本發明屬于組織培養技術領域，具體而言，涉及植物的組織培養體系，尤其涉及荷花的未成熟子葉體細胞胚誘導、增殖、分化、萌發與成苗方法。
背景技術：
荷花(NelumbonuciferaGaertn.)為蓮科蓮屬多年生水生花卉，是中國十大傳統名花之一，具有很高的觀賞價值、經濟價值和獨特的文化內涵，深受人們喜愛。根據其用途，可分為藕蓮、籽蓮與花蓮。
2013年，荷花品種--中國古代蓮的全基因組測序完成，為荷花的基因功能研究奠定了良好的基礎。然而，作為轉基因重要技術基礎的荷花遺傳轉化再生體系尚不成熟，嚴重制約了荷花轉基因工作的開展。盡管以荷花為研究對象的組織培養技術有研究并成功獲得植株再生的報道，但它的的組織培養不能象其它作物容易誘導再生(如小麥、水稻、玉米等形成胚性愈傷后多次繼代增殖與保存，并誘導高效分化和再生植株)，因此一直被認為是難以進行培養的園藝作物，限制了荷花組織培養及轉基因技術在育種領域的應用。
一般來說，植株再生的途徑可分為兩種，一種途徑是由莖尖直接分化形成叢生苗，然后進行增殖，最后誘導生根獲得完整植株，即器官發生途徑。器官發生途徑的優點在于誘導過程相對簡單，但它的缺點在于增殖系數低，同時，此種再生途徑被認為是多細胞起源，易形成嵌合體，導致假陽性轉化植株的出現，因此在轉基因的應用上受很大的限制。對荷花來說，目前此途徑主要依靠荷花成熟胚在試管中離體培養出無菌苗，再用無菌苗的莖尖作為外植體誘導出愈傷，然后對愈傷組織誘導不定芽分化，最后生根成苗。關于用荷花成熟胚進行無菌苗培養時取荷花種胚的方法以及消毒的方法，郭娜娜等(荷花成熟胚的組織培養[J].河南科學,2013(3):281-284.)使用濃硫酸腐蝕蓮子種皮，用小刀破殼后直接用酒精和氯化汞消毒后成熟胚的離體成活率達到86.63％，最終可以形成無菌苗。
另一種途徑則是通過體細胞胚胎發生途徑，即先通過誘導外植體形成胚性愈傷，進一步誘導胚性愈傷發育成成熟的胚狀體并萌發成完整植株，此過程類似于植物的有性繁殖，體細胞胚胎發生途徑的困難在于，胚性愈傷與胚狀體的誘導與增殖周期長，獲得難度大且有基因型的差異，但因為它在以下方面的幾個特點使這項技術極具吸引力：一、一旦成功誘導出胚性愈傷，它可以獲得幾百倍甚至上千倍的增殖系數；二，胚性愈傷可以長期保持；三、體細胞胚被認為是單細胞起源，在遺傳轉化過程中不易形成嵌合體導致假陽性的發生，因此是轉基因的良好受體。在荷花上，目前尚未見體細胞胚胎再生途徑方面的報道。
現有技術中荷花作為商業開發時，利用種藕進行人工繁育的繁殖系數低、成本高；同時在基礎研究中缺乏高效的再生體系，限制了基因工程育種工作的開展；這些因素不利于荷花的經濟栽培與遺傳育種工作。因此，通過研究獲得一種荷花的高效再生體系，以解決荷花人工胚狀體的獲取、基因工程育種等問題，并實現荷花的人工快速離體培養與再生，這顯得尤為重要。
技術實現要素：
鑒于現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種荷花的未成熟子葉體細胞胚誘導、增殖、分化、萌發與成苗方法，以實現荷花的快速經濟繁育，極大提高荷花的繁育系數，同時本發明得到的再生體系可以為荷花的基因工程育種提供良好的材料基礎。
為了實現本發明的上述目的，發明人通過大量試驗研究并不懈探索，最終獲得了一種荷花未成熟子葉體細胞胚胎發生途徑的再生方法，該方法包括利用外植體誘導進行組織培養的步驟，所采用的外植體為荷花合子胚中的未成熟子葉。
進一步地，本發明所提供的荷花未成熟子葉體細胞胚胎發生途徑的再生方法，該方法包括如下步驟：
(1)選取荷花受精后合子胚中的未成熟子葉作為組織培養的外植體，對外植體進行消毒及清潔處理；
(2)將外植體放入胚性愈傷誘導與增殖培養基中培養，誘導出愈傷組織并進行增殖培養；
(3)將愈傷組織塊轉移到胚狀體發生培養基中，發育形成胚狀體；
(4)將產生的胚狀體移入胚萌發培養基中進行萌發，發育形成子葉形胚；
(5)將萌發的子葉形胚移至含荷花成苗培養基中成苗培養，然后移栽至自然環境中。
優選地，如上所述荷花未成熟子葉體細胞胚胎發生途徑的再生方法，其中步驟(1)中對于發育較大的未成熟子葉，將其切割成約1-2mm小塊。
優選地，如上所述荷花未成熟子葉體細胞胚胎發生途徑的再生方法，其中步驟(2)中所述的胚性愈傷誘導與增殖培養基的配方為基本MS培養基，添加30g/L的蔗糖、250mg/L的水解酪蛋白、0.5-5.0mg/L的2,4-D、0.5-2.0mg/L的BAP和0.7％的瓊脂糖，調節pH為5.5-6.0；外植體放在盛有上述培養基的培養皿中，然后用封口膜將培養皿包好；培養條件為黑暗或弱光中，25±2℃培養4-8周；當愈傷組織誘導出來，將胚性愈傷組織分成直徑為0.2-0.5cm的小塊，將各小塊分別接入裝有所述胚性愈傷誘導與增殖培養基的器皿中進行胚性愈傷組織的增殖。
優選地，如上所述荷花未成熟子葉體細胞胚胎發生途徑的再生方法，其中步驟(3)中所述的胚狀體發生培養基的配方為基本MS培養基，添加30g/L的蔗糖、250mg/L的水解酪蛋白、1.0mg/L的BAP和0.7％的瓊脂糖，調節pH為5.5-6.0；將步驟2所得的胚性愈傷組織接入盛有上述培養基的培養皿中，然后用封口膜將培養皿包好；培養條件為16/8h光周期，光照強度為1000-1500lux，25±2℃培養3-4周。
優選地，如上所述荷花未成熟子葉體細胞胚胎發生途徑的再生方法，其中步驟(4)中所述的胚萌發培養基的配方為1/2MS培養基，添加10-50mg/L的GA3、0-0.5mg/L的BAP與0.7％的瓊脂糖；培養條件為16/8h光周期，光照強度為2000-3000lux，25±2℃培養1-6周。
優選地，如上所述荷花未成熟子葉體細胞胚胎發生途徑的再生方法，其中步驟(5)中所述的荷花成苗培養基為雙層培養基，基中下層為固體培養基，上層為液體培養基，固體培養基的配方為1/2MS培養基，添加0.2mg/L的IBA與0.7％的瓊脂糖，液體培養基的配方為2％蔗糖水溶液，調節pH為5.5-6.0。
進一步優選地，如上所述荷花未成熟子葉體細胞胚胎發生途徑的再生方法，其中步驟(5)中當荷花莖伸長至6-8cm后，將其移栽至泥塘中培養。
與現有技術相比，本發明的荷花未成熟子葉體細胞胚胎發生途徑的再生方法具有如下有益效果和突出優點：其一，培養速度快，從誘導傷愈組織6-8個星期之后，胚性愈傷組織開始形成，8-10個星期之后胚形態已經開始發生并形成子葉形胚，然后將已誘導的小苗進行移栽，可進一步培養成苗；其二，經濟適用性高，每克愈傷組織可以分化成500-800個胚狀體或者不斷在新愈傷培養基上擴大培養，這取決于材料、培養基與激素的應用，一般而言通過3-4周的培養可以擴大8-10倍；其三，能促進荷花的商業開發，有效提高荷花生產上的繁殖系數，滿足園藝栽培與大批量生產的要求；其四，荷花的轉基因研究剛剛起步，本發明中建立的高效再生體系可以為荷花的轉基因奠定良好的基礎；其五，本發明的方法易于實施，便于推廣。
附圖說明
圖1為荷花品種‘紅建蓮’體細胞胚胎發生過程；其中：
a.花后10d未成熟合子胚子葉接種42d后形成的愈傷；
b.胚性愈傷的增殖(黑色部分為老愈傷組織，淡黃色部分為新形成的愈傷)；
c.體細胞胚的萌發(多個體細胞胚發育至魚雷形胚)；
d.胚性愈傷及胚的早期萌發；
e.兩個獨立的子葉型胚的萌發示意莖尖的形成；
f.胚白化與畸形的產生；
g.體細胞胚的生根；
h.小苗的移栽與生長發育。
具體實施方式
以下實施例進一步描述本發明方法的實施過程和有益效果，實施例僅用于例證的目的，不限制本發明的范圍，同時本領域普通技術人員根據本發明所做的顯而易見的改變也包含在本發明范圍之內。另外，本發明所采用的試劑，其中：
GA3的化學成分為赤霉素，使用時配制成高濃度母液，即0.5mg/mL。具體配制方法：稱取50mgGA3，先用2-3mL95％酒精溶解，然后用蒸餾水定容至100mL，即可使用。
2,4-D的化學成分為2,4-二氯苯氧乙酸，使用時配制成高濃度母液，即0.5mg/mL具體配制方法：準確稱量2,4-D50mg，先用2ml95％乙醇完全溶解后，加蒸餾水定容至100ml，即配成濃度為0.5mg/mL的母液。
BAP的化學成分為6-芐氨基嘌呤，使用時配制成高濃度母液，即0.5mg/mL具體配制方法：準確稱量BAP50mg，加入2mL量1mol/L氫氧化鈉溶液使之完全溶解后，加蒸餾水定容至100ml，即配制成濃度為0.5mg/mL的BAP的母液。
IBA的化學成分為吲哚丁酸，使用時配制成高濃度母液，即0.5mg/mL具體配制方法：準確稱量IBA50mg，用2ml1mol/L氫氧化鈉溶液使之完全溶解后，再加蒸餾水定容至100ml，即配成濃度為0.5mg/mL的母液。
1、選取外植體：
以荷花‘紅建蓮’作為組織培養品種，選取荷花未成熟子葉為組織培養外植體，取開放前的花藥及花絲為對照外植體。在6月底，觀察不同株系‘紅建蓮’開花與授粉的時期，并在花后一段時間取其蓮座，放置于4℃冰箱進行低溫預處理3天。
2、外植體的消毒、接種：
從蓮座中取出幼嫩的蓮種子，先用2％次氯酸鈉溶液浸泡消毒30min，然后用無菌蒸餾水中沖洗三次，去掉種子外層的種皮，取出未成熟合子胚，在超凈工作臺上用解剖刀將其中的子葉切下，根據發育時期的不同，分別切割成1-2mm長。
3、愈傷組織誘導：
胚性愈傷誘導與增殖培養基的配方為基本MS培養基，添加30g/L的蔗糖、250mg/L的水解酪蛋白、2.0mg/L的2,4-D、1.0mg/L的BAP，調節pH為5.5-5.8，然后加0.7％的瓊脂，高壓滅菌鍋121℃滅菌20分鐘；在直徑9cm的培養皿上倒好培養基后，將上述預處理后的外植體置于其上，然后用封口膜將培養皿包好置于人工培養箱中；培養條件為黑暗，25±2℃，培養約6-8個星期；當愈傷組織塊誘導出來，把胚性愈傷組織分成直徑為0.2-0.5cm的小塊，將各小塊分別放在裝有上述胚性愈傷誘導與增殖培養基的器皿中進行胚性愈傷的增殖，每隔28d對胚性愈傷進行1次增殖培養。根據表1的試驗統計結果可以看出，接種外植體后42天時，采用本發明培養基配方(EC12)誘導后的愈傷誘導發生率(誘導愈傷發生的外植體數/接種外植體數×100％)為29.59％(29/98)。
表1‘紅建蓮’幼胚子葉及花藥、花絲在接種不同愈傷誘導培養基上42天后胚性愈傷形成率
4、體細胞胚誘導：
把愈傷組織分成直徑為0.5cm的小塊，將上述各小塊轉移到25ml含有30g/L的蔗糖、250mg/L的水解酪蛋白、1.0mg/L的BAP和0.7％的瓊脂糖、pH為5.5-6.0的MS培養基中進行體細胞胚的誘導，16/8h光周期，光強為1000-1500lux，溫度為27℃，培養3-4周。
5、胚狀體的萌發：
將經過上述步驟4處理的胚狀體放入裝有20-25ml的固體培養基的器皿中，培養基為1/2MS培養基，添加50mg/L的GA3與0.7％的瓊脂糖，培養條件為16/8h光周期，光照強度為2000-3000lux，25±2℃，在培養箱中上培育2-3個星期之后轉移到新的培養基中，部分胚狀體會萌發分化形成子葉。根據表2的試驗統計結果可以看出，采用本發明培養基(8號)誘導后的萌發率(已誘導萌發的胚數/接種體細胞團×100％)為63.47％(73/115)。
表2紅建蓮胚狀體在不同培養基上的萌發率比較
6、成苗誘導與移栽：
將萌發的子葉形胚移至含荷花成苗培養基的250ml錐形瓶中，培養基為雙層培養基，基中下層為75-100ml固體培養基，上層為50-100ml液體培養基。其中，固體培養基成份為1/2MS培養基，添加0.2mg/L的IBA與0.7％的瓊脂糖，液體培養基為2％蔗糖水溶液，調節pH為5.5-6.0，6000-8000lux光照下恒溫培養。待萌發的子葉形胚生長至荷花莖尖長約6-8cm后且根系發育致密，可將其移栽至泥塘中培養。移栽存活率(移栽存活植株數/移栽總苗數×100％)為97.14％(68/70)。