本發(fā)明涉及一種抑制信號(hào)調(diào)控蛋白α表達(dá)的樹突狀細(xì)胞疫苗的制備方法，其中包括如下特征：將構(gòu)建成微小rna145-5p(microrna145-5p，mir-145-5p)的基因片段重組到載體質(zhì)粒上，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染人未成熟樹突狀細(xì)胞(dendriticcells，dcs)，并負(fù)載腫瘤細(xì)胞裂解抗原后，制備成樹突狀細(xì)胞疫苗；mir145-5p在樹突狀細(xì)胞中過表達(dá)可以抑制免疫負(fù)調(diào)控作用的信號(hào)調(diào)控蛋白α的表達(dá)，增強(qiáng)樹突狀細(xì)胞適應(yīng)性免疫活性。

背景技術(shù)：

樹突狀細(xì)胞是機(jī)體內(nèi)最大抗原遞呈細(xì)胞，可激活機(jī)體淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗腫瘤和抗病毒的適應(yīng)性免疫反應(yīng)，是目前在國(guó)內(nèi)外臨床治療癌癥和病毒的常見免疫細(xì)胞技術(shù)。目前樹突狀細(xì)胞常用的培養(yǎng)技術(shù)為通過粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophagecolonystimulatingfactor，gm-csf)、白介素4(interleukin4，il-4)和腫瘤壞死因子α(tumornecrosisfactorα，tnf-α)等其他因子誘導(dǎo)，并負(fù)載各類腫瘤抗原后得到樹突狀細(xì)胞疫苗，用于抗腫瘤臨床治療。

不過樹突狀細(xì)胞不僅具有激活抗腫瘤抗病毒的免疫反應(yīng)，而且也可以表達(dá)免疫負(fù)調(diào)控因子，對(duì)dcs的免疫功能產(chǎn)生抑制作用。其中dcs表達(dá)信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白α(signalregulatoryproteinα，sirpα)，其可以通過與特異性配體cd47相互作用發(fā)揮負(fù)向調(diào)節(jié)作用，我們能觀察到dc表型和功能的抑制，包括dc成熟標(biāo)志減少，細(xì)胞因子il-12分泌減少。因而抑制dcs表達(dá)sirpα，將能逆轉(zhuǎn)sirpα對(duì)dcs免疫負(fù)調(diào)控的作用。

本發(fā)明提供了以調(diào)控sirpα基因表達(dá)的mir-145-5p基因片段，重組到載體質(zhì)粒上，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染人未成熟dcs，并負(fù)載腫瘤細(xì)胞裂解抗原后，制備成樹突狀細(xì)胞疫苗。mir145-5p在樹突狀細(xì)胞中過表達(dá)將抑制免疫負(fù)調(diào)控作用的信號(hào)調(diào)控蛋白α的表達(dá)，將增強(qiáng)了其表達(dá)共刺激分子、分泌細(xì)胞因子能力和激活毒性t淋巴細(xì)胞活性的能力，在體內(nèi)體外試驗(yàn)抗腫瘤具有很強(qiáng)殺傷毒性，更加有助于提高臨床療效和延長(zhǎng)患者生存期。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)培養(yǎng)的樹突狀細(xì)胞，并沒有抑制dcs中負(fù)調(diào)控因子的表達(dá)，這樣在臨床治療中共刺激分子表達(dá)較低，分泌細(xì)胞因子下降以及激活t林細(xì)胞因子特異性低與殺傷效果力度有限。我們前期研究中篩選得到dcs中負(fù)調(diào)控因子sirpα基因的調(diào)控微小rna，即mir145-5p，其可以調(diào)控dcs中負(fù)調(diào)控因子sirpα基因的表達(dá)，mir145-5p高表達(dá)能有效抑制sirpα基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)了其對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷活性與臨床治療療效。

信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白a是sirp家族中最主要的成員，并在髓系細(xì)胞包括樹突狀細(xì)胞中表達(dá)，sirpα通過與特異性配體cd47相互作用發(fā)揮負(fù)向調(diào)節(jié)作用。dcs表面的sirpα與t淋巴細(xì)胞表面的cd47相互結(jié)合，雙向負(fù)調(diào)節(jié)dc和t細(xì)胞功能，即抑制dcs活化，下調(diào)其抗原遞呈能力；并抑制t細(xì)胞增殖和殺傷功能，因而抑制dcs表達(dá)sirpα，將有助于產(chǎn)生對(duì)腫瘤細(xì)胞最佳的免疫活性。

本發(fā)明涉及一種抑制信號(hào)調(diào)控蛋白α表達(dá)的樹突狀細(xì)胞疫苗的制備方法，其中包括如下特征：構(gòu)建成微小rna145-5p的基因片段，重組到載體質(zhì)粒上后通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染人未成熟樹突狀細(xì)胞，其負(fù)載腫瘤細(xì)胞裂解抗原后，制備成樹突狀細(xì)胞疫苗；微小rna145-5p在樹突狀細(xì)胞中過表達(dá)從而抑制免疫負(fù)調(diào)控作用的信號(hào)調(diào)控蛋白α的表達(dá)，增強(qiáng)了樹突狀細(xì)胞的適應(yīng)性免疫活性。

本發(fā)明所述微小rna145-5p的基因片段為成熟體微小rna145，上下游各延長(zhǎng)200個(gè)堿基，并在5’端和3’端加入限制性酶切位點(diǎn)，構(gòu)建成微小rna145-5p重組片段。

將含成熟體微小rna145-5p基因序列24個(gè)堿基，及其上下游各200個(gè)堿基與5’端kpni和3’端ecori的識(shí)別序列構(gòu)成的基因序列通過化學(xué)合成獲得，即mir145-5p；將mir145-5p的目的dna片段重組到dna載體質(zhì)粒上，獲得可以穩(wěn)定復(fù)制并序列正確的mir145-5p/pcdna4。

本發(fā)明所述人未成熟樹突狀細(xì)胞，來源于人外周血、骨髓或臍帶血中單核細(xì)胞，經(jīng)小鼠抗人抗cd14免疫磁珠分選獲得cd14陽(yáng)性單核細(xì)胞，在重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子、和重組人干細(xì)胞生長(zhǎng)因子和重組人白介素4誘導(dǎo)培養(yǎng)得到的未成熟樹突狀細(xì)胞。

本發(fā)明所述方法中dcs來源于自體靜脈血、自體骨髓、臍帶血和胎盤血等的單核細(xì)胞。優(yōu)選地，來源于癌癥患者手術(shù)一個(gè)月后、放化療一個(gè)月后采集的新鮮外周血或骨髓；更優(yōu)選地，為經(jīng)小鼠抗人抗cd14免疫磁珠分選獲得cd14陽(yáng)性單核細(xì)胞。

本發(fā)明所述抑制sirpα表達(dá)的dcs疫苗制備方法是由上述mir145-5p/pcdna4通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染未成熟dcs，獲得穩(wěn)定表達(dá)mir145-5p并靶向抑制sirpα表達(dá)的未成熟dcs；負(fù)載新鮮腫瘤組織來源的腫瘤細(xì)胞熱休克裂解的腫瘤抗原后，誘導(dǎo)獲得成熟dcs。

本發(fā)明所述方法中負(fù)載未成熟dcs的腫瘤抗原，為手術(shù)后新鮮腫瘤組織來源的，經(jīng)消化分離后獲得腫瘤細(xì)胞，經(jīng)超聲裂解后制備成腫瘤抗原。

優(yōu)選地，腫瘤抗原通過熱休克后裂解制備成，即將腫瘤細(xì)胞懸液放置在43℃水浴鍋或金屬浴中熱休克0.5-4小時(shí)后制備成腫瘤抗原。

本發(fā)明所述方法中100ml外周血來源的單核細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得dcs疫苗，培養(yǎng)到8天細(xì)胞數(shù)達(dá)3×10⁷以上；高表達(dá)共刺激分子，即cd83陽(yáng)性率大于85％，cd86陽(yáng)性率大于90％，cd80陽(yáng)性率大于90％，4-1bbl陽(yáng)性率大于80％；與未抑制dcs中負(fù)調(diào)控sirpα表達(dá)的成熟dcs疫苗(如其未成熟dcs按照下述文獻(xiàn)所述方法制備：fukudak，funakoshit，sakurait，etal.peptide-pulseddendriticcellvaccineincombinationwithcarboplatinandpaclitaxelchemotherapyforstageivmelanoma.melanomares.2017mar3.doi：10.1097/cmr.，然后負(fù)載與本申請(qǐng)相同的腫瘤細(xì)胞裂解抗原)相比，本發(fā)明獲得的dcs疫苗經(jīng)熒光定量dna聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-timepolymerasechainreaction，qrt-pcr)技術(shù)檢測(cè)sirpα基因表達(dá)顯著下調(diào)40倍以上；經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒(enzymelinkedimmunosorbentassay，elisa)檢測(cè)分泌的白介素12/p70提高20倍以上。

所述方法中的樹突狀細(xì)胞疫苗，與未抑制dcs中負(fù)調(diào)控sirpα表達(dá)的成熟dcs疫苗(如其未成熟dcs按照下述文獻(xiàn)所述方法制備：fukudak，funakoshit，sakurait，etal.peptide-pulseddendriticcellvaccineincombinationwithcarboplatinandpaclitaxelchemotherapyforstageivmelanoma.melanomares.2017mar3.doi：10.1097/cmr.，然后負(fù)載與本申請(qǐng)相同的腫瘤細(xì)胞裂解抗原)相比，激活t淋巴細(xì)胞增殖倍數(shù)為10倍以上，分泌的干擾素γ(interferonγ，ifn-γ)提高10倍以上；在殺傷腫瘤細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中效靶比40∶1時(shí)殺傷腫瘤細(xì)胞達(dá)到80％以上，顯著高于現(xiàn)有技術(shù)。

本發(fā)明使用的誘導(dǎo)成未成熟dcs的細(xì)胞培養(yǎng)基為淋巴細(xì)胞無血清培養(yǎng)基或rpmi1640培養(yǎng)基加入5-200ng/mlgm-csf、1-50ng/ml干細(xì)胞因子(stemcellsfactor，scf)和1-50ng/mlil-4和1-10％自體血清或胎牛血清，優(yōu)選地，細(xì)胞培養(yǎng)基為rpmi1640培養(yǎng)基，含有20-100ng/mlgm-csf、5-20ng/mlscf和5-20ng/mlil-4和5％自體血清。

本發(fā)明使用的誘導(dǎo)成熟dcs的細(xì)胞培養(yǎng)基為淋巴細(xì)胞無血清培養(yǎng)基或rpmi1640培養(yǎng)基加入5-200ng/mlfms樣酪氨酸激酶3配體(fms1iketyrosinekinase3ligand，flt3l)，1-50ng/mltnfα和1-10％自體血清或胎牛血清，優(yōu)選地，細(xì)胞培養(yǎng)基為rpmi1640培養(yǎng)基，含有10-50ng/mlflt3l，5-20ng/mltnfα和5％自體血清。

本發(fā)明還提供了上述方法制備dcs疫苗，可用于各類癌癥包括實(shí)體瘤和血液腫瘤在內(nèi)的多個(gè)療程的免疫治療。

附圖說明

圖1表示為構(gòu)建的mir145-5p基因片段與pcdna4/to載體示意圖；

圖2表示為實(shí)施例二制備的mir145-5p/dc通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)的共刺激分子表達(dá)水平；

圖3表示為實(shí)施例二和對(duì)比例制備的dcs疫苗通過qrt-pcr技術(shù)檢測(cè)mir-145-5p和sirpα基因表達(dá)水平；

圖4表示為實(shí)施例二和對(duì)比例制備的dcs培養(yǎng)的培養(yǎng)上清通過elisa試劑盒檢測(cè)il-12/p70分泌水平；

圖5表示為實(shí)施例二和對(duì)比例制備的dcs激活t淋巴細(xì)胞增殖曲線；

圖6表示為實(shí)施例二和對(duì)比例制備的dcs激活t淋巴細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)上清通過elisa試劑盒檢測(cè)ifn-γ分泌水平；

圖7表示為實(shí)施例二和對(duì)比例制備的dcs激活的t淋巴細(xì)胞對(duì)u251細(xì)胞的殺傷活性；

圖8表示為荷人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系u251scid鼠模型實(shí)施例二和對(duì)比例制備的dcs激活的t淋巴細(xì)胞治療完之后腫瘤大小變化曲線。

具體實(shí)施方式

我們研究發(fā)現(xiàn)在樹突狀細(xì)胞中mir145-5p能有效抑制信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白α基因的表達(dá)，而sirpα與特異性配體cd47結(jié)合在免疫功能起到負(fù)向調(diào)節(jié)作用，因而抑制樹突狀細(xì)胞表達(dá)sirpα，從而解除了sirpα對(duì)dcs免疫負(fù)調(diào)控的作用，激活t淋巴細(xì)胞增殖和殺傷活性，增強(qiáng)了其對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷活性與臨床治療療效。

對(duì)本發(fā)明涉及的一種抑制信號(hào)調(diào)控蛋白α表達(dá)的樹突狀細(xì)胞疫苗的制備方法的制備方法進(jìn)行具體說明。

本發(fā)明涉及一種抑制信號(hào)調(diào)控蛋白α表達(dá)的樹突狀細(xì)胞疫苗的制備方法，其特征在于，構(gòu)建成微小rna145-5p的基因片段，重組到載體質(zhì)粒上后通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染人未成熟樹突狀細(xì)胞，其負(fù)載腫瘤細(xì)胞裂解抗原后，制備成樹突狀細(xì)胞疫苗；微小rna145-5p在樹突狀細(xì)胞中過表達(dá)從而抑制免疫負(fù)調(diào)控作用的信號(hào)調(diào)控蛋白α的表達(dá)，增強(qiáng)了樹突狀細(xì)胞的適應(yīng)性免疫活性。

本發(fā)明所述微小rna145-5p的基因片段為成熟體微小rna145，上下游各延長(zhǎng)200個(gè)堿基，并在5’端和3’端加入限制性酶切位點(diǎn)，構(gòu)建成微小rna145-5p重組片段。

將含成熟體微小rna145-5p基因序列24個(gè)堿基，及其上下游各200個(gè)堿基與5’端kpni和3’端ecori的識(shí)別序列構(gòu)成的基因序列通過化學(xué)合成獲得，即mir145-5p；

將mir145-5p的目的dna片段和pcdna4載體kpni和ecori雙酶切后，在t4dna連接酶作用下，將兩者于4℃、12小時(shí)連接反應(yīng)制備克隆連接液，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞dh5a后進(jìn)行陽(yáng)性克隆的pcr鑒定和測(cè)序鑒定，即mir145-5p/pcdna4；pcr產(chǎn)物凝膠電泳檢測(cè)和測(cè)序鑒定符合mir145-p5大小和序列后，將測(cè)序正確的菌液轉(zhuǎn)接于10ml含氨芐的lb液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，用無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒抽提，抽提合格的重組質(zhì)粒通過核酸定量?jī)x確定dna濃度，用去離子水稀釋到4ug/μl，然后將重組載體dna放置-80℃超低溫冰箱中長(zhǎng)期保存。

本發(fā)明所述方法中樹突狀細(xì)胞來源于自體靜脈血、自體骨髓、臍帶血和胎盤血等的單核細(xì)胞。優(yōu)選地，來源于癌癥患者手術(shù)一個(gè)月后、放化療一個(gè)月后采集的新鮮外周血或骨髓；更優(yōu)選地，為經(jīng)小鼠抗人抗cd14免疫磁珠分選獲得cd14陽(yáng)性單核細(xì)胞。

采集來源于患者自體外周血，經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液分離純化得到單個(gè)核細(xì)胞后，用1×pbs(ph值為7.4)重懸并稀釋到2-15×10⁶細(xì)胞/ml，通過小鼠抗人抗cd14免疫磁珠分選獲得cd14陽(yáng)性單核細(xì)胞，1500rpm離心10分鐘收集cd14單核細(xì)胞，并用rpmi1640培養(yǎng)基重懸并稀釋到1-5×10⁶細(xì)胞/ml，并補(bǔ)充5-200ng/mlgm-csf、1-50ng/mlscf和1-50ng/mlil-4和1-10％自體血清或胎牛血清，每3ml加入到6孔板每孔中，于37℃、含5％co2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；48小時(shí)后進(jìn)行1/3換液，于37℃、含5％co2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)2天，第5天即可獲得未成熟樹突狀細(xì)胞；

根據(jù)樹突狀細(xì)胞在6孔板中培養(yǎng)的孔數(shù)，每孔配制溶液1為250μl：240μlrpmi1640培養(yǎng)基+10μl脂質(zhì)體3000轉(zhuǎn)染試劑(溫育5min)，以及溶液2為250μl：249μlrpmi1640+1μl4μg重組載體dna，將溶液1與溶液2混合，室溫下置20min；與此同時(shí)，第5天培養(yǎng)的未成熟樹突狀細(xì)胞通過1500rpm離心10分鐘收集，細(xì)胞用rpmi1640培養(yǎng)基沖洗細(xì)胞1遍后，用rpmi1640培養(yǎng)基重懸并稀釋到1×10⁶細(xì)胞/ml，并加入到6孔板中，每孔2ml；將溶液1與溶液2的混合液逐滴加入孔中，搖動(dòng)培養(yǎng)板，輕輕混勻，在37℃，5％的co2中保溫5～6小時(shí)；6小時(shí)后，更換rpmi1640培養(yǎng)基(含5-200ng/mlgm-csf、1-50ng/mlscf和1-50ng/mlil-4和1-10％自體血清或胎牛血清)，在37℃，5％的co2中繼續(xù)培養(yǎng)48～72h檢測(cè)轉(zhuǎn)染水平。

培養(yǎng)到第7-8天的未成熟樹突狀細(xì)胞通過1500rpm離心10分鐘收集，用rpmi1640培養(yǎng)基(含5-200ng/mlflt3l，1-50ng/mltnfα和1-10％自體血清或胎牛血清)重懸并稀釋到3×10⁶細(xì)胞/ml，并加入到6孔板中，每孔3ml；同時(shí)加入新鮮腫瘤組織來源的腫瘤細(xì)胞熱休克后裂解釋放的腫瘤抗原，每孔1-500ng/ml；在37℃，5％的co2中繼續(xù)培養(yǎng)24h，即獲得成熟樹突狀細(xì)胞，通過1500rpm離心10分鐘收集，用0.9％生理鹽水洗滌2次后0.9％生理鹽水重懸并稀釋到3-20×10⁶細(xì)胞/ml，制備樹突狀細(xì)胞疫苗。

本發(fā)明所述方法中腫瘤細(xì)胞裂解抗原來源于手術(shù)后的新鮮腫瘤組織，腫瘤組織用1×pbs(ph值7.4，含1×雙抗)洗滌3次，使用眼科剪去除結(jié)締組織和血管后剪碎，加入5-10ml1×pbs(ph值7.4，含1×雙抗)，吸入15ml離心管中1000rpm離心10min，加入3-6ml0.25％(質(zhì)量體積百分比)胰酶(含質(zhì)量體積百分比0.02％edta和100活性單位iu的膠原酶i)，在37℃，5％co2培養(yǎng)箱中消化30min，每隔10min漩渦振蕩1次；消化后加入2-12mlrpmi1640培養(yǎng)基(含10％胎牛血清)中止消化，1200rpm離心10min后獲得腫瘤細(xì)胞沉淀，加入4.5mlrpmi1640培養(yǎng)基重懸。

將腫瘤細(xì)胞懸液加入蛋白酶抑制劑cocktail0.5ml，立即通過超聲破碎儀破碎超聲破碎3sec，停3sec，共3min，3次超聲破碎；破碎后12000rpm離心20min，吸去上清到新的15ml離心管中，通過核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定蛋白濃度，用rpmi1640培養(yǎng)基將裂解腫瘤抗原稀釋到10ng/μl，分裝到200μlep管中，每管50μl，放置-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

優(yōu)選地，腫瘤抗原通過熱休克后裂解制備成，即將腫瘤細(xì)胞懸液放置在43℃水浴鍋或金屬浴中熱休克0.5-4小時(shí)后制備成腫瘤抗原。

本發(fā)明所述方法中100ml外周血來源的單核細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得dcs疫苗，培養(yǎng)到8天細(xì)胞數(shù)達(dá)3×10⁷以上；通過流式抗體染色后在流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)其高表達(dá)共刺激分子，即cd83陽(yáng)性率大于85％，cd86陽(yáng)性率大于90％，cd80陽(yáng)性率大于90％，4-1bbl陽(yáng)性率大于80％；與未抑制dcs中負(fù)調(diào)控sirpα表達(dá)的成熟dcs疫苗(如其未成熟dcs按照下述文獻(xiàn)所述方法制備：fukudak，funakoshit，sakurait，etal.peptide-pulseddendriticcellvaccineincombinationwithcarboplatinandpaclitaxelchemotherapyforstageivmelanoma.melanomares.2017mar3.doi：10.1097/cmr.，然后負(fù)載與本申請(qǐng)相同的腫瘤細(xì)胞裂解抗原)相比，本發(fā)明獲得的dcs疫苗經(jīng)熒光定量dna聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-timepolymerasechainreaction，qrt-pcr)技術(shù)檢測(cè)sirpα基因表達(dá)顯著下調(diào)40倍以上；經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒(enzymelinkedimmunosorbentassay，elisa)檢測(cè)分泌的白介素12/p70提高20倍以上。

所述方法中的樹突狀細(xì)胞疫苗，與未抑制dcs中負(fù)調(diào)控sirpα表達(dá)的成熟dcs疫苗(如其未成熟dcs按照下述文獻(xiàn)所述方法制備：fukudak，funakoshit，sakurait，etal.peptide-pulseddendriticcellvaccineincombinationwithcarboplatinandpaclitaxelchemotherapyforstageivmelanoma.melanomares.2017mar3.doi：10.1097/cmr.，然后負(fù)載與本申請(qǐng)相同的腫瘤細(xì)胞裂解抗原)相比，激活t淋巴細(xì)胞增殖倍數(shù)為10倍以上，elisa試劑盒檢測(cè)分泌的ifn-γ提高10倍以上；通過非放射性細(xì)胞毒性分析(cytotoxnon-radioactivecytotoxicityassay)試劑盒檢測(cè)在殺傷腫瘤細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中效靶比40∶1時(shí)殺傷腫瘤細(xì)胞達(dá)到80％以上，顯著高于現(xiàn)有技術(shù)。

作為本發(fā)明中使用的pcdna4載體質(zhì)?？梢栽谏虡I(yè)上購(gòu)買，為哺乳動(dòng)物表達(dá)載體，如pcdna4/myc-hisc載體、pcdna4/to載體、pcdna4/hismaxa、b、c和pcdna4/to/myc-hisa等。

作為本發(fā)明中使用的脂質(zhì)體可以在商業(yè)上購(gòu)買，如脂質(zhì)體2000、脂質(zhì)體3000和lipofectamine等，優(yōu)選脂質(zhì)體3000。

作為本發(fā)明dcs培養(yǎng)中使用的細(xì)胞培養(yǎng)板、細(xì)胞培養(yǎng)皿和培養(yǎng)瓶，可例舉，為6孔板、90mm細(xì)胞培養(yǎng)皿、75cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶和175cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶等細(xì)胞培養(yǎng)用器材(容器)，均可用于本發(fā)明，優(yōu)選6孔細(xì)胞培養(yǎng)板。

本發(fā)明的制造方法中對(duì)dcs進(jìn)行凍存，對(duì)凍存液無特殊限制，但優(yōu)選如為50％小牛血清、40％細(xì)胞培養(yǎng)液和10％二甲基亞砜，其中細(xì)胞培養(yǎng)液更優(yōu)選為dcs培養(yǎng)液。

在培養(yǎng)基中可以添加血清或血漿進(jìn)行培養(yǎng)。它們?cè)谂囵B(yǎng)基中的添加量不受特殊限制，如大于0容量％至20容量％，且可以根據(jù)不同的培養(yǎng)階段而改變血清或血漿的用量，優(yōu)選為5％(體積比)。例如，可以階段性減少血清或血漿濃度來使用。另外，作為血清或血漿的來源，可以是自己(意味著與所培養(yǎng)的細(xì)胞來源相同)或非自己(意味著與所培養(yǎng)的細(xì)胞的來源不同)中的任一種，從安全性的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選自己來源的血清或血漿。另外，也可以添加如人血清白蛋白之類經(jīng)分離純化的血清成分。

本發(fā)明的自體dcs培養(yǎng)的制備使用上述各種成分及培養(yǎng)基來實(shí)施。本發(fā)明中使用的培養(yǎng)培養(yǎng)條件也沒有特殊限制，可以使用通常的細(xì)胞培養(yǎng)中使用的條件。例如，可在37℃、5％co2等條件下培養(yǎng)。還可以實(shí)施如下等操作：間隔適當(dāng)?shù)臅r(shí)間添加新鮮培養(yǎng)基來稀釋細(xì)胞培養(yǎng)液，或更換培養(yǎng)基，或更換細(xì)胞培養(yǎng)用器材等。

本發(fā)明還提供dcs疫苗在臨床應(yīng)用中多次的抗腫瘤治療，更好地在生物體內(nèi)發(fā)揮抗腫瘤免疫應(yīng)答，達(dá)到很好的治療效果。此外，上述dcs疫苗還具有如下優(yōu)點(diǎn)，多次dcs疫苗治療將更好地引發(fā)淋巴細(xì)胞殺瘤活性，抑制調(diào)節(jié)性t淋巴細(xì)胞免疫抑制活性，產(chǎn)生高效、長(zhǎng)效地抗腫瘤免疫效應(yīng)，因此非常利于患者療效的提高和生存期的延長(zhǎng)。

以下，結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做更具體的描述，但本發(fā)明不限于此。

實(shí)施例一重組mir145-5p/pcdna4基因構(gòu)建的制備

將含成熟體微小rna145-5p基因序列24個(gè)堿基，及其上下游各200個(gè)堿基與5’端kpni和3’端ecori的識(shí)別序列構(gòu)成的基因序列通過化學(xué)合成獲得，即mir145-5p；

將mir145-5p的目的dna片段和pcdna4/to載體(購(gòu)自美國(guó)thermofisher公司)kpni和ecori雙酶切后，在t4dna連接酶作用下，將兩者于4℃、12小時(shí)連接反應(yīng)制備克隆連接液，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞dh5a(購(gòu)自美國(guó)invitrogen公司)后進(jìn)行陽(yáng)性克隆的pcr鑒定和測(cè)序鑒定，即mir145-5p/pcdna4，見圖1；pcr產(chǎn)物凝膠電泳檢測(cè)和測(cè)序鑒定符合mir145-p5大小和序列后，將測(cè)序正確的菌液轉(zhuǎn)接于10ml含氨芐的lb液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，用無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒抽提，抽提合格的重組質(zhì)粒通過核酸蛋白定量?jī)x(美國(guó)bio-rad公司)確定dna濃度，用去離子水稀釋到4ug/μl，然后將載體mir145-5p/pcdna4放置-80℃超低溫冰箱中長(zhǎng)期保存。

實(shí)施例二抑制信號(hào)調(diào)控蛋白α表達(dá)的樹突狀細(xì)胞的制備

采集來源于膠質(zhì)瘤患者(男，44歲，與其簽署知情同意書)自體外周血100ml，經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液分離純化得到單個(gè)核細(xì)胞后，用1×pbs(ph值為7.4)重懸并稀釋到10×10⁶細(xì)胞/ml，通過小鼠抗人抗cd14免疫磁珠(購(gòu)自德國(guó)美天旎公司)分選獲得cd14陽(yáng)性單核細(xì)胞，1500rpm離心10分鐘收集cd14單核細(xì)胞，并用rpmi1640培養(yǎng)基(購(gòu)自美國(guó)life公司)重懸并稀釋到2×10⁶細(xì)胞/ml，并補(bǔ)充100ng/mlgm-csf(購(gòu)自美國(guó)r&dsystems公司)、10ng/mlscf(購(gòu)自美國(guó)r&dsystems公司)和20ng/mlil-4(購(gòu)自美國(guó)r&dsystems公司)和5％自體血清或胎牛血清(購(gòu)自美國(guó)life公司)，每3ml加入到6孔板每孔中，于37℃、含5％co2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；48小時(shí)后進(jìn)行1/3換液，于37℃、含5％co2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)2天，第5天即可獲得未成熟樹突狀細(xì)胞；

根據(jù)樹突狀細(xì)胞在6孔板中培養(yǎng)的孔數(shù)，每孔配制溶液1為250μl：240μlrpmi1640培養(yǎng)基+10μl脂質(zhì)體3000(購(gòu)自美國(guó)invitrogen公司)轉(zhuǎn)染試劑(溫育5min)，以及溶液2為250μl：249μlrpmi1640+1μl4μgmir145-5p/pcdna4重組載體，將溶液1與溶液2混合，室溫下置20min；與此同時(shí)，第5天培養(yǎng)的未成熟樹突狀細(xì)胞通過1500rpm離心10分鐘收集，細(xì)胞用rpmi1640培養(yǎng)基沖洗細(xì)胞1遍后，用rpmi1640培養(yǎng)基重懸并稀釋到1×10⁶細(xì)胞/ml，并加入到6孔板中，每孔2ml；將溶液1與溶液2的混合液逐滴加入孔中，搖動(dòng)培養(yǎng)板，輕輕混勻，在37℃，5％的co2中保溫5～6小時(shí)；6小時(shí)后，更換rpmi1640培養(yǎng)基(含100ng/mlgm-csf、10ng/mlscf和20ng/mlil-4和1-10％自體血清或胎牛血清)，在37℃，5％的co2中繼續(xù)培養(yǎng)48h檢測(cè)轉(zhuǎn)染水平。

培養(yǎng)到第7天的未成熟樹突狀細(xì)胞通過1500rpm離心10分鐘收集，用rpmi1640培養(yǎng)基(含20ng/mlflt3l，購(gòu)自美國(guó)r&dsystems公司；10ng/mltnfα，購(gòu)自美國(guó)r&dsystems公司和5％自體血清或胎牛血清)重懸并稀釋到3×10⁶細(xì)胞/ml，并加入到6孔板中，每孔3ml；同時(shí)加入新鮮腫瘤組織來源的腫瘤細(xì)胞熱休克后裂解釋放的腫瘤抗原，每孔50ng/ml；在37℃，5％的co2中繼續(xù)培養(yǎng)24h，即獲得成熟樹突狀細(xì)胞，通過1500rpm離心10分鐘收集，用0.9％生理鹽水洗滌2次后0.9％生理鹽水重懸，計(jì)數(shù)樹突狀細(xì)胞為4.6×10⁷，生理鹽水稀釋到5×10⁶細(xì)胞/ml，制備樹突狀細(xì)胞疫苗。

取2×10⁶dcs細(xì)胞使用流式抗體染色，即fitc標(biāo)記的小鼠抗人cd83與pe標(biāo)記的小鼠抗人cd86，fitc標(biāo)記的小鼠抗人cd80與pe標(biāo)記的小鼠抗人4-1bbl(均購(gòu)自美國(guó)bd公司)，然后上機(jī)檢測(cè)，圖2中dc高表達(dá)共刺激分子，即圖2a中cd83陽(yáng)性率為93.83％，圖2b中cd86陽(yáng)性率為99.83％，圖2c中cd80陽(yáng)性率為99.54％，圖2d中4-1bbl陽(yáng)性率為98.97％。

實(shí)施例三dcs負(fù)載的腫瘤抗原制備

手術(shù)后的新鮮腫瘤組織(膠質(zhì)瘤患者，臨床iv期，男，44歲，與其簽署知情同意書)，腫瘤組織用1×pbs(ph值7.4，含1×雙抗)洗滌3次，使用眼科剪去除結(jié)締組織和血管后剪碎，加入6ml1×pbs(ph值7.4，含1×雙抗)，吸入15ml離心管中1000rpm離心10min，加入3ml0.25％(質(zhì)量體積百分比)胰酶(含質(zhì)量體積百分比0.02％edta和100活性單位iu的膠原酶i，均購(gòu)自美國(guó)sigma公司)，在37℃，5％co2培養(yǎng)箱中消化30min，每隔10min漩渦振蕩1次；消化后加入3mlrpmi1640培養(yǎng)基(含10％胎牛血清)中止消化，1200rpm離心10min后獲得腫瘤細(xì)胞沉淀，加入4.5mlrpmi1640培養(yǎng)基重懸。

將腫瘤細(xì)胞懸液放置在43℃水浴鍋或金屬浴中熱休克2小時(shí)后，腫瘤細(xì)胞懸液加入蛋白酶抑制劑cocktail0.5ml(購(gòu)自美國(guó)bd公司)，立即通過超聲破碎儀破碎超聲破碎3sec，停3sec，共3min，3次超聲破碎；破碎后12000rpm離心20min，吸去上清到新的15ml離心管中，通過核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定蛋白濃度，用rpmi1640培養(yǎng)基將裂解腫瘤抗原稀釋到10ng/μl，分裝到200μlep管中，每管50μl，放置-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)施例四抑制信號(hào)調(diào)控蛋白α表達(dá)的樹突狀細(xì)胞免疫功能檢測(cè)

依據(jù)fukudak等2017年3月3日在黑色素瘤研究雜志中發(fā)表的多肽負(fù)載樹突狀細(xì)胞聯(lián)合卡鉑和紫杉醇治療iv期黑色素瘤(fukudak，funakoshit，sakurait，etal.peptide-pulseddendriticcellvaccineincombinationwithcarboplatinandpaclitaxelchemotherapyforstageivmelanoma.melanomares.2017mar3.doi：10.1097/cmr.)的方法誘導(dǎo)培養(yǎng)到未成熟dcs，同樣負(fù)載實(shí)施例三中制備的熱休克腫瘤細(xì)胞裂解抗原，在通過該報(bào)道中的方法誘導(dǎo)成熟dcs，獲得的dcs作為對(duì)比例。

實(shí)施例二中制備和對(duì)比例制備的dcs疫苗，通過熒光定量dna聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-timepolymerasechainreaction，qrt-pcr)技術(shù)檢測(cè)mir-145-5p和sirpα基因表達(dá)水平，按照iiione-stepqrt-pcr試劑盒(美國(guó)invitrogen公司)進(jìn)行操作，實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖3a中可以發(fā)現(xiàn)mir-145-5p表達(dá)顯著高于對(duì)比例制備的dcs，提高了81.06倍；同時(shí)圖3b中sirpα基因在本發(fā)明dcs表達(dá)明顯下降，與對(duì)比例制備的dcs相比下調(diào)43倍。圖中dcs為未mir145-5p/pcdna4脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的樹突狀細(xì)胞，mir145-5p/dcs為本發(fā)明mir145-5p/pcdna4脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的樹突狀細(xì)胞；對(duì)比例dcs為對(duì)比例中現(xiàn)有技術(shù)制備的樹突狀細(xì)胞。

取dcs培養(yǎng)第7天的培養(yǎng)上清，通過il-12/p70elisa試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)上清中il-12/p70分泌水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，本發(fā)明制備的dcs培養(yǎng)上清中il-12/p70明顯高于對(duì)比例制備的，提高了20.24倍，分泌水平達(dá)11.74ng/ml。圖中dcs為未mir145-5p/pcdna4脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)的上清，mir145-5p/dcs為本發(fā)明mir145-5p/pcdna4脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)的上清；對(duì)比例dcs為對(duì)比例中現(xiàn)有技術(shù)制備的樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)的上清。

取2×10⁶實(shí)施例2中制備和對(duì)比例制備的dcs，分別與1×10⁷人t淋巴細(xì)胞在10mlrpmi1640培養(yǎng)基(含5％胎牛血清)進(jìn)行共培養(yǎng)，每間隔2天對(duì)t淋巴進(jìn)行計(jì)數(shù)1次，并分析t淋巴細(xì)胞增殖倍數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，可以看到從計(jì)數(shù)第3天開始，本發(fā)明制備的dcs激活的t淋巴細(xì)胞數(shù)均明顯高于對(duì)比例制備的，在培養(yǎng)到第15天t淋巴細(xì)胞增殖倍數(shù)為對(duì)比例的11.24倍，比激活前起始t淋巴細(xì)胞數(shù)增殖878.9倍。圖中dc-t為未mir145-5p/pcdna4脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的樹突狀細(xì)胞激活的t淋巴細(xì)胞，mir155-5p/dcs-t為本發(fā)明mir145-5p/pcdna4脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的樹突狀細(xì)胞激活的t淋巴細(xì)胞；對(duì)比例dcs-t為對(duì)比例中現(xiàn)有技術(shù)制備的樹突狀細(xì)胞激活的t淋巴細(xì)胞。

取dcs與t淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)第7天的培養(yǎng)上清，通過ifn-γelisa試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)上清中ifn-γ分泌水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，本發(fā)明制備的dcs激活t淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中ifn-γ明顯高于對(duì)比例制備的，為后者的13.64倍，分泌水平達(dá)14.87ng/ml。圖中dc-t為未mir145-5p/pcdna4脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的樹突狀細(xì)胞激活的t淋巴細(xì)胞培養(yǎng)的上清，mir145-5p/dcs-t為本發(fā)明mir145-5p/pcdna4脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的樹突狀細(xì)胞激活的t淋巴細(xì)胞培養(yǎng)的上清；對(duì)比例dcs-t為對(duì)比例中現(xiàn)有技術(shù)制備的樹突狀細(xì)胞激活的t淋巴細(xì)胞培養(yǎng)的上清。

實(shí)施例五抑制信號(hào)調(diào)控蛋白α表達(dá)的樹突狀細(xì)胞體外殺瘤試驗(yàn)

分別以膠質(zhì)瘤細(xì)胞系u251為靶細(xì)胞，以實(shí)施例四中本發(fā)明制備的和對(duì)比例制備的dcs激活的t淋巴細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，按效靶比40∶1、20∶1、10∶1、5∶1和2.5∶1分別加入96孔培養(yǎng)板中，然后置于37℃、5％co2條件下培養(yǎng)4h，均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。采用cytotoxnon-radioactivecytotoxicityassay試劑盒(購(gòu)自美國(guó)promega公司)激活的t淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性，按照試劑盒使用說明書操作，最后通過490nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度(od)值。按下列公式分別計(jì)算對(duì)u251細(xì)胞的殺傷率：殺傷率＝(實(shí)驗(yàn)組od值-效應(yīng)細(xì)胞自然釋放組od值-靶細(xì)胞自然釋放組od值)/(靶細(xì)胞最大釋放組od值-靶細(xì)胞自然釋放組od值)×100％。

圖7為dcs激活的t淋巴細(xì)胞對(duì)u251細(xì)胞的殺傷活性，隨著效靶比提高，細(xì)胞毒性活性也不斷提高，其中mir145-5p/dc-t細(xì)胞殺傷u251細(xì)胞殺傷毒性顯著高于dc-t細(xì)胞和對(duì)比例dc-t細(xì)胞，p值分別為0.001和0.002。

實(shí)施例六抑制信號(hào)調(diào)控蛋白α表達(dá)的樹突狀細(xì)胞體內(nèi)殺瘤實(shí)驗(yàn)中的作用

24只8周scid裸鼠腹部側(cè)翼皮下注射5×10⁶膠質(zhì)瘤細(xì)胞系u251，飼養(yǎng)7天后，隨機(jī)分為a、b、c和d4組，每組6只：a組為實(shí)施例二制備的未mir145-5p/pcdna4脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的樹突狀細(xì)胞激活的t淋巴細(xì)胞治療組(dc-t組)；b組為實(shí)施例二制備的mir145-5p/pcdna4脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的樹突狀細(xì)胞激活的t淋巴細(xì)胞治療組(mir145-5p/dc-t組)；c組為實(shí)施例四制備的對(duì)比例dcs為對(duì)比例中現(xiàn)有技術(shù)制備的樹突狀細(xì)胞激活的t淋巴細(xì)胞(對(duì)比例dc-t組)；d組為生理鹽水安慰劑組。a組在dc-t細(xì)胞培養(yǎng)到第14天和第16天尾靜脈注射2×10⁴細(xì)胞/克，b組在mir145-5p/dcs-t細(xì)胞培養(yǎng)到第14天和第16天尾靜脈注射2×10⁴細(xì)胞/克，c組在對(duì)比例dcs-t培養(yǎng)到第14天和第16天尾靜脈注射2×10⁴細(xì)胞/克，d組與a、b和c治療組同時(shí)間，尾靜脈注射同體積的生理鹽水，各1ml。治療后分別于7d、14d、21d、28d和35d拉頸處死，取荷膠質(zhì)瘤細(xì)胞系u251scid鼠模型腫瘤組織，計(jì)算鼠模型荷瘤大小。

圖8荷膠質(zhì)瘤細(xì)胞系u251scid鼠模型dc激活t淋巴細(xì)胞治療完之后腫瘤大小變化曲線，生理鹽水組d和dc-t治療組a、mir145-5p/dc-t治療組b與對(duì)比例dc-t治療組c相比，治療組a、治療組b與治療組c中膠質(zhì)瘤腫瘤大小縮少，但治療組b與治療組a與治療組c相比膠質(zhì)瘤大小縮少更為明顯，p值分別為0.013和0.011，表明mir145-5p/pcdna4脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的樹突狀細(xì)胞激活的t淋巴細(xì)胞引發(fā)了強(qiáng)大的體內(nèi)殺瘤活性。