專利名稱：一株屎腸球菌及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一株屎腸球菌及其應用。
背景技術(shù)：
飼料中添加抗生素對集約化畜牧業(yè)發(fā)展做出重大貢獻的同時，其產(chǎn)生的副作用如內(nèi)源性感染和二重感染、耐藥性的產(chǎn)生、腸道正常菌群的破壞和畜產(chǎn)品及環(huán)境中的殘留等對養(yǎng)殖業(yè)、動物以及人類食品安全帶來嚴重威脅。益生素就是以活的微生物為主，動物攝入一定量后，在胃腸道特定部位有一定數(shù)量的菌株能夠粘附、定植和生長，主要通過調(diào)節(jié)腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)和平衡，對動物生長和健康起到有益作用的制劑，是一種良好的的替代抗生素的新型綠色安全添加劑。屎腸球菌(Enterococcus Faecium)廣泛存在于自然界和畜禽胃腸道內(nèi)，是一種有益微生物，普通的屎腸球菌因其耐酸、耐高溫等特性較差，未能在飼料添加劑中廣泛應用。 因此，根據(jù)目前畜牧業(yè)的需求，篩選一株耐酸耐高溫具有益生特性的屎腸球菌具有廣闊的發(fā)展前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供屎腸球菌(Enterococcus Faecium)康80。本發(fā)明提供的該菌株，其保藏號為CGMCC No. 5058。本發(fā)明的另一個目的是提供一種動物飼料添加劑。上述的動物飼料添加劑，其活性成分為所述屎腸球菌(Enterococcus Faecium)康 80CGMCC No. 5058。含有上述動物飼料添加劑的動物飼料也是本發(fā)明保護的范圍。上述飼料添加劑或者動物飼料中，其中的動物具體為豬或雞。本發(fā)明的第三個目的是提供一種抑菌產(chǎn)品。本發(fā)明提供的抑菌產(chǎn)品，其活性成分為上述屎腸球菌(Enterococcus Faecium)康 80 CGMCC No. 5058。在上述的抑菌產(chǎn)品中，上述產(chǎn)品為藥物或菌劑；在上述的抑菌產(chǎn)品中，上述抑菌為抑制傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)和/或大腸桿菌(Escherichia Coli)，具體為抑制傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)、大腸桿菌 (Escherichia Coli)K88 和 / 或大腸桿菌(Escherichia Coli)0157。上述的屎腸球菌(Enterococcus Faecium)康80CGMCC No. 5058在制備動物飼料添加劑、動物飼料、抑菌產(chǎn)品和/或促進動物生長中的應用也是本發(fā)明保護的范圍。上述應用中，所述抑菌為抑制傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)和/或大腸桿菌(Escherichia Coli)，具體為抑制傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)、大腸桿菌 (Escherichia Coli)K88 和 / 或大腸桿菌(Escherichia Coli)0 157 ；所述促進動物生長體現(xiàn)在如下1)或2)
1)提高豬平均日增重、提高豬平均日采食量、提高豬皮毛指數(shù)、降低豬料肉比和/ 或降低豬腹瀉率；2)提高雞平均日增重和/或提高平均日采食量。本發(fā)明的第四個目的是提供一種動物飼料添加劑的制備方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟發(fā)酵上述屎腸球菌(Enterococcus Faecium)康80 CGMCC No. 5058，收集發(fā)酵產(chǎn)物，即得到動物飼料添加劑。在上述的動物飼料添加劑制備方法中，所述發(fā)酵的溫度為35°C _37°C，本發(fā)明的實施例中具體為37 °C ；在上述的動物飼料添加劑制備方法中，所述發(fā)酵時間為15h_80h，本發(fā)明的實施例中具體為20h ；在上述的動物飼料添加劑制備方法中，所述發(fā)酵的培養(yǎng)基為MRS培養(yǎng)基。在上述的動物飼料添加劑制備方法中，所述動物為豬或雞。本發(fā)明的第五個目的是提供一種抑菌產(chǎn)品的制備方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟發(fā)酵上述的屎腸球菌(Enterococcus Faecium)康80CGMCC No. 5058，收集發(fā)酵產(chǎn)物，即得到抑菌產(chǎn)品；在上述抑菌產(chǎn)品的制備方法中，所述發(fā)酵的溫度為35°C _37°C，本發(fā)明的實施例中具體為37°C ；在上述抑菌產(chǎn)品的制備方法中，所述發(fā)酵時間為15h_80h，本發(fā)明的實施例中具體為 20h ；在上述抑菌產(chǎn)品的制備方法中，所述發(fā)酵的培養(yǎng)基為MRS培養(yǎng)基；該培養(yǎng)基的pH 值為6-7，該培養(yǎng)基的pH值具體為7。在上述抑菌產(chǎn)品的制備方法中，所述產(chǎn)品為藥物或菌劑；在上述抑菌產(chǎn)品的制備方法中，上述抑菌為抑制傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)和/或大腸桿菌(Escherichia Coli)，具體為抑制傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)、大腸桿菌(Escherichia Coli)K88 和 / 或大腸桿菌(Escherichia Coli)0 157。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明通過分離、鑒定、篩選，得到屎腸球菌康80，其抗逆性強、抗雜菌能力強、具有益生特性，可以作為添加劑用于制備動物飼料，其中的動物包括但不限于豬、牛、羊、雞等各種動物。該飼料具有與抗生素飼料類似的功能，但無抗生素飼料的副作用。本發(fā)明的屎腸球菌主要作為動物飼料的添加劑，可替代現(xiàn)有動物日糧中的抗生素， 調(diào)節(jié)動物腸內(nèi)微生態(tài)平衡，從而具有增強非特異性免疫功能來預防疾病的作用，同時還可以提供營養(yǎng)因子、促進營養(yǎng)物的消化吸收、降低腹瀉、促進動物生長和提高飼料轉(zhuǎn)化率、提高斷奶仔豬以及生長育肥豬的生產(chǎn)性能。本發(fā)明的屎腸球菌對防治動物消化系統(tǒng)疾病起到保健作用，同時對幼年動物可刺激其胃腸道發(fā)育，所以將之作為飼料添加劑應用在飼料中能起到抗病促生長的作用。同時， 本發(fā)明的屎腸球菌無耐藥性和藥物在動物產(chǎn)品中殘留，不會對人類的健康產(chǎn)生潛在的危害，是一種有前途的綠色飼料添加劑。上述提到的菌株康80于2011年7月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJia 北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為CGMCC No. 5058，其分類命名為屎腸球菌(Enterococcus Faecium)。


圖1為屎腸球菌(Enterococcus Faecium)康80的生長曲線圖2為飼料樣品中乳酸菌16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實施例中所用的培養(yǎng)基配方如下1、MRS肉湯培養(yǎng)基蛋白胨10g，牛肉粉5g，葡萄糖20g，吐溫80 1ml，磷酸氫二鉀2g，乙酸鈉5g，檸檬酸三氨2g，七水硫酸鎂0. 2g，四水硫酸錳0. 05g,酵母粉4g，用蒸餾水定容至1L。2、MRS瓊脂培養(yǎng)基IL MRS肉湯培養(yǎng)基中加瓊脂15g。3、麥康凱培養(yǎng)基月示胨3g，豬膽鹽5g，中性紅0. 025g，蛋白胨17g，乳糖10g，結(jié)晶紫0. OOlg，氯化鈉5g，瓊脂15g，用蒸餾水定容至1L。4、Ml7 培養(yǎng)基大豆蛋白胨5. Og,酵母提取物5. Og,酪蛋白胨5g，抗壞血酸0. 5g，牛肉浸膏2. 5g， β -甘油磷酸二鈉19g，MgS04 · 7H20 0. 25g，瓊脂15g，用蒸餾水定容至IL0實施例1、屎腸球菌(Enterococcus Faecium)康80的分離及鑒定本發(fā)明的屎腸球菌是從飼料樣品中提取、分離、篩選、純化得到的。
(一)屎腸球菌康80 (NFER-5)的分離與純化1. 1菌株的分離培養(yǎng)取Ig健康斷奶仔豬糞便于裝有9mL無菌生理鹽水的試管中，漩渦器震蕩混勻，即為1 10稀釋液，再取稀釋液進行十倍遞增稀釋，然后選擇3個適宜梯度的稀釋液各ImL涂布于含有IOppm放線菌酮的MRS瓊脂培養(yǎng)基及M17瓊脂培養(yǎng)基，37°C厭氧培養(yǎng)48 72h，觀察并記錄菌落形態(tài)，挑取長勢良好的特征單菌落于MRS液體培養(yǎng)基中，進行劃線分離純化。 觀察肉湯是否變渾濁，有渾濁的放置4°C冰箱貯藏備用。1.2革蘭氏染色用無菌注射器吸取少量MRS肉湯培養(yǎng)物，滴在載玻片上，在酒精燈火焰上輕輕烘干固定。滴加結(jié)晶紫染色液，染lmin，水洗；滴加革蘭氏碘液媒染，作用lmin，水洗；滴加丙酮乙醇混合液(丙酮95%乙醇=3 7)脫色30s，水洗；滴加沙黃染色液復染ImindK 洗，待干，在普通光學顯微鏡上觀察，菌體呈紅色為陰性，紫色的為陽性。呈革蘭氏陽性形態(tài)一致的桿菌，進一步進行接觸酶試驗。1. 3接觸酶試驗做MRS斜面培養(yǎng)基，取培養(yǎng)物約0. 2mL注入裝有MRS瓊脂培養(yǎng)基斜面，5 % C02培養(yǎng)箱，37°C培養(yǎng)Mh，長出菌落后，將3%過氧化氫溶液滴加到菌落上，若沒有氣泡產(chǎn)生說明是陰性，若有氣泡產(chǎn)生說明是陽性。通過MRS培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)的培養(yǎng)物經(jīng)革蘭氏染色陽性和接觸酶試驗陰性可初步認為是乳酸菌屬(Lactobacillus)。3份飼料樣品經(jīng)分離純化，結(jié)合革蘭氏染色和接觸酶試驗，共分離出5株乳酸菌， 其中桿菌3株，球菌2株，并分別命名為NFER-1、NFER-2、NFER-3、NFER-4、NFER-5。( 二 )、抗逆性選育與生物學特性研究1. 1耐熱性能選育將上述篩選的 5 株待測菌 NFER-I、NFER-2、NFER-3、NFER-4、NFER-5 株按 2 % (ν/ ν)的接種量接種到MRS液體培養(yǎng)基中，分別于60°C、70°C、80°C水浴鍋內(nèi)處理IOmin后測定其活菌數(shù)，37°C恒溫培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果，比較其在各溫度下處理前與處理后的活菌數(shù)。存活率的計算公式為S 熱=Vn0;S熱為分別經(jīng)過60°C、70°C、8(rC處理后的屎腸球菌存活率；Iitl為加熱處理前每毫升活菌數(shù)；叫為加熱處理IOmin后每毫升活菌數(shù)。結(jié)果如表1所示，從表1中可以看出，NFER-2，NFER-4，NFER-5在70°C熱處理IOmin 后還有一定活菌數(shù)，且NFER-5濃度高達1. 72X 105,且NFER-5在80°C處理IOmin后仍有較高活菌數(shù)，濃度為1. OOX 104。而NFER-l，NFER-3在70°C處理IOmin之后無活菌，證明該兩株菌株不耐熱。一般仔豬飼料的制粒溫度為70°C 85°C之間，耐高溫之后存活率低也是乳酸菌作為飼料添加劑的主要限制性因素之一。從耐熱存活率看，本試驗選育的發(fā)酵乳酸桿菌可以耐受制粒時的高溫，作為飼料添加劑將會有較好的前途。選取NFER-2，NFER-4，NFER-5 進行下一步篩選。表1耐熱試驗結(jié)果
菌株Oh60 "CIOmin70 "C IOmin800C IOminNFER-I9.60χIO67.30XlO500NFER-21.95χIO76.50XlO51.70χIO30NFER-33.60χIO51.70XlO200NFER-45.30χIO67.70:XlO55.IOxIO20NFER-59.40χIO61.68XlO61.72χIO51.OOxlO41. 2耐酸性能選育將上述試驗中耐熱性較好的菌株NFER-2，NFER-4, NFER-5按2% (ν/ν)的接種量接種到PH值為3. 0的MRS液體培養(yǎng)基中，分別在Oh、lh,2h,3h采用平板傾注法測定其活菌數(shù)，37°C恒溫培養(yǎng)24h觀察結(jié)果，記錄其活菌數(shù)，計算各菌株的存活率。存活率的計算公式為S 酸=nx/n0Sig為經(jīng)過pH3. 0處理后不同時間的屎腸球菌存活率；Iitl為pH3. 0處理前每毫升活菌數(shù);nx為ρΗ3· 0處理0h、lh、2h、3h后每毫升活菌數(shù)。通過pH3.0處理后的各菌株存活率見表2。從表中可以看出只有NFER-5表現(xiàn)出較強的耐受性，池處理后存活率仍達到80%，這個存活率對于其耐過胃酸的抑制作用或殺滅作用應是較為理想的，但NFER-2和NFER-4此條件下受到強烈的抑制。于是選取NFER-5進行下一步試驗。 表2不同時間耐酸試驗結(jié)果
權(quán)利要求
1.屎腸球菌(EnterococcusFaecium)康 80，其保藏號為 CGMCC No. 5058。
2.一種動物飼料添加劑，其活性成分為權(quán)利要求1所述屎腸球菌(Enterococcus Faecium)康 80CGMCC No. 5058。
3.含有權(quán)利要求2所述的動物飼料添加劑的動物飼料。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的動物飼料添加劑或權(quán)利要求3所述的動物飼料，其特征在于 所述動物為豬或雞。
5.一種抑菌產(chǎn)品，其活性成分為權(quán)利要求1所述屎腸球菌(Enterococcus Faecium)康 80CGMCC No. 5058。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的抑菌產(chǎn)品，其特征在于所述產(chǎn)品為藥物或菌劑；所述抑菌為抑制傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)和/或大腸桿菌(Escherichia Coli)ο
7.權(quán)利要求1所述的屎腸球菌(EnterococcusFaecium)康80CGMCC No. 5058在制備動物飼料添加劑、動物飼料、抑菌產(chǎn)品和/或促進動物生長中的應用；所述抑菌具體為抑制傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)和/或大腸桿菌 (Escherichia Coli)0
8.一種制備動物飼料添加劑的方法，包括如下步驟發(fā)酵權(quán)利要求1所述的屎腸球菌(Enterococcus Faecium)康80CGMCC No. 5058，收集發(fā)酵產(chǎn)物，即得到動物飼料添加劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵的溫度為35°C _37°C，所述發(fā)酵的溫度具體為37°C ；所述發(fā)酵時間為15h-80h，所述發(fā)酵時間具體為20h ；所述發(fā)酵的培養(yǎng)基為MRS培養(yǎng)基。
10.一種抑菌產(chǎn)品的制備方法，包括如下步驟 發(fā)酵權(quán)利要求1所述的屎腸球菌(Enterococcus Faecium)康80CGMCC No. 5058，收集發(fā)酵產(chǎn)物，即得到抑菌產(chǎn)品；所述發(fā)酵的溫度為35°C _37°C，所述發(fā)酵的溫度具體為37°C ；所述發(fā)酵時間為15h-80h，所述發(fā)酵時間具體為20h ；所述發(fā)酵的培養(yǎng)基為MRS培養(yǎng)基；所述產(chǎn)品為藥物或菌劑；所述抑菌為抑制傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)和/或大腸桿菌(Escherichia Coli)ο
全文摘要
本發(fā)明公開了一株屎腸球菌及其應用。本發(fā)明提供的菌株屎腸球菌為EnterococcusFaecium康80，其保藏號為CGMCC No.5058。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明通過分離、鑒定、篩選，得到屎腸球菌康80，其抗逆性強、抗雜菌能力強、具有益生特性，可以作為添加劑用于制備動物飼料，其中的動物包括但不限于豬、牛、羊、雞等各種動物。該飼料具有與抗生素飼料類似的功能，但無抗生素飼料的副作用。
文檔編號A61K35/74GK102373172SQ20111034395
公開日2012年3月14日 申請日期2011年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月3日
發(fā)明者丁修良, 宋青龍, 王煒宏, 譙仕彥 申請人:北京龍科方舟生物工程技術(shù)中心