專利名稱：一種適用于多倍體黃芩優良品種規模化生產的技術流程的制作方法
技術領域：
本發明涉及四倍體黃芩優良品種的創制、試管苗快速繁殖、原種苗扦插及種苗大田種植等技術環節構成的特有規模化生產流程，屬于生物技術育種領域。
背景技術：
黃芩(Scutellariae baicalensis, Georgi)是我國特有的中藥材大品種之一，主產于我國華北地區，河北省承德地區為黃芩地道產區，質量最好。黃芩根可入藥，主要有效成分為黃芩甙，具有抗菌、抗病毒、抗真菌、解熱、降壓和抗癌作用。70%的中成藥都含有黃芩；黃芩根提取物黃芩素、黃芩甙作為制藥原料，黃芩酊劑可治療動脈硬化性高血壓及神經性機能障礙，也可消除高血壓引起的頭痛、失眠、胸悶等癥；近年，黃芩葉片被開發成具有醫療保健功能的茶葉，具有較高的經濟開發價值。因此，目前黃芩的應用和開發越來越受到國內外的關注，需求量也隨之急劇增加。黃芩是我國三級瀕危保護中藥材品種。目前黃芩的繁殖以種子繁殖為主，但藥農引種時存在著盲目性，有的種子從藥材市場采購，有的自產自用，有的直接采自野生黃芩的種子，種源混亂，藥材質量、化學成分含量不穩定，導致黃芩的產量和質量差異較大。因此，迫切需要篩選出有效成分含量高、產量高的優良品種。植物多倍體中含有較多的染色體組數，往往在體型上表現出巨大性和高抗逆境能力。多倍體植物在品質和生物量上都較二倍體優越。因此，植物多倍體在生產上有著重要意義，通過人工誘導多倍體是現代育種工作的一個重要手段。但其帶來的育性降低的不利影響又成為制約多倍體育種成功的巨大障礙，因此，在確定一項多倍體生產計劃時，需充分考慮規模化繁育生產的制種問題及生產成本。

發明內容
本發明的目的是提供一種適用于四倍體黃芩規模化生產的成套技術流程，解決四倍體黃芩規模化生產的制種難、生產成本高等問題，以獲得品質優良的黃芩中藥材。本發明的技術方案如下一種適用于四倍體黃芩優良品種規模化生產的技術流程，其特征在于經過下列步驟1.待黃芩愈傷組織表面分化出綠色芽點時，在超凈工作臺內將愈傷組織切成直徑 0. 5cm的小塊，將愈傷組織塊用含有2%二甲基亞砜(DMSO)的0. 2%秋水仙素水溶液浸泡處理12-16小時，處理后用無菌水沖洗3次，接種到培養基中培養，使其分化成苗。2.切取秋水仙素誘導30-40天左右的嫩芽葉片1-2片，進行細胞流式分析，并對試管苗根尖進行染色體顯微鑒定，對3次以上均鑒定為四倍體的株系進行繁殖。3.選取長勢茁壯的四倍體黃芩小苗轉入生根培養基中生根，培養15-20天后取出煉苗3-4天，栽入苗床，保濕，約一個半月后苗床小苗的根系均發育良好，帶土移出，移栽于試驗田中，生長二年，觀察四倍體及二倍體黃芩地上部分的農藝性狀，于第二年6月黃芩生長穩定期測定植株高度、葉片大小；花期結束后定時檢查各株系育性并作記錄，黃芩成熟期收獲后測定根長、寬、鮮重、干重及黃芩苷含量，篩選出綜合性狀優良的株系KT優選。
4.對篩選得到的綜合性狀優良的株系KT優選進行快速組培擴繁，繁殖系數為 4 (擴繁系數是指經過20天培養，每株組培苗可以擴繁成4株克隆苗)，每代時間為20天左右，選取長勢茁壯的黃芩小苗轉入生根培養基中生根，培養15-20天后取出煉苗3 4天， 栽入苗床，保濕，移栽成活后獲得原種苗，原種苗成活率90%以上。5.原種苗生長3個月后，利用莖段扦插技術進行制種，選取半木質化的枝條按照 7-8厘米剪斷，扦插于扦插床上，繁殖系數為15-20，扦插成活率90 %以上，成活后獲得種
田ο6.第二年5月中下旬將種苗從扦插床移栽到大田種植，每畝地種植5000株左右，當年收獲葉片和根，每畝可生產黃芩茶40-50公斤，根350-450公斤，黃芩苷含量達 13. 50-16. 56%，遠高于藥典不少于8. 0%的要求，黃芩品質優良。本發明與現有技術相比具有以下優點本發明采用多倍體育種技術，對黃芩愈傷組織采用秋水仙堿處理誘導，不僅誘導率高，而且誘導得到的四倍體黃芩粗壯；對誘導后的黃芩進行多倍體鑒定，采用細胞流式分析與顯微鏡檢相結合，且重復三次以上，鑒定結果穩定可信；對黃芩四倍體的篩選不僅考察農藝性狀，還考察黃芩的質量、產量，篩選出綜合性狀優良的黃芩品種，該品種生長茂盛，體型巨大，產量高，且有效成分黃芩苷含量非常高；對篩選得到的綜合性狀優良的四倍體黃芩采用組培擴繁技術，在短時間內穩定并擴繁了四倍體黃芩植株，獲得了高質量的原種苗；本發明還采用莖段扦插技術，扦插成活率90%以上， 繁殖系數為10-15，降低了來源于組織培養克隆的試管苗四倍體種植生產成本，使篩選得到的綜合性狀優良的黃芩四倍體KT優選適合推廣和應用；按本發明方法每畝可生產優質黃芩茶40-50公斤，黃芩根250-300公斤，黃芩苷含量高達13. 50-16. 56%。本發明篩選獲得的優良四倍體黃芩品種的示范推廣和規范化種植必將大幅度地提高我國中藥材的質量和產量，而且通過該品種的成功種植，可帶動一系列中藥材多倍體優良品種的培育和標準化種植，實現中藥材良性可持續發展。


圖1為二倍體黃芩和四倍體黃芩的細胞染色體鏡檢對比圖。圖2為二倍體黃芩與四倍體黃芩的細胞流式分析結果對比圖。圖3為四倍體黃芩KT優選的試管苗。圖4為在苗床生長3個月后的四倍體黃芩KT優選。
圖5為二倍體黃芩與四倍體黃芩中黃芩苷高效液相色譜結果比較圖。
具體實施例方式實施例1四倍體黃芩的誘導待黃芩愈傷組織表面分化出綠色芽點時，在超凈工作臺內將愈傷組織切成直徑 0. 5cm的小塊，將愈傷組織塊用含有2%二甲基亞砜(DMSO)的0. 2%秋水仙素水溶液浸泡處理12-16小時，處理后用無菌水沖洗3次，接種到培養基中培養，使其分化成苗，誘導率可達 40.0%，培養基配方如下MS基本培養液，蔗糖30g/L，瓊脂3. 2g/L，6_芐基氨基嘌呤(6-BA) 0. 5mg/L,矮壯素 (PP333) 0 . 5mg/L。
實施例2四倍體黃芩的鑒定-染色體顯微鏡檢將實施例1處理得到的各株系在培養基上誘導生根，切取剛萌發的試管苗根 0. 5cm左右，在蒸餾水中漂洗干凈，放入0. 秋水仙素溶液中20°C下處理30min，取出后用蒸餾水洗3次，再放入卡諾氏液中冰箱固定池，然后依次用95%乙醇、70%乙醇、蒸餾水各洗3次，用IM鹽酸于60°C下離析5min，蒸餾水洗3次并在蒸餾水中低滲30min。鏡檢時小心切取根尖，置載玻片中央，加改良苯酚品紅染液1滴，30min后蓋上蓋玻片并輕敲輕壓至根尖壓成一薄層，用顯微鏡進行觀察，二倍體與四倍體黃芩結果見附圖1，其中培養基配方為1/2MS基本培養液，蔗糖30g/L,瓊脂3. 2g/L，萘乙酸(NAA) 0. lmg/L,矮壯素 (PP333)O. 5mg/L實施例3四倍體鑒定-細胞流式分析切取黃芩嫩芽葉片1-2片，加入Iml冰冷緩沖液I于培養皿，用鋒利的刀片切碎， 40 μ m細胞過濾器過濾，收集濾液，放置冰上，500rpm離心5min，用PI染液對細胞核DNA進行熒光標記，放置冰上，避光，用流體細胞儀進行植株倍性鑒定，上樣后流式細胞儀自動形成代表該樣品倍性的DNA含量分布圖。二倍體黃芩與四倍體黃芩細胞流式分析結果見附圖2緩沖液I :45mmol/LMgCl2，30mmol/L 檸檬酸三鈉，20mmol/LM0PS，0. 1 % TritonX-100, PH7. 0。PI 染液50 μ g/ml PI，50 μ g/mlRnase 的緩沖液 I。實施例4四倍體黃芩的篩選根據實施例2、實施例3鑒定結果，選取長勢茁壯的四倍體黃芩小苗轉入生根培養基中生根，培養15-20天后取出煉苗3 4天，栽入苗床，每天定時噴水2小時，保濕，約一個半月后苗床小苗的根系均發育良好，帶土移出，按20cmX 30cm行距移栽于試驗田中，生長二年，觀察四倍體及二倍體黃芩地上部分的農藝性狀，于第二年6月黃芩生長穩定期測定植株高度、葉片大小；花期結束后定時檢查各株系育性并作記錄，黃芩成熟期收獲后測定根長、寬、鮮重、干重及黃芩苷含量，篩選出綜合性狀優良的株系KT優選。KT優選、對照CK 綜合性狀比較詳見表1、表2，生根培養基配方如下MS基本培養液，蔗糖30g/L，瓊脂3. 2g/L，萘乙酸NAAO. 2mg/L表1 二年生黃芩KT優選株系、對照CK地上部分農藝性狀的對比(n = 5)
權利要求
1.一種規模化生產多倍體中藥材的方法，其特征是先用秋水仙素進行多倍體的誘導，通過流式細胞儀和染色體顯微鏡分析挑選出多倍體進行繁殖，繁殖獲得的小苗通過組培擴繁獲得原種苗，將原種苗經莖段扦插技術進行制種獲得種苗，再移至大田進行規模化生產。
2.權利要求1所述的方法，包括其在多倍體黃芩的規模化生產中的應用，其具體技術流程如下(a)多倍體黃芩的誘導將表面分化出綠色芽點的黃芩愈傷組織用秋水仙素水溶液進行處理，處理后用無菌水沖洗，接種到培養基中培養，使其分化成苗；(b)流式細胞儀分析和染色體顯微鏡檢核切取秋水仙素誘導的嫩芽葉片1-2片，進行細胞流式分析，并對試管苗根尖進行染色體顯微鑒定，挑取多倍體株系進行繁殖；(c)多倍體黃芩的篩選選取多倍體黃芩小苗轉入生根培養基中生根，培養15-20天后取出煉苗3-4天，栽入苗床，保濕，約一個半月后苗床小苗的根系均發育良好，帶土移出， 移栽于試驗田中，生長二年，篩選綜合性狀優良的多倍體黃芩株系；(d)組培、扦插和大田繁殖將性狀優良的黃芩株系通過快速組培擴繁獲得原種苗，原種苗經莖段扦插技術進行制種，獲得種苗，將種苗移栽至大田，進行規模化生產。
3.權利要求2所述的方法，其中所述的秋水仙素水溶液濃度為0.2%，其中含有m的二甲基亞砜，秋水仙素的誘導率為40%。
4.權利要求2所述的方法，其中所述的快速組培是以四倍體黃芩采用組織培養克隆技術進行試管苗快速繁殖，其繁殖系數為4，每代時間為20天左右，試管苗移栽成活后獲得原種苗。
5.權利要求2所述的方法，其中所述的莖段扦插是將原種苗以莖段扦插方式進行繁殖，每株原種苗枝條按照7-8厘米剪斷，扦插于扦插床上，扦插成活率90%以上，繁殖系數為 10-15，成活后獲得種苗。
6.權利要求2所述的方法，其中所述的大田繁殖是將種苗從扦插床移栽至大田種植， 每畝地種植5000株左右，收獲葉片和根，每畝可生產黃芩茶40-50公斤，根350-450公斤， 黃芩苷含量為13. 5%以上。
7.權利要求2所述的方法，其中所述的多倍體黃芩為四倍體黃芩。
8.權利要求2或7所述的方法，其中所述的四倍體黃芩的特征是四倍體株高是對照的1. 84倍，葉片長度是對照的1. 50倍，葉片寬度是對照的2. 14倍，根單株產量為二倍體對照的1. 70倍，黃芩苷含量比對照高1. 86個百分點，大田種植能夠正常開花，全生長期比對照長25-30天，育性表現為不育。
9.一種多倍體黃芩產品，由權利要求2-7所述的方法獲得。
10.權利要求9所述的黃芩產品，其特征是黃芩苷含量為13.5%以上。
11.權利要求9或10所述的黃芩產品，其特征是其黃芩葉片在開發成有醫療保健功能的茶葉中的應用。
12.權利要求9或10所述的黃芩產品，其特征是從其黃芩根中提取的黃芩素、黃芩甙、 黃芩酊劑等在制藥中的應用。
全文摘要
本發明提供一種規模化生產四倍體黃芩的技術流程，它以黃芩為育種材料，借助植物多倍體育種技術、組培快繁技術、莖段扦插技術，快速獲得性狀優良一致的四倍體黃芩種苗，本發明獲得的四倍體黃芩株系KT優選，株高是對照的1.84倍，葉片長度是對照的1.50倍，葉片寬度是對照的2.14倍，單株產量高，根單株產量為二倍體對照的1.70倍，黃芩苷含量比對照高1.86個百分點，育性表現為不育，全生長期比對照長25-30天，對其應用組培擴繁技術繁殖獲得原種苗，再將原種苗經莖段扦插技術進行制種獲得種苗，移栽到大田種植，每畝地種植5000株左右，當年收獲葉片和根，每畝可生產黃芩茶40-50公斤，根350-450公斤，黃芩苷含量達13.50-16.56％，遠高于藥典不少于8.0％的要求，黃芩品質優良。
文檔編號A01H4/00GK102511387SQ201110340890
公開日2012年6月27日 申請日期2011年11月2日 優先權日2010年11月4日
發明者劉敬梅, 周驊, 謝瑩, 高春春 申請人:北京未名凱拓農業生物技術有限公司