每1000mL水中含有:糖蜜21.88g，玉米漿粉31.56g，檸檬酸銨2g，三水合乙酸鈉5g，七水合硫酸鎂0.2g，一水合硫酸錳0.05g,三水合磷酸氫二鉀2g，吐溫801.04g, pH值為8。
4.根據(jù)權(quán)利要求2-3所述培養(yǎng)方法，其特征在于:菌種接種比例為1%;培養(yǎng)溫度為370C ;靜置或不通氣培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為10-12h。
5.權(quán)利要求1所述的高抗逆性屎腸球菌及其培養(yǎng)方法和應(yīng)用，其特征在于:屎腸球菌WE1-10作為微生態(tài)制劑產(chǎn)品的制備方法，菌種經(jīng)一級種子搖瓶和50L發(fā)酵罐富集后的發(fā)酵液通過高速管式離心機(jī)收集，與保護(hù)劑混合均勻，先于-70°C預(yù)凍，然后置于真空冷凍干燥機(jī)中干燥后獲得活性菌粉，將菌粉用粉碎機(jī)破碎后與同樣粒度的麩皮混合，獲得微生態(tài)制劑產(chǎn)品。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于:所述高速管式離心機(jī)收集菌體的轉(zhuǎn)速為15000-20000rpm ;保護(hù)劑配方為:每1000mL水中含有:脫脂奶粉100g，谷氨酸鈉10g，海藻糖IOg,甘油30g。
7.根據(jù)權(quán)利要求5-6所述的制備方法，其特征在于:將保護(hù)劑與離心后的菌泥按照體積質(zhì)量比5: I混合均勻，于_70°C預(yù)凍2-3h，然后置于真空冷凍干燥機(jī)中真空凍干44h后結(jié)束，凍干參數(shù)如下:真空度小于30Pa，冷阱溫度為-40°C至_50°C。
8.權(quán)利要求1所述的高抗逆性屎腸球菌及其培養(yǎng)方法和應(yīng)用，其特征在于所述的屎腸球菌WE1-10作為微生態(tài)制劑產(chǎn)品在調(diào)節(jié)畜禽腸道微生態(tài)平衡中的應(yīng)用或在預(yù)防或輔助治療畜禽細(xì)菌性腹瀉中的應(yīng)用。
【文檔編號】A23K1/18GK103981117SQ201310719899
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2013年12月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月24日
【發(fā)明者】喬琳, 姚宏明, 高長斌, 劉蕊, 金忠輝 申請人:北京偉嘉人生物技術(shù)有限公司, 沈陽偉嘉牧業(yè)技術(shù)有限公司