本發明涉及植物培養繁殖技術領域，具體涉及一種蕙蘭無毒苗培養繁殖方法。
背景技術：
蕙蘭是蘭科蕙蘭屬的地生草本植物，假鱗莖不明顯，集生成叢，呈橢圓形。葉帶形，直立性強，葉脈透亮，邊緣常有粗鋸齒。花常為淺黃綠色，唇瓣有紫紅色斑，一莖多花。蕙蘭是中國栽培最久和最普及的蘭花之一，屬于珍稀物種，為國家二級重點保護野生物種，是比較耐寒的蘭花品種之一。
由于蕙蘭種子非常微小，幾乎無胚乳，在自然條件下種子萌發率極低，因此在生產實踐中多采用分株方式進行繁殖，無性繁殖引發的病毒傳播嚴重制約了蘭花產業化發展，病毒可造成植株葉斑、壞死以及花朵變色、畸形等癥狀，嚴重影響其品質，目前尚無藥物能有效防治病毒的危害與傳播，因此繁殖蕙蘭無毒苗是產業化發展的必經之路。
技術實現要素：
本發明的目的在于提供一種蕙蘭無毒苗培養繁殖方法，從而培養蕙蘭無毒苗，實現蕙蘭的無病毒栽培。
為了達到上述目的，本發明采用的技術方案為：一種蕙蘭無毒苗培養繁殖方法，包括以下步驟：
(1)植株熱處理：將無病蟲害長勢良好的蕙蘭放入培養箱中進行培養，培養期間，培養箱內濕度為80～90％，培養箱內溫度開始時為30℃，每隔一天上升1℃，直至38℃，培養時間為22～25d，光照時間為16h/d，光照強度為3000～5000lx；
(2)材料選取：將上述熱處理后的蕙蘭從培養箱中取出，切取蕙蘭的莖尖；
(3)材料消毒：將上述切取的莖尖用清水沖洗干凈，沖洗后剝去外層葉片，在超凈工作臺上用體積分數為70％的酒精浸泡20～30s，然后用質量分數為0.2％的氯化汞溶液分2～3次共消毒5～6min，每次用氯化汞溶液消毒后用無菌水漂洗5次，并用消毒濾紙吸干表面水分；
(4)原球莖誘導培養：將上述消毒后的莖尖在解剖鏡下剝離成長度為0.3～0.5mm的莖段，然后接種到誘導培養基中進行培養，所述誘導培養基為：B5培養基+0.3～0.7mg/L 6-BA+0.1～0.3mg/L IBA+0.2～0.3mg/L VC+0.05～0.15mg/L GA3，培養時間為22～25d，培養溫度24～26℃，光照時間為12h/d，光照強度為1500～2000lx；培養時間結束后，再將培養材料整體移入新的誘導培養基中繼續培養，培養時間為15～20d，培養溫度24～26℃，光照時間為12h/d，光照強度為1500～2000lx；
(5)增殖繼代培養：將培養后的原球莖在無菌工作臺上進行分割，然后在接入到增殖培養基中繼續培養，所述增殖培養基為：B5培養基+0.8～1.5mg/L6-BA+0.1～0.3mg/L NAA+8～12％椰汁，培養條件：培養溫度24～26℃，光照時間為12h/d，光照強度為1500～2000lx；
(6)壯苗培養：增殖繼代培養后，選擇高2cm以上、基部有明顯突起的小苗轉入壯苗培養基中培養，所述壯苗培養基為：B5培養基+2～4mg/L NAA，培養時間為15～20d，培養溫度24～26℃，光照時間為13h/d，光照強度為1800～21000lx；培養時間結束后，再向壯苗培養基中加入0.3％活性炭，培養溫度27～29℃，光照時間為15h/d，光照強度為2500～3000lx；
(7)移栽：當試管苗生長至4～5cm高，根2～4條，葉1～2片時，將試管苗放在自然光下煉苗5～7天，打開瓶蓋煉苗1～2天；然后取出培養苗，用清水洗凈附著在根部的培養基，清洗時注意不要損害根部，然后移栽至水苔和腐殖土質量比為1:2的混合基質中，保持濕度和通風，空氣濕度為75～85％，溫度為20～25℃。
如上所述的一種蕙蘭無毒苗培養繁殖方法，進一步說明為，所述材料消毒步驟中，每次用質量分數為0.2％的氯化汞溶液消毒時，向氯化汞溶液中加入一滴吐溫-20。
如上所述的一種蕙蘭無毒苗培養繁殖方法，進一步說明為，所述誘導培養基為：B5培養基+0.5mg/L 6-BA+0.2mg/L IBA+0.25mg/L VC+0.1mg/L GA3。
如上所述的一種蕙蘭無毒苗培養繁殖方法，進一步說明為，所述增殖培養基為：B5培養基+1mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+10％椰汁。
本發明的有益效果是：采用本方法能使培養后的蕙蘭苗株發病率低，成苗率高，苗株品質好，栽培后適應性強，苗株長勢良好，通過生物技術手段在短時間內，滿足了商業化生產的需求，為企業規模化、產業化培養蕙蘭無毒苗提供了技術支持。
具體實施方式
下面對本發明具體實施方式做進一步的闡述。
本發明提供了一種蕙蘭無毒苗培養繁殖方法，從而培養蕙蘭無毒苗，實現蕙蘭的無病毒栽培，該方法包括以下步驟：
(1)植株熱處理：將無病蟲害長勢良好的蕙蘭放入培養箱中進行培養，培養期間，培養箱內濕度為80～90％，培養箱內溫度開始時為30℃，每隔一天上升1℃，直至38℃，培養時間為22～25d，光照時間為16h/d，光照強度為3000～5000lx；部分病毒在高溫條件下會失去活性，持續一定時間后，病毒含量不斷下降，經過熱處理能在一定程度上脫掉部分病毒，蕙蘭熱處理的溫度上限為38℃，超過38℃，會使蕙蘭失去活性，甚至枯死，熱處理溫度采用階梯上升，能使蕙蘭植物逐漸適應溫度的變化。
(2)材料選取：將上述熱處理后的蕙蘭從培養箱中取出，切取蕙蘭的莖尖；植物病毒在植株體內主要沿植物輸導組織蔓延發展，植物頂端分生組織沒有導管、篩管的分化，同時植物頂端細胞生活力強，能不斷分裂擺脫病毒的侵入，所以植物頂端分生細胞中一般不含病毒，切取蕙蘭的莖尖進行組培，從而可以獲得蕙蘭無毒苗。
(3)材料消毒：將上述切取的莖尖用清水沖洗干凈，沖洗后剝去外層葉片，在超凈工作臺上用體積分數為70％的酒精浸泡20～30s，然后用質量分數為0.2％的氯化汞溶液分2～3次共消毒5～6min，每次用氯化汞溶液消毒后用無菌水漂洗5次，并用消毒濾紙吸干表面水分；一般消毒用的0.1％氯化汞溶液滅菌效果不佳，而濃度較高的氯化汞溶液又易使莖尖失去活性，抑制誘導，而本培育方法采用質量分數為0.2％的氯化汞溶液能較好起到滅菌作用而又對其活性影響較小，并且采用分2～3次操作，能更好的保護莖尖活性；
表1為采用上述消毒方法對蕙蘭莖尖進行處理后，放置于普通誘導培養基中進行培養，對培養后蕙蘭莖尖誘導率的試驗結果：
由表1中可以看出，采用質量分數為0.2％的氯化汞溶液能較好起到滅菌作用而又對其活性影響較小，并且采用分2～3次操作，能更好的保護蕙蘭莖尖活性，大大增加蕙蘭莖尖的誘導率。作為優選，每次用質量分數為0.2％的氯化汞溶液消毒時，向氯化汞溶液中加入一滴吐溫-20。
(4)原球莖誘導培養：將上述消毒后的莖尖在解剖鏡下剝離成長度為0.3～0.5mm的莖段，接種成活率與莖段大小成正比關系，莖段小于0.2mm時，成活率不超過25％，所以本發明采用0.3～0.5mm的莖段，然后接種到誘導培養基中進行培養，所述誘導培養基為：B5培養基+0.3～0.7mg/L 6-BA+0.1～0.3mg/L IBA+0.2～0.3mg/L VC+0.05～0.15mg/L GA3，通過加入VC和GA3，能有效遏制培養材料的褐化，在誘導培養基中的培養時間為22～25d，培養溫度24～26℃，光照時間為12h/d，光照強度為1500～2000lx，經過22～25天的培養后莖尖頂端周圍開始出現白色晶瑩的小突起，并逐漸長大形成1至數個原球莖，這時再將培養材料整體移入新的誘導培養基中繼續培養，培養時間為15～20d，培養溫度24～26℃，光照時間為12h/d，光照強度為1500～2000lx，經過15～20天的繼續培養后，原球莖體積不斷增大，逐漸轉綠，在表面長出毛狀假根，此時可進行增殖繼代培養；
表2為誘導培養基成分及用量
作為優選，所述誘導培養基為：B5培養基+0.5mg/L 6-BA+0.2mg/L IBA+0.25mg/L VC+0.1mg/L GA3，即為表2中誘導培養基1的成分及用量；
(5)增殖繼代培養：將培養后的原球莖在無菌工作臺上進行分割，然后在接入到增殖培養基中繼續培養，所述增殖培養基為：B5培養基+0.8～1.5mg/L6-BA+0.1～0.3mg/L NAA+8～12％椰汁，培養條件：培養溫度24～26℃，光照時間為12h/d，光照強度為1500～2000lx；通過在增殖培養基中繼續培養，加快了原球莖的吸收，使原球莖體積和數量得到快速繁殖；
表3為增殖培養基成分及用量
作為優選，所述增殖培養基為：B5培養基+1mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+10％椰汁，即為表3中增殖培養基1的成分及用量；
(6)壯苗培養：增殖繼代培養后，選擇高2cm以上、基部有明顯突起的小苗轉入壯苗培養基中培養，所述壯苗培養基為：B5培養基+2～4mg/L NAA，培養時間為15～20d，培養溫度24～26℃，光照時間為13h/d，光照強度為1800～21000lx；培養時間結束后，再向壯苗培養基中加入0.3％活性炭，培養溫度27～29℃，光照時間為15h/d，光照強度為2500～3000lx；加入活性炭能模擬土壤黑暗環境有利于根系的生長，同時增加培養溫度和光照強度，試管苗邊分化邊生根。
(7)移栽：當試管苗生長至4～5cm高，根2～4條，葉1～2片時，將試管苗放在自然光下煉苗5～7天，打開瓶蓋煉苗1～2天；然后取出培養苗，用清水洗凈附著在根部的培養基，清洗時注意不要損害根部，然后移栽至水苔和腐殖土質量比為1:2的混合基質中，保持濕度和通風，空氣濕度為75～85％，溫度為20～25℃，移栽成活率達90％以上。采用本方法能使培養后的蕙蘭苗株發病率低，成苗率高，苗株品質好，栽培后適應性強，苗株長勢良好，通過生物技術手段在短時間內，滿足了商業化生產的需求，為企業規模化、產業化培養蕙蘭無毒苗提供了技術支持。
本發明并不限于上述實例，在本發明的權利要求書所限定的范圍內，本領域技術人員不經創造性勞動即可做出的各種變形或修改均受本專利的保護。