云南微球菌及微生物菌劑和它們的應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種云南微球菌，其保藏編號為CGMCC?NO.8836。本發明還提供了一種微生物菌劑，該微生物菌劑含有菌體和培養基，所述菌體包括保藏編號為CGMCC?NO.8836的云南微球菌。本發明還提供了如上所述的云南微球菌和如上所述的微生物菌劑在提高植物在高鹽條件下的抗病性中的應用。通過上述技術方案，本發明可以更加有效地提高植物在高鹽條件下的抗病性。
【專利說明】云南微球菌及微生物菌劑和它們的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及農業生物【技術領域】，具體地，涉及一種云南微球菌、一種微生物菌劑和它們的應用。
【背景技術】
[0002]草坪是用多年生矮小草本植株密植，由人工建植或人工養護管理，起綠化美化作用的草地。它是一個國家、一個城市文明程度的標志之一。它一般設置在屋前、廣場、空地和建筑物周圍，供觀賞、游憩或作運動場地之用。草坪按用途分為:游憩草坪、觀賞草坪、運動場草坪、交通安全草坪和保土護坡草坪。
[0003]草坪草是草坪的基本組成和功能單位，一般具有密生的特性，通常需配合修剪以保持表面平整。目前世界各地使用的草坪草有100多種，這些植物被人類選擇出來，經過培育形成現代草坪植物的許多品種。用于城市和園林中草坪的草本植物主要有結縷草、野牛草、狗牙根草、地毯草、鈍葉草、假儉草、黑麥草、早熟禾、剪股穎等。[0004]為了滿足綠化和景觀的需要，在培育和養護草坪的過程中，往往不可避免地要在鹽堿地的高鹽環境下種植草坪草，但草坪草在高鹽條件下抗病性較差，難以抵御腐腐霉枯萎病、鐮刀菌枯萎病、紅絲病、銹病、雪腐病和霜霉病等病害。

【發明內容】

[0005]本發明的發明人分離了一株云南微球菌，發現其具有優異的提高植物在高鹽條件下的抗病性的效果，由此得到了本發明。為了克服現有的微生物菌株促進植物在高鹽條件下生長的效果仍然較差的缺陷，本發明提供了一種云南微球菌，該云南微球菌(Micrococcus yunnanensis)的保藏編號為 CGMCC N0.8836。
[0006]本發明還提供了一種微生物菌劑,該微生物菌劑含有菌體和培養基，所述菌體包括保藏編號為CGMCC N0.8836的云南微球菌。
[0007]本發明還提供了如上所述的云南微球菌和如上所述的微生物菌劑在提高植物在高鹽條件下的抗病性中的應用。
[0008]通過上述技術方案，本發明可以更加有效地促進植物在高鹽條件下的生長。
[0009]本發明的其他特征和優點將在隨后的【具體實施方式】部分予以詳細說明。
[0010]生物材料保藏
[0011]本發明的云南微球菌(Micrococcus yunnanensis)是本發明的發明人從天津靜海地區玉米地表層土壤樣本中分離的純培養物，其保藏編號為CGMCC N0.8836，保藏日期為2014年2月21日，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址位于北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所，分類命名為云南微球菌(Micrococcus yunnanensis)。
【具體實施方式】[0012]以下對本發明的【具體實施方式】進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的【具體實施方式】僅用于說明和解釋本發明，并不用于限制本發明。
[0013]本發明提供了一種云南微球菌,該云南微球菌(Micrococcus yunnanensis)的保藏編號為 CGMCC N0.8836。
[0014]本發明還提供了一種微生物菌劑，該微生物菌劑含有菌體和培養基，所述菌體包括保藏編號為CGMCC N0.8836的云南微球菌。
[0015]其中，所述微生物菌劑中含有的菌體的量可以在很大范圍內改變，例如每克所述微生物菌劑中，保藏編號為CGMCC N0.8836的云南微球菌的活菌數可以為(5-200) X IO7CFU,優選情況下，每克所述微生物菌劑中，保藏編號為CGMCC N0.8836的云南微球菌的活菌數可以為(8-150) X 107CFU。
[0016]根據本發明，所述培養基的種類可以在很大范圍內改變，可以為各種能夠用于培養云南微球菌的培養基，例如，可以將牛肉膏蛋白胨培養基、肉湯培養基、LB培養基等常用培養基作為種子培養基，用于菌種的保存；而發酵的培養基一般用于生產，這些培養基的種類也為本領域技術人員所公知。上述培養基能夠商購得到或者根據“微生物培養基手冊”(Microbiology Culture Media Manual)的記載制備得到。例如，種子培養基可以為牛肉膏蛋白胨培養基，其含有l_3g/L的牛肉膏、5-15g/L的蛋白胨、3-8g/L的氯化鈉、15-20g/L的瓊脂。例如發酵培養基可以含有:40-150g/L的豆粉、40-150g/L的淀粉、0.5_8g/L的氯化鈉、0.5-5g/L 的碳酸鈣、2-10g/L的磷酸二氫鉀和l-10g/L的硫酸亞鐵。
[0017]其中，上述各種培養基可以按照常規的滅菌方法進行滅菌后備用，例如在115-125°C和1.5-2個標準大氣壓的條件下滅菌10_30分鐘。
[0018]其中，為了方便所述微生物菌劑的貯藏和使用，所述微生物菌劑可以制成固體顆粒劑，優選地，所述微生物菌劑還含有惰性固體載體和粘結劑；所述惰性固體載體包括粘土、二氧化硅、硅藻土、高嶺土、凹凸棒土、蒙脫土、膨潤土、滑石粉、白碳黑和碳酸鈣中的至少一種；所述粘結劑包括麥芽糖和/或糊精。
[0019]其中，所述微生物菌劑的制備方法可以包括:將CGMCC N0.8836的云南微球菌接種于發酵培養基中進行培養。優選情況下，通過培養使得到的每克所述微生物菌劑中，保藏編號為CGMCC N0.8836的云南微球菌的活菌數可以為(1_50) X IO7CFU,更優選為(2-20) X 107CFU。其中，培養的溫度可以為28-35°C，培養的時間可以為10-50小時。
[0020]優選地，所述微生物菌劑的制備方法還可以包括:將在發酵培養基中進行培養后得到的物料與惰性固體載體和粘結劑混合；所述惰性固體載體包括粘土、二氧化硅、硅藻土、高嶺土、凹凸棒土、蒙脫土、膨潤土、滑石粉、白碳黑和碳酸鈣中的至少一種；所述粘結劑包括麥芽糖和/或糊精。優選地，惰性固體載體和粘結劑的用量使得所述微生物菌劑中，惰性固體載體的含量為30-90重量％ ;所述粘結劑的含量為5-20重量％。其中，混合后的物料可以進一步干燥制粒為顆粒劑。
[0021]本發明還提供了如上所述的云南微球菌和如上所述的微生物菌劑在提高植物在高鹽條件下的抗病性中的應用。
[0022]其中，通過向鹽堿地中施用如上所述的云南微球菌和如上所述的微生物菌劑，能夠有效地增加在鹽堿地中生長的植物的抗病性。
[0023]其中，特別優選地，本發明的如上所述的云南微球菌和如上所述的微生物菌劑對包括早熟禾(Poa annua L.)、高羊茅(Festuca elata Keng ex E.Alexeev)、黑麥草(Loliumperenne L.)、匍匍剪股穎(Agrostis matsumurae Hack, ex Honda)和白三葉(Trrifoliumrepens L.)中的至少一種的植物(可用作草坪草)具有優異的提高在高鹽條件下的抗病性的效果。更優選地，本發明的如上所述的云南微球菌和如上所述的微生物菌劑針對上述植物的腐霉枯萎病、鐮刀菌枯萎病、紅絲病、銹病、雪腐病和霜霉病中的至少一種病害，能夠在高鹽條件下的抗病性。
[0024]以下通過實施例進一步詳細說明本發明:
[0025]實施例1
[0026]本實施例用于說明本發明的云南微球菌的培養及微生物菌劑的制備。
[0027]將保藏編號為CGMCC N0.8836的云南微球菌(Micrococcus yunnanensis)接種到LB培養基(含10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母提取物和10g/L的NaCl)中，在30°C和150轉/分振蕩下培養至菌密度0D_值為0.6-0.8，得到種子菌液。
[0028]將IOOmL上述種子菌液加入IOOL發酵培養基中(發酵培養基含有80g/L的豆粉、80g/L的淀粉、3g/L的氯化鈉、3g/L的碳酸鈣、5g/L的磷酸二氫鉀和5g/L的硫酸亞鐵)，在30°C下培養，在培養過程中進行取樣并通過顯微鏡直接計數法進行觀察，直至每克培養液中的云南微球菌的活菌數為IO9CFU,所得到的培養液即為本實施例的微生物菌劑。
[0029]實施例2
[0030]本實施例用于說明本發明的云南微球菌的培養及微生物菌劑的制備。 [0031]將保藏編號為CGMCC N0.8836的云南微球菌(Micrococcus yunnanensis)接種到LB培養基(含10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母提取物和10g/L的NaCl)中，在30°C和150轉/分振蕩下培養至菌密度0D_值為0.6-0.8，得到種子菌液。
[0032]將IOOmL上述種子菌液加入IOOL發酵培養基中(發酵培養基含有80g/L的豆粉、80g/L的淀粉、3g/L的氯化鈉、3g/L的碳酸鈣、5g/L的磷酸二氫鉀和5g/L的硫酸亞鐵)，在30°C下培養，在培養過程中進行取樣并通過顯微鏡直接計數法進行觀察，直至每克培養液中的云南微球菌的活菌數為IO9CFU,在所得到的培養液(實測含水約65重量％ )中加入硅藻土和粘結劑(糊精)，相對于每升的培養液，加入的硅藻土為500g，粘結劑為140g，然后將混合物在造粒機上過16目篩造粒，再用60°C的熱空氣烘干，實時測定水份含量，直至水份含量為4重量％左右，即得到本實施例的微生物菌劑，測得該微生物菌劑中，活菌數為5X108CFU/g。
[0033]實施例3
[0034]按照實施例1的方法制備微生物菌劑，不同的是，所用的發酵培養基為含有60g/L的豆粉、100g/L的淀粉、2g/L的氯化鈉、4g/L的碳酸鈣、3g/L的磷酸二氫鉀和3g/L的硫酸亞鐵的培養基。
[0035]對比例I
[0036]將購自ATCC的商品號為ATCC? 7468?的云南微球菌(Micrococcusyunnanensis)接種到LB培養基(含10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母提取物和10g/L的NaCl)中，在30°C和150轉/分振蕩下培養至菌密度0D_值為0.6-0.8，得到種子菌液。
[0037]將IOOmL上述種子菌液加入IOOL發酵培養基中(發酵培養基含有80g/L的豆粉、80g/L的淀粉、3g/L的氯化鈉、3g/L的碳酸鈣、5g/L的磷酸二氫鉀和5g/L的硫酸亞鐵)，在30°C下培養，在培養過程中進行取樣并通過顯微鏡直接計數法進行觀察，直至每克培養液中的云南微球菌的活菌數為IO9CFU,所得到的培養液即為本對比例的微生物菌劑。
[0038]測試實施例1
[0039]本測試實施例中，在實驗室環境測試實施例1-3和對比例I的微生物菌劑對腐霉枯萎病的抑制作用。
[0040]從出現腐霉枯萎病的早熟禾(Poa annua L.)草坪中,拔取患病的草坪草剪碎浸泡于10倍重量的清水中，即獲得腐霉枯萎病的感病病原液。
[0041]在山東省萊州市土山鎮選取早熟禾(Poa annua L.)草坪作為測試種植區，該測試種植區的土壤的含鹽量為0.5重量％。在播種后20天后的不同種植區內施用實施例1-3和對比例I的微生物菌劑作為實驗組，其中，實施例1和3和對比例I的微生物菌劑施用量為0.2kg/m2，實施例2的微生物菌劑施用量為0.4kg/m2。并且使用空白的發酵培養基作為空白對照組。施用微生物菌劑2天后，每平方米噴灑IOOmL上述腐霉枯萎病的感病病原液。30天后，統計草坪草的相對成活比(即實驗組成活株數除以空白對照組成活株數)、相對株高(即實驗組平均株高除以空白對照組平均株高)和相對地上生物量(即實驗組平均地上鮮重除以空白對照組平均地上鮮重)，結果見表1。
[0042]表1
[0043]
【權利要求】
1.一種云南微球菌，其特征在于:該云南微球菌(Micrococcus yunnanensis)的保藏編號為 CGMCC N0.8836。
2.一種微生物菌劑，該微生物菌劑含有菌體和培養基，其特征在于:所述菌體包括保藏編號為CGMCC N0.8836的云南微球菌。
3.根據權利要求2所述的微生物菌劑，其特征在于:每克所述微生物菌劑中，保藏編號為CGMCC N0.8836的云南微球菌的活菌數為(5-200) X 107CFU。
4.根據權利要求2或3所述的微生物菌劑，其特征在于:所述培養基包括牛肉膏蛋白胨培養基、肉湯培養基和LB培養基中的至少一種。
5.根據權利要求2或3所述的維生素菌劑，其特征在于:所述培養基含有40-150g/L的豆粉、40-150g/L的淀粉、0.5-8g/L的氯化鈉、0.5_5g/L的碳酸鈣、2_10g/L的磷酸二氫鉀和1-10g/L的硫酸亞鐵。
6.根據權利要求2或3所述的微生物菌劑，其特征在于:所述微生物菌劑還含有惰性固體載體和粘結劑；所述惰性固體載體包括粘土、二氧化硅、硅藻土、高嶺土、凹凸棒土、蒙脫土、膨潤土、滑石粉、白碳黑和碳酸鈣中的至少一種；所述粘結劑包括麥芽糖和/或糊精。
7.根據權利要求6所述的微生物菌劑，其特征在于:所述微生物菌劑中，惰性固體載體的含量為30-90重量％ ;所述粘結劑的含量為5-20重量％。
8.權利要求1所述的云南微球菌和權利要求2-7中任意一項所述的微生物菌劑在提高植物在高鹽條件下的抗病性中的應用。
9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于:所述植物包括早熟禾(Poaannua L.)、高羊茅(Festuca elata Keng ex Ε.Alexeev)、黑麥草(Lolium perenne L.)、匍匍剪股穎(Agrostis matsumurae Hack, ex Honda)和白三葉(Trrifolium repens L.)中的至少一種。
10.根據權利要求9所述的應用，其特征在于:所述抗病性所針對的病害包括腐腐霉枯萎病、鐮刀菌枯萎病、紅絲病、銹病、雪腐病和霜霉病中的至少一種。
【文檔編號】A01N63/02GK103952351SQ201410167816
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年4月24日 優先權日:2014年4月24日
【發明者】趙君才, 阮志勇, 趙秉強, 劉艷偉, 趙文勇, 呂昭輝, 劉慧 , 宋昭, 王彥偉, 劉小飛 申請人:煙臺海上傳奇生物科技有限公司