環狀芽孢桿菌及微生物菌劑和它們的應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種環狀芽孢桿菌，其保藏編號為CGMCC?NO.8910。本發明還提供了一種微生物菌劑，該微生物菌劑含有菌體和培養基，所述菌體包括保藏編號為CGMCC?NO.8910的環狀芽孢桿菌。本發明還提供了如上所述的環狀芽孢桿菌和如上所述的微生物菌劑在防治農作物的病害中的應用。通過上述技術方案，本發明可以更加有效地防治番茄灰霉病等農作物的病害。
【專利說明】環狀芽孢桿菌及微生物菌劑和它們的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及農業生物【技術領域】，具體地，涉及一種環狀芽孢桿菌、一種微生物菌劑和它們的應用。
【背景技術】
[0002]番爺灰霉病是番爺上危害較重且常見的病害,各菜區都發生。除危害番爺外，還可危害茄子、辣椒、黃瓜、瓠瓜等20多種作物。低溫、連續陰雨天氣多的年份危害嚴重。發病嚴重時造成莖葉枯死和大量的爛花、爛果，直接影響產量。遭受番茄灰霉病侵染的番茄一般減產20%-30%,有時減產高達50%左右，嚴重時甚至造成番茄絕產。番茄灰霉病病原為半知菌亞門的葡萄孢菌。病菌主要以菌核(寒冷地區)或菌絲體及分孢梗(溫暖地區)隨病殘體遺落在土中越夏或越冬，條件適宜時，萌發菌絲，產生分生孢子，借氣流、雨水和人們生產活動進行傳播。分生孢子依靠氣流傳播，從寄主傷口或衰老器官侵入致病。病菌為弱寄生菌，可在有機物上營腐生生活。
[0003]目前，番茄灰霉病的防治主要采用化學藥劑法，化學藥劑例如聚砹嘧霉胺、氯溴異氰尿酸、丙環唑、惡霜菌酯、多菌靈、速克靈、撲海因、甲基嘧菌胺、菌核凈、嘧菌酯、百菌清、甲基托布津和噻菌靈等。生物防治法也有望應用于番茄灰霉病的防治，其相比化學藥劑法具有低殘留等優點，但是目前生物防治法所用的微生物菌株的防治效果仍然不高。

【發明內容】
[0004]為了克服現有的微生物菌株防治番茄灰霉病的效果較差的缺陷，本發明提供了一種環狀芽孢桿菌，該環狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)的保藏編號為CGMCC N0.8910。
[0005]本發明還提供了一種微生物菌劑，該微生物菌劑含有菌體和培養基，所述菌體包括保藏編號為CGMCC N0.8910的環狀芽孢桿菌。
[0006]本發明還提供了如上所述的環狀芽孢桿菌和如上所述的微生物菌劑在防治農作物的病害中的應用。
[0007]通過上述技術方案，本發明可以更加有效地防治番茄灰霉病等農作物的病害。
[0008]本發明的其他特征和優點將在隨后的【具體實施方式】部分予以詳細說明。
[0009]生物材料保藏
[0010]本發明的環狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)是本發明的發明人從四川瀘州白酒生產廠的下層窖泥樣品中分離的純培養物，其保藏編號為CGMCC N0.8910，保藏日期為2014年3月12日，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址位于北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所，分類命名為環狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)。
【具體實施方式】
[0011]以下對本發明的【具體實施方式】進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的【具體實施方式】僅用于說明和解釋本發明，并不用于限制本發明。
[0012]本發明提供了一種環狀芽孢桿菌，該環狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)的保藏編號為 CGMCC N0.8910。
[0013]本發明還提供了一種微生物菌劑，該微生物菌劑含有菌體和培養基，所述菌體包括保藏編號為CGMCC N0.8910的環狀芽孢桿菌。
[0014]其中，所述微生物菌劑中含有的菌體的量可以在很大范圍內改變，例如每克所述微生物菌劑中，保藏編號為CGMCC N0.8910的環狀芽孢桿菌的活菌數可以為(2-200) X IO7CFU,優選情況下，每克所述微生物菌劑中，保藏編號為CGMCC N0.8910的環狀芽孢桿菌的活菌數可以為(20-120) X 107CFU。
[0015]根據本發明，所述培養基的種類可以在很大范圍內改變，可以將各種能夠用于培養環狀芽孢桿菌的培養基，例如，可以為牛肉膏蛋白胨培養基、肉湯培養基、LB培養基等常用培養基作為種子培養基，用于菌種的保存；而發酵的培養基一般用于生產，這些培養基的種類也為本領域技術人員所公知。上述培養基能夠商購得到或者根據“微生物培養基手冊”(Microbiology Culture Media Manual)的記載制備得到。例如，種子培養基可以為牛肉膏蛋白胨培養基，其含有I_3g/L的牛肉膏、5-15g/L的蛋白胨、3-8g/L的氯化鈉、15-20g/L的瓊脂。例如發酵培養基可以含有:3-7g/L的淀粉、0.5-2g/L的蔗糖、0.5_2g/L的碳酸鈣、l-3g/L的硫酸銨、0.5-2g/L的磷酸二氫鉀和0.3-0.8g/L的氯化鎂。又例如，所述發酵培養基可以含有 :10-40g/L的蔗糖、l-5g/L的豆餅粉、l-4g/L的硫酸銨、0.1-0.3g/L的酵母粉、0.5-lg/L的磷酸氫二銨、0.01-0.lg/L的氯化鎂和0.05-0.2g/L的氯化鈉。
[0016]其中，上述各種培養基可以按照常規的滅菌方法進行滅菌后備用，例如在115-125°C和1.5-2個標準大氣壓的條件下滅菌10_30分鐘。
[0017]其中，所述微生物菌劑的制備方法可以包括:將CGMCC N0.8910的環狀芽孢桿菌接種于發酵培養基中進行培養。優選情況下，通過培養使得到的每克所述微生物菌劑中，保藏編號為CGMCC N0.8910的環狀芽孢桿菌的活菌數可以為(1_50) X IO7CFU,更優選為(2-20) X 107CFU。其中，培養的溫度可以為30-35°C，培養的時間可以為24-48小時。
[0018]本發明還提供了如上所述的環狀芽孢桿菌和如上所述的微生物菌劑在防治農作物的病害中的應用。
[0019]特別優選地,所述農作物的病害包括由灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)引發的灰霉病。例如，所述灰霉病包括番茄灰霉病、黃瓜灰霉病、葡萄灰霉病、草莓灰霉病、苣荬菜灰霉病、爺子灰霉病、辣椒灰霉病、桃灰霉病和甜瓜灰霉病中的至少一種。
[0020]以下通過實施例進一步詳細說明本發明:
[0021]實施例1
[0022]本實施例用于說明本發明的環狀芽孢桿菌的培養及微生物菌劑的制備。
[0023]將保藏編號為CGMCC N0.8910的環狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)接種到LB培養基(含10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母提取物和10g/L的NaCl)中，在30°C和180轉/分振蕩下培養至菌密度0D_值為0.6-0.8，得到種子菌液。
[0024]將IOOmL上述種子菌液加入100L發酵培養基中(發酵培養基含有30g/L的蔗糖、3g/L的豆餅粉、2g/L的硫酸銨、0.2g/L的酵母粉、0.8g/L的磷酸氫二銨、0.08g/L的氯化鎂和0.lg/L的氯化鈉)，在30°C下培養，在培養過程中進行取樣并通過顯微鏡直接計數法進行觀察，直至每克培養液中的環狀芽孢桿菌的活菌數為IO8CFU,所得到的培養液即為本實施例的微生物菌劑。
[0025]實施例2
[0026]按照實施例1的方法制備微生物菌劑，不同的是，所用的發酵培養基為含有5g/L的淀粉、lg/L的蔗糖、lg/L的碳酸鈣、2g/L的硫酸銨、lg/L的磷酸二氫鉀和0.5g/L的氯化鎂的培養基。
[0027]對比例I
[0028]將購自中國農業微生物菌種保藏管理中心(ACCC)的商品號為11078的環狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)接種到LB培養基(含10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母提取物和10g/L的NaCl)中，在30°C和180轉/分振蕩下培養至菌密度OD600值為0.6-0.8，得到種子菌液。
[0029]將IOOmL上述種子菌液加入100L發酵培養基中(發酵培養基含有30g/L的蔗糖、3g/L的豆餅粉、2g/L的硫酸銨、0.2g/L的酵母粉、0.8g/L的磷酸氫二銨、0.08g/L的氯化鎂和0.lg/L的氯化鈉)，在30°C下培養，在培養過程中進行取樣并通過顯微鏡直接計數法進行觀察，直至每克培養液中的環狀芽孢桿菌的活菌數為IO8CFU,所得到的培養液即為本對比例的微生物菌劑。
[0030]測試實施例1
[0031]本測試實施例中，在實驗室環境測試實施例1、2和對比例I的微生物菌劑對購自中國農業微生物菌種保藏管理中心(ACCC)的灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)的抑制作用。灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)是多種作物的灰霉病的病原菌,其中，商品號為ACCC36037的灰葡萄孢菌是番茄灰霉病的致病菌；商品號為ACCC36041的灰葡萄孢菌是黃瓜灰霉病的致病菌；商品號為ACCC36044的灰葡萄孢菌是苣荬菜灰霉病的致病菌；商品號為ACCC36047的灰葡萄孢菌是茄子灰霉病的致病菌；商品號為ACCC36056的灰葡萄孢菌是辣椒灰霉病的致病菌；商品號為ACCC36058的灰葡萄孢菌是桃灰霉病的致病菌；商品號為ACCC36055的灰葡萄孢菌是甜瓜灰霉病的致病菌。將上述7種灰葡萄孢菌在馬鈴薯液體培養基(20g馬鈴薯去皮，切成塊加水，煮沸30min，用紗布過濾，濾液加2g葡萄糖，補足水至lOOmL，滅菌后得到)中分別培養至對數期，然后分別涂布在馬鈴薯平板培養基平板(20g馬鈴薯去皮，切成塊加水，煮沸30min,用紗布過濾,濾液加2g葡萄糖和2g瓊脂糖,補足水至IOOmL,滅菌后倒平板得到)上，然后在平板上挖取直徑Icm的孔，將實施例1、2和對比例I的微生物菌劑分別加入孔中，28°C下培養4天后，測定抑菌圈的直徑，結果如表1所示。
[0032]表1
[0033]
【權利要求】
1.一種環狀芽孢桿菌，其特征在于:該環狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)的保藏編號為 CGMCC N0.8910。
2.一種微生物菌劑，該微生物菌劑含有菌體和培養基，其特征在于:所述菌體包括保藏編號為CGMCC N0.8910的環狀芽孢桿菌。
3.根據權利要求2所述的微生物菌劑，其特征在于:每克所述微生物菌劑中，保藏編號為CGMCC N0.8910的環狀芽孢桿菌的活菌數為(2-200) X 107CFU。
4.根據權利要求2或3所述的微生物菌劑，其特征在于:所述培養基包括牛肉膏蛋白胨培養基、肉湯培養基和LB培養基中的至少一種。
5.根據權利要求2或3所述的維生素菌劑，其特征在于:所述培養基含有3-7g/L的淀粉、0.5-2g/L的蔗糖、0.5-2g/L的碳酸鈣、l_3g/L的硫酸銨、0.5_2g/L的磷酸二氫鉀和0.3-0.8g/L的氯化鎂。
6.根據權利要求2或3所述的維生素菌劑，其特征在于:所述培養基含有10-40g/L的蔗糖、l-5g/L的豆餅粉、l_4g/L的硫酸銨、0.1-0.3g/L的酵母粉、0.5-lg/L的磷酸氫二銨、0.01-0.lg/L的氯化鎂和0.05-0.2g/L的氯化鈉。
7.權利要求1所述的環狀芽孢桿菌和權利要求2-6中任意一項所述的微生物菌劑在防治農作物的病害中的應用。
8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于:所述農作物的病害包括由灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)引發的灰霉病。
9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于:所述灰霉病包括番爺灰霉病、黃瓜灰霉病、葡萄灰霉病、草莓灰霉病、苣荬菜灰霉病、爺子灰霉病、辣椒灰霉病、桃灰霉病和甜瓜灰霉病中的至少一種。
【文檔編號】A01N63/00GK103952352SQ201410168116
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年4月24日 優先權日:2014年4月24日
【發明者】趙君才, 阮志勇, 趙秉強, 王慧敏, 趙文勇, 呂昭輝, 劉慧 , 宋昭, 王彥偉, 劉小飛 申請人:煙臺海上傳奇生物科技有限公司