專利名稱：一種微生物菌劑及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種微生物菌劑及其應用，屬微生物農藥技術領域。 技術背景植物寄生線蟲是作物上普遍發生的病害之一，危害幾乎所有作物。僅根結線蟲 (Meloidogyne spp.)每年在全球造成的損失就高達數百億美元。由于生產上缺乏抗性品 種，農作物復種指數高，化學殺線劑的使用受到限制，以及現代農業可持續發展的需要，生 物防治植物線蟲日益受到重視。殺線蟲微生物中包括細菌和真菌，利用細菌對線蟲的誘導作用，把線蟲吸引到真 菌周圍，再利用真菌的獨特刺細胞結構擊倒線蟲，輔以細菌的酶解作用，達到殺死線蟲的目 的。這種多重作用的聯合在線蟲的生物防治中具有潛在和實際的應用價值。

發明內容
本發明的目的在于提供一種微生物菌劑及其應用。本發明從殺線蟲微生物中篩選尋找具有工業化生產前景的菌株，為農業生產提供 一種具較好的防治線蟲的生防制劑。本發明具體是這樣實現的本發明人在前期研究中，篩選獲得了具有良好殺線蟲功能的擔子菌球蓋菇 2052(Stropharia sp. 2052)禾口芽孢桿菌 B16 (Bacillus nematocidus)。B16 菌株已于 2004年4月5日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. 1128。2052菌株已于2009年11月5日保存于中國微生物菌種保藏委員會普通微生物 中心，保藏號CGMCC No. 3399。食線蟲芽孢桿菌隸屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)，為好氧菌，G+，細胞長 2. 0-3. 5 ii m，寬0. 8-1. 2 u m0在LB平板上生長速度較快，在LB培養基上培養72小時以上 可見極少數的內生孢子形成或釋放到胞外的芽孢，5天后菌體幾乎全生成芽孢。芽孢為長柱 形，亞端生。菌株的主要形態特征為長桿狀，個體較大，兩端鈍圓，多以分散形式存在。在 LB平板上菌落呈圓形，表面粗糙無光澤，類似細小粉末狀，菌苔白色。球蓋菇(Stropharia)隸屬于擔子菌亞門、層菌綱、傘菌目、球蓋菇科。其主要形態 特征為有著紫褐色至煙褐色的孢子，常見于樹林、草地、堆肥、動物糞便等場所。子實體中 等至較大，菌蓋直徑60 160 (200)mm,扁半球形、半球形至扁平，葡萄酒紅褐色，逐漸轉為 赭褐色或乳酪色，有時黃乳酪色并有酒紅色細絲分布其間。菌蓋幼時錐形至鐘形，成熟時鐘 形至平展，平滑或有纖毛狀鱗片，濕潤時稍粘，初期有菌幕殘片，后變光滑，邊緣銳，常向內 卷曲。菌褶初期略帶煙色，后著色變深，灰藍色至紫黑色，近生和貼生，密，較寬，不等長，邊 緣略白。菌柄白色，有時略黃，較厚，70 150X15 30mm，圓柱形，基部略膨大，實心。菌 環較厚，白色。菌柄在菌環以下部位光滑、無鱗。菌肉白色，較厚。有青草香味。孢子印紫 褐色，孢子橢圓至卵形，厚壁，9. 5 12 X 7 9 ii m，有芽孔。單生或群生于樹林和草地等生 境。幾乎所有球蓋菇屬真菌的純培養都能夠產生附屬結構刺細胞，該結構被認為是該屬真
3菌分類的一個重要特征。芽孢桿菌(Bacillus)是從大量土壤細菌中篩選出來的具有殺線蟲活性的菌株。 通過對菌株進行篩選和改良后，獲得了穩定的菌株B16。該菌易于培養，性狀穩定，適合于規 模化生產。球蓋菇(Stropharia)原始菌株生長緩慢。我們從土壤中分離到不同菌株，其中大 部份不具備我們所需的“明顯穩定的防治效果，綜合性狀好，易于規模化生產”的特性。通 過對菌株進行篩選和改良后，獲得了穩定的菌株2052。它不但對根結線蟲(Meloidogyne spp.)具有良好的防治效果，同時具備了工業化生產的基本性狀。本發明將球蓋菇2052通過固體培養，獲得包括菌絲和菌絲附屬結構的菌體培養 物，再復合細菌B16的液體培養物制作成固體粒劑，穴施使用。本發明的微生物菌劑經如下步驟得到a.選擇微生物菌株球蓋菇2052(Stropharia sp. 2052)和芽孢桿菌B16 (Bacillus nematocidus)，按常規方法制備成2052固體培養物和B16的菌懸液(CFU = 2X108)，按質 量比11的比例混合得到混合物；b.按質量比加入上述混合物質量的30-40%的硅藻土，硅藻土粒徑為4. 5-5mm，按 常規方法制成固體菌劑。本發明的微生物菌劑作為用于防治植物線蟲的應用。本方法制作的生防制劑能與其他的殺線蟲農藥、植物生長調節劑混合使用，但必 須保證所混合藥劑對本發明采用的芽孢桿菌和球蓋菇無副作用。本發明的線蟲生防制劑一般在作物播種或移栽時施用。方法是播種時與種子共同 施入土壤中，移栽時將本制劑施入作物根際周圍。對線蟲發生嚴重地區可在作物生長過程 中追施一次，方法是將本制劑施入作物根際周圍。本發明與現有的殺植物寄生線蟲藥相比，具有高效、低毒以及無殘留的優點。
具體實施例方式本發明化合物的發酵生產方法(常規方法)1、將2052菌株的菌絲體接種到試管固體培養基斜面上，培養基配方為PDA培養 基，20-30°C下培養4-8天，獲得試管種。2、將B16菌株接種到試管固體培養基斜面上，培養基配方為LB培養基，35_38°C下 培養1-2天，獲得試管種。3、將培養好的2052固體種子接入固體培養基中，培養基的配方為70_80%小麥 粒、10-20%葡萄糖，5-10%碳酸鈣，22-28°C培養25-35天。4、將培養好的B16固體種子接入液體LB培養基中，培35_38°C培養1_2天，配制成 CFU = 2X108的菌懸液。5、將培養好的2052固體培養物和B16的菌懸液(CFU = 2 X 108)，按1 1的比例 混合，加入4. 5-5mm的硅藻土 30-40%，制成固體菌劑使用。本發明制劑對根結線蟲的防效試驗1、南方根結線蟲(Meloidogyne incognita)的培養統計將溫室培養的帶有南方根結線蟲的番茄根用無菌水洗凈，解剖針挑取根結線蟲的卵囊置于0. 4M的KC1溶液中，在5ml離心管中依次用4ml無菌水(三次)、lml無菌青-鏈 霉素雙抗溶液、3ml 0. 1 %的NaCIO溶液洗滌和消毒，每一步驟均通過短暫離心(8000轉30 秒)除去上清液。洗滌好的蟲卵置于0.4M的ZnCl2溶液中孵化48小時，二齡幼蟲用移液 器收集于1. 5ml離心管，通過短暫離心(5000轉30秒)富集計數。2、防效試驗方法(1)試驗所用藥劑及處理A、固體菌劑10-20%，在作物移栽時一次性施于作物根際；B、陽性對照，0. 5%阿維菌素按37. 5kg/hm2處理；C、空白對照，不加菌劑或藥劑處理。(2)試驗方法在直徑為15cm的盆缽加入500g 土樣(病土 沙土 腐殖土 = 1:1: 1)，做以 上幾個處理。每個處理5盆且3次重復，置于25-28°C的溫室中培養。移栽后每隔3天澆 水，使其正常生長。菌劑處理后30、60天分別調查各處理組作物根部的根結數、根際的蟲卵 數，計算菌劑對根結線蟲病的防治效果。實施例1 用菌劑防治番茄根結線蟲病試驗移栽1月齡番茄(4-6葉)，番茄品種為改良毛粉802，山東農業科技開發公司生 產。每盆施用50g菌劑，按上述試驗方法進行防效試驗。列表所示為防效數據。表1菌劑對番茄根結線蟲病的防治效果(60d) 結果表明，該菌劑對番茄根結線蟲病具有顯著的防治作用。實施例2 :不同菌劑的防效比較實施例2方法同實施例1，不同之處為施用2052菌劑為每盆50g，施用B16菌劑 為每盆100mL。表2菌劑的增效作用 結果表明，本發明菌劑比單獨施用2052菌劑防效提高10. 7%，比單獨施用B16菌 劑防效提高7.3%。
權利要求
一種微生物菌劑，其特征在于微生物菌劑包括菌株球蓋菇2052(Stropharia sp.2052)、芽孢桿菌B16(Bacillus nematocidus)和硅藻土三種物質。
2.權利要求1所述的微生物菌劑，其特征在于微生物菌劑經如下步驟得到a.選擇微生物菌株球蓋菇2052(Strophariasp. 2052)和芽孢桿菌B16 (Bacillus nematocidus)，按常規方法分別制備成2052固體培養物和B16的CFU = 2 X IO8的菌懸液， 再按質量比11的比例混合得到混合物；b.按質量比加入上述混合物質量的30-40%的硅藻土，硅藻土粒徑為4.5-5mm，按常規 方法制成固體菌劑。
3.權利要求1所述的微生物菌劑，其特征在于該微生物菌劑作為用于防治植物線蟲的應用。
全文摘要
本發明涉及一種微生物菌劑及其應用，屬微生物農藥技術領域。本發明的微生物菌劑包括菌株球蓋菇2052(Stropharia sp.2052)、芽孢桿菌B16(Bacillus nematocidus)和硅藻土三種物質，經如下步驟得到a.選擇微生物菌株球蓋菇2052(Stropharia sp.2052)和芽孢桿菌B16(Bacillus nematocidus)，按常規方法分別制備成2052固體培養物和B16的菌懸液(CFU＝2×108)，再按質量比1∶1的比例混合得到混合物；b.按質量比加入上述混合物質量的30-40％的硅藻土，硅藻土粒徑為4.5-5mm，按常規方法制成固體菌劑。本發明的微生物菌株作為制備用于防治植物線蟲制劑的應用。本發明的微生物菌劑具有高效、低毒及無殘留的優點，對番茄根結線蟲病溫室防效達到90％以上。
文檔編號A01P5/00GK101861880SQ201010207968
公開日2010年10月20日 申請日期2010年6月24日 優先權日2010年6月24日
發明者劉亞君, 張克勤, 翟沖燕 申請人:云南大學