本發明涉及一種生物種質資源的保存方法，尤其涉及一種非洲菊種質資源的保存方法。
背景技術：
非洲菊是菊科大丁草屬的多年生宿根常綠草本花卉，為世界五大切花之一，因其花大、花艷、花色全且瓶插壽命長，深受人們歡迎，在我國種植范圍廣泛。
由于非洲菊大多自交不孕，雜交后代會分裂和變異，遺傳信息從親代傳給后代時由于栽培環境如光照、水分、溫度、營養等原因會導致非洲菊的品種退化，失去原有的典型性，通常表現為花朵變小、過渡色多、花形紊亂、花稈變細、抗性降低、花期縮短等。
現有技術中，非洲菊的一種常規繁殖方法是采用分株法，但其繁殖系數低，不能滿足大規模生產的需要，而且由于培養溫度、增殖芽的繼代代數以及激素濃度等因素易造成非洲菊種苗發生無性變異。
目前，非洲菊種質資源的保存大多以室內組培和田間栽培保存，室內組培保存的缺陷是繼代培養周期較短，保種花費相對較大；而田間栽培保存的缺陷為占地面積多，光、溫、水及病蟲害控制較難，多年栽培形成土壤板結、鹽漬化、病原菌大量積累，導致非洲菊品種失去原有的典型性。
技術實現要素：
基于現有技術的不足，本發明的目的是提供一種非洲菊種質資源的保存方法，能長時間保存非洲菊的種質資源。
具體步驟如下：
(1)花托外植體預處理：
選取直徑1～2cm的花蕾，在4℃環境中冷藏3～5天后，將花蕾取出自然恢復至室溫，剝去苞片和小花，用純凈水沖洗，先在0.05％的升汞水溶液中消毒5～8min，再用70％的酒精消毒20～40s，之后用無菌水沖洗3次，即得到非洲菊花托外植體。
以上涉及的百分比均為體積百分比。
(2)外植體接種及誘導培養：
將非洲菊花托外植體移入到滅菌后的第一培養基中，將溫度設定為23±1℃，以藍光燈為光源，光照強度控制為400～800Lx，光周期控制為光14h/暗10h，10天左右誘導出愈傷組織。
所述第一培養基的組成成分為：KNO3 800～1300mg/L，2-氨基-5-羧基戊酰胺800～1200mg/L，KH2PO4 300～450mg/L，CaCl2·2H2O 320～350mg/L，MgSO4·7H2O 180～240mg/L，EDTA 120～180mg/L，FeSO4·7H2O 30～50mg/L，MnSO4·4H2O 50～80mg/L，ZnSO4·7H2O 15～30mg/L，H3BO3 8～10mg/L，KI 5～10mg/L，Na2MoO4·2H2O 1～5mg/L，CoCl2·6H2O 0.2～0.5mg/L，4-碘苯氧乙酸0.15～0.20mg/L，肌醇30～80mg/L，甘氨酸0.5～1.0mg/L，維生素B1 0.5～0.75mg/L，維生素B6 1.0～1.5mg/L，煙酸1.0～1.5mg/L，蔗糖30～50g/L，瓊脂10～15g/L，激動素KT 0.5～1.0mg/L，萘乙酸NAA0.3～0.4mg/L，山梨醇50～70g/L，生物素0.15～0.20mg/L，鹽酸吡哆醇0.5～1.0mg/L，鹽酸硫胺素0.5～1.0mg/L，甲基亞硝基脲1.5～2.0mg/L，吲哚丁酸1.5～2.0mg/L，丙氨酸5～10mg/L，葉酸5～10mg/L，調環酸鈣1.5～2.0mg/L，秋水仙堿1.5～2.0mg/L，水解蛋白2.0～2.5g/L。
(3)轉移誘導培養：
將步驟(2)得到的愈傷組織轉移到第二培養基，溫度為27±1℃，以熒光燈為光源，光照強度控制為1800～2500Lx，光周期控制為光14h/暗10h，14天愈傷組織誘導出嫩芽。
所述第二培養基的組成成分在步驟(2)所述第一培養基基礎上添加了吲哚丁酸0.5～2.0mg/L和2,4-二氯苯氧乙酸丁酯1.5～2.0mg/L。
(4)種質離體保存：
將嫩芽從非洲菊花托外植體上完整地切下，轉移到第三培養基內慢速生長保存，保存環境為：溫度為4±1℃，以熒光燈為光源，光照強度控制為300～500Lx，光周期控制為光8h/暗16h。若保存期限超過12個月，則進行繼代培養1次，超過24個月，則進行繼代培養2次，依次類推。
所述第三培養基的組成成分為：KNO3 800～1300mg/L，2-氨基-5-羧基戊酰胺800～1200mg/L，KH2PO4 300～450mg/L，CaCl2·2H2O 320～350mg/L，MgSO4·7H2O 180～240mg/L，EDTA 120～180mg/L，FeSO4·7H2O 30～50mg/L，MnSO4·4H2O 50～80mg/L，ZnSO4·7H2O 15～30mg/L，H3BO3 8～10mg/L，KI 5～10mg/L，Na2MoO4·2H2O 1～5mg/L，CoCl2·6H2O 0.2～0.5mg/L，4-碘苯氧乙酸0.15～0.20mg/L，蔗糖30～50g/L，瓊脂10～15g/L，山梨醇50～70g/L，二甲基亞砜8～10mg/L、甘油10～15g/L，萘乙酸NAA0.3～0.4mg/L。
(5)恢復培養：
將步驟(4)的嫩芽轉移到第四培養基內，溫度為27±1℃，以熒光燈為光源，光照強度控制為1800～2500Lx，光周期控制為光14h/暗10h，培養至形成非洲菊幼苗。
所述第四培養基的組成成分在步驟(3)所述第二培養基基礎上添加了6-芐氨基嘌呤1.5～2.0mg/L。
(6)幼苗的馴化與煉苗：
將非洲菊幼苗移栽到煉苗基質中，并逐步轉移到外部環境中，在幼苗適應外部環境正常生長后，再移栽至普通土壤中正常培養。
所述逐步轉移到外部環境中的方法為：將非洲菊幼苗移栽到煉苗基質后，從誘導環境中逐天降低溫度并逐天增加光照強度，至與外部環境相同時，再培養2～3天即可移栽至普通土壤中，轉移過程的周期根據室外環境不同而調節，轉移過程的周期持續10～15天。
所述煉苗基質的組成成分為：珍珠巖、蛭石、鋸末、松樹皮、水苔、花泥、泥炭土以及鈣鎂磷鉀肥，質量比為1:0.5～1.5:0.2～0.8:0.2～0.8:0.1～0.5:0.05～0.15:0.05～0.15:0.005～0.015，優選質量比為1:1:0.5:0.5:0.3:0.1:0.1:0.01。
本發明涉及的一種非洲菊種質資源的保存方法，具有以下技術效果：
1、本發明顯著提高非洲菊種質資源的離體保存效率，恢復培養的平均成活率達到99.5％。
2、誘導愈傷組織階段用分段培養的方法，先采用藍光照射再采用熒光照射，二者的結合大大縮短了愈傷組織的愈傷分化時間，提高了愈傷組織的形成數量與效率。
3、本發明優化了種質離體保存培養基配方，使現有技術對接種組織種質的一次保存期限由現有技術的6～8個月提高到12個月以上，并且通過保存期內的繼代培養大大提高了非洲菊種質資源的保存時限。
具體實施方式
下面通過具體實施例，進一步對本發明的技術方案進行具體說明。應該理解，下面的實施例只是作為具體說明，而不限制本發明的范圍，同時本領域的技術人員根據本發明所做的顯而易見的改變和修飾也包含在本發明范圍之內。
實施例1
一種非洲菊種質資源的保存方法，具體步驟如下：
(1)花托外植體預處理：
選取直徑1～2cm的花蕾，在4℃環境中冷藏3天后，將花蕾取出自然恢復至室溫，剝去苞片和小花，用純凈水沖洗，先在0.05％的升汞水溶液中消毒5min，再用70％的酒精消毒30s，之后用無菌水沖洗3次，即得到非洲菊花托外植體。
(2)外植體接種及誘導培養：
將非洲菊花托外植體移入到滅菌后的第一培養基中，將溫度設定為23±1℃，以藍光燈為光源，光照強度控制為600Lx，光周期控制為光14h/暗10h，10天左右誘導出愈傷組織。
所述第一培養基的組成成分為：KNO3 900mg/L，2-氨基-5-羧基戊酰胺1000mg/L，KH2PO4 360mg/L，CaCl2·2H2O 340mg/L，MgSO4·7H2O 190mg/L，EDTA 150mg/L，FeSO4·7H2O 40mg/L，MnSO4·4H2O 60mg/L，ZnSO4·7H2O 20mg/L，H3BO3 9mg/L，KI 8mg/L，Na2MoO4·2H2O 3mg/L，CoCl2·6H2O 0.3mg/L，4-碘苯氧乙酸0.18mg/L，肌醇50mg/L，甘氨酸0.8mg/L，維生素B1 0.65mg/L，維生素B6 1.3mg/L，煙酸1.1mg/L，蔗糖40g/L，瓊脂12g/L，激動素KT 0.8mg/L，萘乙酸NAA0.35mg/L，山梨醇60g/L，生物素0.18mg/L，鹽酸吡哆醇0.8mg/L，鹽酸硫胺素0.8mg/L，甲基亞硝基脲1.6mg/L，吲哚丁酸1.6mg/L，丙氨8mg/L，葉酸8mg/L，調環酸鈣1.7mg/L，秋水仙堿1.8mg/L，水解蛋白2.2g/L。
(3)轉移誘導培養：
將步驟(2)得到的愈傷組織轉移到第二培養基，溫度為27±1℃，以熒光燈為光源，光照強度控制為1800～2500Lx，光周期控制為光14h/暗10h，14天愈傷組織誘導出嫩芽。
所述第二培養基的組成成分在步驟(2)所述第一培養基基礎上添加了吲哚丁酸1.5mg/L和2，4-二氯苯氧乙酸丁酯1.8mg/L。
(4)種質離體保存：
將嫩芽從非洲菊花托外植體上完整地切下，轉移到第三培養基內慢速生長保存，保存環境為：溫度為4±1℃，以熒光燈為光源，光照強度控制為400Lx，光周期控制為光8h/暗16h。保存期限超過12個月，進行繼代培養1次。
所述第三培養基的組成成分為：KNO3 900mg/L，2-氨基-5-羧基戊酰胺1000mg/L，KH2PO4 360mg/L，CaCl2·2H2O 340mg/L，MgSO4·7H2O 190mg/L，EDTA 150mg/L，FeSO4·7H2O 40mg/L，MnSO4·4H2O 60mg/L，ZnSO4·7H2O 20mg/L，H3BO3 9mg/L，KI 8mg/L，Na2MoO4·2H2O 3mg/L，CoCl2·6H2O 0.3mg/L，4-碘苯氧乙酸0.18mg/L，蔗糖40g/L，瓊脂12g/L，山梨醇60g/L，二甲基亞砜9mg/L、甘油12g/L，萘乙酸NAA0.35mg/L。
(5)恢復培養：
轉移到第四培養基內，溫度為27±1℃，以熒光燈為光源，光照強度控制為1800～2500Lx，光周期控制為光14h/暗10h，培養至形成非洲菊幼苗。
所述第四培養基的組成成分在步驟(3)所述第二培養基基礎上添加了6-芐氨基嘌呤1.8mg/L。
(6)幼苗的馴化與煉苗：
將非洲菊幼苗移栽到煉苗基質后，從誘導環境中每天降低溫度1℃，光照強度每天增加300Lx，至與外部環境相同時，再培養2～3天即可移栽至普通土壤中。
所述煉苗基質的組成成分為：珍珠巖、蛭石、鋸末、松樹皮、水苔、花泥、泥炭土以及鈣鎂磷鉀肥，其質量比為1:1:0.5:0.5:0.3:0.1:0.1:0.01。
實施例2
一種非洲菊種質資源的保存方法，具體步驟如下：
(1)花托外植體預處理：
選取直徑1～2cm的花蕾，在4℃環境中冷藏3天后，將花蕾取出自然恢復至室溫，剝去苞片和小花，用純凈水沖洗，先在0.05％的升汞水溶液中消毒5min，再用70％的酒精消毒20s，之后用無菌水沖洗3次，即得到非洲菊花托外植體。
以上涉及的百分比均為體積百分比。
(2)外植體接種及誘導培養：
將非洲菊花托外植體移入到滅菌后的第一培養基中，將溫度設定為23±1℃，以藍光燈為光源，光照強度控制為400Lx，光周期控制為光14h/暗10h，10天左右誘導出愈傷組織。
所述第一培養基的組成成分為：KNO3 800mg/L，2-氨基-5-羧基戊酰胺800mg/L，KH2PO4 300mg/L，CaCl2·2H2O 320mg/L，MgSO4·7H2O 180mg/L，EDTA 120mg/L，FeSO4·7H2O 30mg/L，MnSO4·4H2O 50mg/L，ZnSO4·7H2O 15mg/L，H3BO3 8mg/L，KI 5mg/L，Na2MoO4·2H2O 1mg/L，CoCl2·6H2O 0.2mg/L，4-碘苯氧乙酸0.15mg/L，肌醇30mg/L，甘氨酸0.5mg/L，維生素B1 0.5mg/L，維生素B6 1.0mg/L，煙酸1.0mg/L，蔗糖30g/L，瓊脂10g/L，激動素KT 0.5mg/L，萘乙酸NAA0.3mg/L，山梨醇50g/L，生物素0.15mg/L，鹽酸吡哆醇0.5mg/L，鹽酸硫胺素0.5mg/L，甲基亞硝基脲1.5mg/L，吲哚丁酸1.5mg/L，丙氨酸5mg/L，葉酸5mg/L，調環酸鈣1.5mg/L，秋水仙堿1.5mg/L，水解蛋白2.0g/L。
(3)轉移誘導培養：
將步驟(2)得到的愈傷組織轉移到第二培養基，溫度為27±1℃，以熒光燈為光源，光照強度控制為1800Lx，光周期控制為光14h/暗10h，14天愈傷組織誘導出嫩芽。
所述第二培養基的組成成分在步驟(2)所述第一培養基基礎上添加了吲哚丁酸0.5mg/L和2,4-二氯苯氧乙酸丁酯1.5mg/L。
(4)種質離體保存：
將嫩芽從非洲菊花托外植體上完整地切下，轉移到第三培養基內慢速生長保存，保存環境為：溫度為4±1℃，以熒光燈為光源，光照強度控制為300～500Lx，光周期控制為光8h/暗16h。
所述第三培養基的組成成分為：KNO3 800mg/L，2-氨基-5-羧基戊酰胺800mg/L，KH2PO4 300mg/L，CaCl2·2H2O 320mg/L，MgSO4·7H2O 180mg/L，EDTA 120mg/L，FeSO4·7H2O 30mg/L，MnSO4·4H2O 50mg/L，ZnSO4·7H2O 15mg/L，H3BO3 8mg/L，KI 5mg/L，Na2MoO4·2H2O 1mg/L，CoCl2·6H2O 0.2mg/L，4-碘苯氧乙酸0.15mg/L，蔗糖30g/L，瓊脂10g/L，山梨醇50g/L，二甲基亞砜8mg/L、甘油10g/L，萘乙酸NAA0.3mg/L。
(5)恢復培養：
轉移到第四培養基內，溫度為27±1℃，以熒光燈為光源，光照強度控制為1800Lx，光周期控制為光14h/暗10h，培養至形成非洲菊幼苗。
所述第四培養基的組成成分在步驟(3)所述第二培養基基礎上添加了6-芐氨基嘌呤1.5mg/L。
(6)幼苗的馴化與煉苗：
將非洲菊幼苗移栽到煉苗基質中，并逐步轉移到外部環境中，在幼苗適應外部環境正常生長后，再移栽至普通土壤中正常培養。
所述逐步轉移到外部環境中的方法為：將非洲菊幼苗移栽到煉苗基質后，從誘導環境中每天降低溫度1.5℃，光照強度每天增加400Lx，至與外部環境相同時，再培養2天即可移栽至普通土壤中。
所述煉苗基質的組成成分為：珍珠巖、蛭石、鋸末、松樹皮、水苔、花泥、泥炭土以及鈣鎂磷鉀肥，質量比為1:0.5:0.2:0.2:0.1:0.05:0.05:0.005。
實施例3
一種非洲菊種質資源的保存方法，具體步驟如下：
(1)花托外植體預處理：
選取直徑2cm的花蕾，在4℃環境中冷藏5天后，將花蕾取出自然恢復至室溫，剝去苞片和小花，用純凈水沖洗，先在0.05％的升汞水溶液中消毒8min，再用70％的酒精消毒40s，之后用無菌水沖洗3次，即得到非洲菊花托外植體。
以上涉及的百分比均為體積百分比。
(2)外植體接種及誘導培養：
將非洲菊花托外植體移入到滅菌后的第一培養基中，將溫度設定為23±1℃，以藍光燈為光源，光照強度控制為800Lx，光周期控制為光14h/暗10h，10天左右誘導出愈傷組織。
所述第一培養基的組成成分為：KNO3 1300mg/L，2-氨基-5-羧基戊酰胺1200mg/L，KH2PO4 450mg/L，CaCl2·2H2O 350mg/L，MgSO4·7H2O 240mg/L，EDTA 180mg/L，FeSO4·7H2O 50mg/L，MnSO4·4H2O 80mg/L，ZnSO4·7H2O 30mg/L，H3BO3 10mg/L，KI 10mg/L，Na2MoO4·2H2O 5mg/L，CoCl2·6H2O 0.5mg/L，4-碘苯氧乙酸0.20mg/L，肌醇80mg/L，甘氨酸1.0mg/L，維生素B1 0.75mg/L，維生素B6 1.5mg/L，煙酸1.5mg/L，蔗糖50g/L，瓊脂15g/L，激動素KT 1.0mg/L，萘乙酸NAA 0.4mg/L，山梨醇70g/L，生物素0.20mg/L，鹽酸吡哆醇1.0mg/L，鹽酸硫胺素1.0mg/L，甲基亞硝基脲2.0mg/L，吲哚丁酸2.0mg/L，丙氨酸10mg/L，葉酸10mg/L，調環酸鈣2.0mg/L，秋水仙堿2.0mg/L，水解蛋白2.5g/L。
(3)轉移誘導培養：
將步驟(2)得到的愈傷組織轉移到第二培養基，溫度為27±1℃，以熒光燈為光源，光照強度控制為2500Lx，光周期控制為光14h/暗10h，14天愈傷組織誘導出嫩芽。
所述第二培養基的組成成分在步驟(2)所述第一培養基基礎上添加了吲哚丁酸2.0mg/L和2,4-二氯苯氧乙酸丁酯2.0mg/L。
(4)種質離體保存：
將嫩芽從非洲菊花托外植體上完整地切下，轉移到第三培養基內慢速生長保存，保存環境為：溫度為4±1℃，以熒光燈為光源，光照強度控制為300～500Lx，光周期控制為光8h/暗16h。
所述第三培養基的組成成分為：KNO3 1300mg/L，2-氨基-5-羧基戊酰胺1200mg/L，KH2PO4 450mg/L，CaCl2·2H2O 350mg/L，MgSO4·7H2O 240mg/L，EDTA 180mg/L，FeSO4·7H2O 50mg/L，MnSO4·4H2O 80mg/L，ZnSO4·7H2O 30mg/L，H3BO3 10mg/L，KI 10mg/L，Na2MoO4·2H2O 5mg/L，CoCl2·6H2O 0.5mg/L，4-碘苯氧乙酸0.20mg/L，蔗糖50g/L，瓊脂15g/L，山梨醇70g/L，二甲基亞砜10mg/L、甘油15g/L，萘乙酸NAA 0.4mg/L。
(5)恢復培養：
轉移到第四培養基內，溫度為27±1℃，以熒光燈為光源，光照強度控制為2500Lx，光周期控制為光14h/暗10h，培養至形成非洲菊幼苗。
所述第四培養基的組成成分在步驟(3)所述第二培養基基礎上添加了6-芐氨基嘌呤2.0mg/L。
(6)幼苗的馴化與煉苗：
將非洲菊幼苗移栽到煉苗基質中，并逐步轉移到外部環境中，在幼苗適應外部環境正常生長后，再移栽至普通土壤中正常培養。
所述逐步轉移到外部環境中的方法為：將非洲菊幼苗移栽到煉苗基質后，從誘導環境中逐天降低溫度并逐天增加光照強度，至與外部環境相同時，再培養3天即可移栽至普通土壤中，轉移過程的周期根據室外環境不同而調節，轉移過程的周期持續15天。
所述煉苗基質的組成成分為：珍珠巖100g、蛭石150g、鋸末80g、松樹皮80g、水苔50g、花泥15g、泥炭土15g以及鈣鎂磷鉀肥1.5g。