一種以幼花為外植體組培繁殖多倍體毛泡桐的方法
【專利摘要】本發明提出了一種以幼花為外植體組培繁殖多倍體毛泡桐的方法，它包括：a.幼花的選擇；b.幼花的前處理和消毒；c.幼花愈傷組織誘導；d.愈傷組織分化培養；e.芽苗分化出根；f.組培苗的移栽；g.組培植株的觀察鑒定。本發明突出幼花為外植體具有再生能力強、可在冬季至早春進行多倍體組培繁殖的優勢，解決了多倍體毛泡桐根段繁殖率低和葉片組培繁殖分化苗頻率不高的問題，能夠較大規模繁殖多倍體毛泡桐，并利用形態學和細胞學技術確定組培后代的多倍體真實性和一致性。
【專利說明】一種以幼花為外植體組培繁殖多倍體毛泡桐的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種以幼花為外植體進行組織培養繁殖多倍體毛泡桐的方法，屬于現代林業的林木新品種選育【技術領域】。
【背景技術】
[0002]泡桐是優良速生樹種，花大早開，觀賞價值高。但長期以來泡桐靠根段繁殖，這種長期根繁容易感染“叢枝病”，影響林材質量，失去觀賞價值。特別是 申請人:利用專利技術200810048497.9 (離體培養和秋水仙素處理結合選育多倍體毛泡桐的方法)選育出多倍體毛泡桐新品系，具有葉片變厚，葉形變圓，花變大的優良特性(湖北省科技成果“克隆和多倍體技術結合選育泡桐新品種”，2011年湖北省科技進步二等獎)。但是多倍體毛泡桐原原種植株少，且植株已長到開花年齡，用根段繁殖不僅嚴重損傷原原種植株，而且繁殖效率低。本發明涉及的是一種以幼花為外植體進行組織培養而擴大繁殖多倍體毛泡桐的技術，可以克服根段繁殖的困難和大量繁殖多倍體毛泡桐。

【發明內容】

[0003]本發明的目的是建立以幼花為外植體，通過組織培養大量繁殖多倍體毛泡桐的技術。
[0004]本發明的技術方案為:a.幼花的選擇；b.幼花的前處理和消毒；c.幼花愈傷組織誘導；d.愈傷組織分化培養；e.芽苗分化出根；f.組培苗的移栽；g.組培植株的觀察鑒定。
[0005]本發明的具 體過程:
a.幼花的選擇
該發明采用的組織培養材料是新近選育的多倍體毛泡桐品系，它與一般二倍體毛泡桐品系在形態結構和染色體組成上是不同的。它在第一年的11月上旬至次年的4月初進行花芽發育生長。本發明應用的組織培養外植體是毛泡桐的幼花。采摘時間為12月上旬至次年的3月下旬。選擇的多倍體毛泡桐的幼花需飽滿、呈黃褐色小紡錘形、無病蟲害。
[0006]b.幼花的前處理和消毒
將著生幼花的多倍體毛泡桐花枝采回，插入裝有35°C~40°C熱水的水瓶中，外罩塑料袋，并放在25°C~28°C的組培室內處理3天~4天，以促動幼花的發育；熱水處理完后，采摘下幼花放置在超凈工作臺上，用解剖刀沿著幼花表面切割去除幼花的黃褐色花萼；然后將幼花進行一般消毒處理，無菌水沖洗3次后，將幼花縱橫切開，切成0.5 cm長的小塊。
[0007]d.幼花愈傷組織誘導
將切開的多倍體毛泡桐幼花小塊接種到幼花愈傷組織誘導培養基中，置于黑暗，25 °C~26 °C條件下培養，25天~30天幼花小塊切口處產生談黃色愈傷組織，其后逐漸長大長多。所述愈傷組織誘導 培養基配方為:MS+8.0 mg/L~16.0 mg/L 6BA+0.3 mg/L~0.9mg/L NAA+3% 蔗糖 +0.75% 瓊脂，ρΗ5.8 ~6.0。
[0008]d.愈傷組織分化培養挑出直徑達I Cm以上生長旺盛的愈傷組織，將它們接種到多倍體毛泡桐愈傷組織分化培養基中置于25°C~26°C，2000 Lx~2500 Lx，光照10-11 h/d。30天~45天后愈傷組織由淡黃變乳黃色，松緊中等，后逐漸顯現綠點而分化出小芽，并逐漸長高長粗壯。愈傷組織分化培養基配方為:MS+6_BA 3.0mg/L ~5.0 mg/L + IBA 1.0mg/L ~2.0 mg/L +2% 鹿糖 +0.75% 瓊脂，ρΗ5.8 ~6.0。
[0009]e.芽苗分化出根
當芽苗生長粗壯，達到2.5cm~5.0cm高時，將它們連帶小塊愈傷組織一起或從基部切斷轉接到生根培養基中，大約15~25天，芽苗基部分化出根。生根培養基配方:1/2MS+IBA 2.5mg/L ~3.0mg/L + 0.01% 活性炭 +2% 蔗糖 +0.75% 瓊脂，ρΗ5.8 ~6.0。
[0010]f.組培苗的移栽
當組培苗生長旺盛、健壯，苗高達到8.0 cm~15.0 cm時，將它們連同培養瓶一起轉入18°C~20°C室內，光照2000 Lx，煉苗3天，然后打開瓶蓋，加入無菌水5 mL，再放置2天，將組培苗移出瓶，用自來水徹底洗滌，最后在加有1.0%~1.5%高錳酸鉀液中浸5 min，最后移栽到由細砂土、蛭石和泥炭土 (按3:4:3)比例組成，并滅菌的基質中，用1/10MS培養基澆足定根水后，上罩塑料膜，保持相對濕度80%~90%，溫23°C~25°C，光照1000 Lx~1500Lx, 24 h,此后按一般試管苗方法管理。
[0011]g.組培植株的觀察鑒定
隨著組培苗在移植基質中生長，多倍體毛泡桐將不斷變粗壯并長高。此時，觀察組培苗是否表現一致，是否表現出多倍體毛泡桐的葉片形狀(多倍體毛泡桐葉片厚實，為近圓形)和邊緣缺刻(比二倍體變小)；并觀察葉片的下表皮氣孔密度和氣孔大小，以確定組培苗為多倍體毛泡桐的真實克隆品系。
[0012]本發明通過采用幼花為外植體進行多倍體毛泡桐新品系的組織培養繁殖。建立起成熟的組織培養克隆技術和多倍體形態、細胞觀察的鑒定技術，為大量繁殖多倍體毛泡桐提供了技術支持。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1多倍體毛泡桐愈傷組織分化出組培苗。
[0014]圖2多倍體毛泡桐植株。
【具體實施方式】
[0015]下面以實施例多倍體大花毛泡桐I號的組培繁殖對本發明進一步說明。
[0016]a.幼花的選擇
采用新近選育的多倍體大花毛泡桐I號品系為材料，在2012年12月上旬采摘花枝，花枝上著生飽滿黃褐色紡錘形的幼花。
[0017]b.幼花的前處理和消毒
將采回的花枝插入裝有35°C~40°C熱水的花瓶中，外罩塑料袋，放在26°C~27°C的組培室內處理4天。采摘下幼花，在超凈工作臺上用解剖刀切割去除幼花的黃褐色花萼；然后將幼花放入0.1%升汞處理18 min,無菌水沖洗3次后，將幼花縱橫切開，切成0.5 cm見方的小塊。[0018]c.幼花愈傷組織誘導
將處理好的幼花小塊接種到MS+6-BA 12.0 mg/L + NAA0.6mg/L +3%蔗糖+0.75%瓊脂，PH6.0的幼花愈傷組織誘導培養基中，置于黑暗，25°C~26°C條件下培養；25天~30天幼花小塊切口處產生黃色愈傷組織，隨后逐漸長大長多。
[0019]d.愈傷組織分化培養
當愈傷組織旺盛生長達直徑I Cm以上時，挑出愈傷組織轉接到MS+6-BA3.0mg/L +IBA2.0mg/L +2%蔗糖+0.75%瓊脂，pH6.0的愈傷組織分化培養基中，在25°C~26°C，2000Lx光照10 h/d，黑暗14 h/d條件下培養；30天~45天后愈傷組織由淡黃變成乳黃色，松緊中等，隨后呈現綠點而分化出芽。
[0020]e.芽苗分化出根
當芽苗生長粗壯，達到3.5cm左右高時，將它們連同小塊愈傷組織轉接到生根培養基中，20天左右，芽苗基部分化出根。生根培養基配方為:1/2MS+ IBA 2.5mg/L +0.01%活性炭 +2% 蔗糖 +0.75% 瓊脂，pH6.0。
[0021]f.組培苗的移栽
當組培苗旺盛生長，苗高到達10 Cm左右時，將它們連同培養瓶轉入18°C~20°C室內，光照2000 LX，煉苗3天，然后打開瓶蓋加入無菌水5 mL，再放置2天后，將組培苗移出瓶，用自來水徹底洗滌，最后再加有1.0%~1.5%高錳酸鉀溶液中浸5 min，最后移栽到由細砂土、蛭石和泥炭土(3:4:3)組成并滅菌的基質中，用1/10MS培養基澆足定根水后，上罩塑料膜，保持相對濕度80%~90%，溫度23 °C~25 °C，光照1000 LX~1500 LX，24h，此后按一般試管苗方法管理，直至長成一年生種苗。
[0022]g.組培植株的的觀察鑒定 組培苗經過在移植基質中的生長，多倍體大花毛泡桐I號將不斷變粗壯并長高，按I個月、2個月、4個月、6個月、8個月，每隔2個月觀察一次，看組培苗是否表現一致，看它們的葉片形狀是否為近圓形厚葉的多倍體特征，并采葉片下表皮進行顯微觀察，看氣孔是否變大、氣孔密度是否變小，確定這些組培苗確實為多倍體大花毛泡桐I號的真實克隆品系。
【權利要求】
1.一種以幼花為外植體組培繁殖多倍體毛泡桐的方法，其特征在于培育過程為: a.幼花的選擇 組織培養的材料是新近選育的多倍體毛泡桐品系，其與一般二倍體毛泡桐品系在形態結構和染色體組成上是不同的，它在11月到次年4月初進行花朵發育，應用的外植體是多倍體毛泡桐的幼花，選擇的多倍體毛泡桐的幼花需飽滿、呈黃褐色小紡錘形，無病蟲害； b.幼花的前處理和消毒 將著生幼花的多倍體無毛泡桐花枝采回，插入裝有35 °C到40 °C熱水的水瓶中，外罩塑料袋并放在25 °C到28 1:的組培室內處理3到4天，以促動幼花發育，熱水處理后，采摘下幼花放置在超凈工作臺上，用解剖刀沿著幼花表面切割去除幼花的黃褐色花萼，然后將幼花進行一般消毒處理，無菌水沖洗3次后，將幼花縱橫切開，切成0.5 cm的小塊； c.幼花愈傷組織誘導 將多倍體毛泡桐幼花小塊接種到幼花愈傷組織誘導培養基中，置于黑暗、25 V~28V條件下培養，25天~30天幼花小塊切口處產生淡黃色愈傷組織，所述愈傷組織誘導培養基配方為:MS+8.0 mg/L~16.0 mg/L 6BA+0.3 mg/L~0.9 mg/L NAA+3%蔗糖+0.75%瓊月旨，pH5.8 ~6.0 ; d.愈傷組織分化培養 挑出直徑達I cm以上生長旺盛的愈傷組織，將它們接種到多倍體毛泡桐愈傷細胞分化培養基中，置于25 °C~26 °C, 2000 Lx~2500 Lx，光照10 hr-11 hr，黑暗14 h~13h ；30天~45天后愈傷細胞由淡黃變 為乳黃色，松緊中等，后逐漸顯現綠色小點而分化出小芽，并逐漸長高長粗壯，愈傷組織分化培養基配方為:MS+6-BA 3.0mg/L~5.0 mg/L + IBA1.0mg/L ~2.0 mg/L +2% 蔗糖 +0.75% 瓊脂，ρΗ5.8 ~6.0 ; e.芽苗分化出根 當芽苗生長粗壯，達2.5 cm~5.0 cm高時，將它們連帶小塊愈傷組織一起或從基部切斷轉接到生根培養基中，約15天~25天，芽苗基部分化出根，生根培養基的配方為:1/2MS+IBA 2.5mg/L ~3.0mg/L + 0.01% 活性炭 +2% 蔗糖 +0.75% 瓊脂，ρΗ5.8 ~6.0 ; f.組織苗的移栽 當組培苗生長旺盛健壯，苗高達到8.0 cm~15.0 cm時，將它們連同培養瓶轉入18°C~20 °C室內，光照2000 Lx，煉苗3天，然后打開瓶蓋加入無菌水5 mL，再放置2天后，將組培苗移出瓶，用自 來水徹底洗滌，最后在加有1.0%~1.5%高錳酸鉀液中浸5 min，最后移栽到由細砂土、蛭石和泥炭土組成并滅菌的基質中，用1/10MS培養基澆足定根水后，上罩塑料膜，保持相對濕度80%~90%，溫度23 °C~25 °C，光照1000 Lx~1500 Lx, 24 h，此后按一般試管苗方法管理； g.組培植株的觀察鑒定 隨著組織苗在移植基質中生長，多倍體毛泡桐將不斷變粗壯長高，此時，觀察組培苗是否表現一致，是否表現出多倍體毛泡桐的葉片形狀(多倍體毛泡桐葉片厚實，為近圓形)和邊緣缺刻(比二倍體變小)，并觀察葉片的下表皮氣孔密度和氣孔大小，以確是組培苗為多倍體毛泡桐的真實克隆品系。
【文檔編號】A01H4/00GK103704140SQ201310747508
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年12月31日 優先權日:2013年12月31日
【發明者】蔡得田, 宋兆建, 王維, 張獻華, 何玉池, 劉育華 申請人:湖北大學, 武漢多倍體生物科技有限公司