本發(fā)明涉及一種植物組織培養(yǎng)技術領域，尤其涉及一種半楓荷種子萌發(fā)途徑的組培快繁方法。

背景技術：

半楓荷(Semiliquidambar cathayensis H.T.Chang)為金縷梅科半楓荷屬植物,為1962年發(fā)表的新屬半楓荷屬的模式種,我國特有種。該種在學術研究、中醫(yī)藥用以及園林應用等很多方面都具有極高的價值。但由于不合理的開發(fā)利用,其資源破壞嚴重。半楓荷在1987年國家環(huán)境保護局等頒布的《中國珍稀瀕危保護植物名錄(第一冊)》中,被列為國家三級重點級保護植物^[2]；在1992年傅立國主編的的《中國植物紅皮書-稀有瀕危植物》中被列為稀有種^[3]；在國務院1999年8月4日頒布的《國家重點保護野生植物名錄(第一批)》中提升為國家Ⅱ級保護植物。2003年在汪松、解焱主編的《中國物種紅色名錄》中,專家根據相關資料,推測半楓荷在過去3個世代內致危因素沒有停止,種群至少減少30％,因此將半楓荷列入易危等級,在未來一段時間內其種群面臨絕滅的幾率較高^[5]。

半楓荷藥用價值：半楓荷是一種珍貴的藥用植物，根、枝、樹皮都可入藥，能活血通絡，祛風除濕，可以治療風濕性關節(jié)炎，腰肌勞損，半身不遂，跌打瘀積、腫痛、產后風癱，外傷常用于止血，是產區(qū)群眾常用的中藥。目前，半楓荷作為重要的中藥已得到了廣泛的重視和開發(fā)。如半楓荷散、中藥巴布劑、半楓荷類注射液、苗嶺骨力膠囊等。

藥用半楓荷種類鑒別：在我國不同地方，叫“半楓荷”并作藥用的植物共有6科8屬15種，如五加科的楓荷桂(Dendvopanax dentigerus)，梧桐科的翻白葉樹(Pterospermum heterophyllum)，以及樟科的檫樹(Sassafras tzumu)，效用和金縷梅科的半楓荷相同，都是用根、莖或樹皮入藥，但金縷梅科的半楓荷(Semiliquidambar cathayensis H.T.Chang)功效最佳^[9-10]。

2.半楓荷現有組織培養(yǎng)技術情況

在半楓荷組織培養(yǎng)方面，陳世紅等^[11]采用單因子比較和均勻設計法，分別研究了影響半楓荷愈傷組織誘導和生長的各種因素。試驗結果表明：葉片愈傷組織誘導率高于莖段；愈傷組織誘導的最適基本培養(yǎng)基為MS，生長的最適培養(yǎng)基為：MS+6-BA2.0mg/L+NNA1.0mg/L+蔗糖3％，暗培養(yǎng)對愈傷組織生長極為有利，在生根培養(yǎng)基上誘導生根，但多次試驗均未見不定根發(fā)生。

李國楨等^[12]采用均勻設計和單因子比較法，考察不同基本培養(yǎng)基，光照條件，蔗糖濃度，以及不同激素種類、濃度和組合對半楓荷愈傷組織誘導、繼代培養(yǎng)和再分化的影響。實驗結果表明：葉片愈傷組織誘導率高于莖段。愈傷組織誘導的最適基本培養(yǎng)基為MS，生長的最適培養(yǎng)基為：MS+6-BA1.0mg/L+NAA1.0mg/L+蔗糖3％。黑暗培養(yǎng)對愈傷組織生長極為有利。但生根培養(yǎng)基上誘導生根，但經多次試驗均未見不定根發(fā)生。

胡剛等瀕危植物半楓荷Semiliquidambar cathayensis組織培養(yǎng)快繁技術研究，以當年生半楓荷帶腋芽的莖段和幼葉作為外植體，開展組織培養(yǎng)。研究結果表明：半楓荷葉片在初代培養(yǎng)基：MS+BA2.0mg/L+NNA0.5mg/L上，愈傷組織誘導率為92％，芽誘導率為16.7％，腋芽在初代培養(yǎng)基：MS+BA1.0mg/L+NNA0.1mg/L上，腋芽誘導率為58％，莖段能直接誘導出芽是半楓荷快繁的主要外植體。新生芽在繼代增殖培養(yǎng)基：MS+BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L上，芽增殖系數為3.93，增殖培養(yǎng)基：MS+BA(1～0.5mg)/L+NAA(0.01～0.05mg)/L，較好叢生芽生根培養(yǎng)基以1/2WPM+NAA2mg/L+活性碳0.2％為宜。生根率可達到90％以上。松林腐殖土+珍珠巖(4：1)比較適合半楓荷的生長移栽成活率100％，苗木長勢好，葉綠色，可提供半楓荷優(yōu)質種苗。

3.現有組織培養(yǎng)技術的不足

半楓荷對生態(tài)環(huán)境的要求比較苛刻，其自然繁殖率較低，加上人們長期的過量采挖，野生資源已經極度枯竭。面對這樣嚴峻的形式，可見對半楓荷的人工繁殖問題的研究是極其的重要。植物組織無菌培養(yǎng)方法是尋求解決半楓荷資源枯竭、保護其優(yōu)良品種的有效途徑。近年來，人們對半楓荷的藥用成分及價值的研究日益增多，目前對半楓荷從種子萌發(fā)，到增殖壯苗生根的完整流程的無菌組織培養(yǎng)研究還未見報道，組培無菌培養(yǎng)快速繁殖方面多以莖段和葉片為外植體誘導。

技術實現要素：

本發(fā)明的目的是提供一種快速的、增值率高、成活率高的半楓荷的完整的組織培養(yǎng)方法。

本發(fā)明的技術方案為：一種半楓荷種子萌發(fā)途徑的組培快繁方法，包括以下步驟：

步驟1、無菌材料的建立：取半楓荷蒴果晾曬后取種子進行無菌處理；

步驟2、種子萌發(fā)培養(yǎng)：將步驟1處理后的種子消毒后接種于培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到萌發(fā)的種子；

步驟3、誘導愈傷組織：將步驟2處理后的萌發(fā)的種子的下胚軸作為誘導材料，剪切成莖段后，接種于培養(yǎng)基中，培養(yǎng)得到愈傷組織；

步驟4、愈傷組織增殖：將步驟3得到的愈傷組織轉接到培養(yǎng)基中，進行增殖培養(yǎng)；

步驟5、愈傷組織分化，將步驟4增殖后的愈傷組織切成塊狀物轉入培養(yǎng)基培養(yǎng)，得到具有真葉的組織；

步驟6、叢生芽誘導，將步驟5中的真葉剪下后接種到培養(yǎng)基中，得到分化的叢生芽；

步驟7、將步驟6得到的分化的叢生芽剪去基部后，接種于培養(yǎng)基中，得到壯苗；

步驟8：將步驟7得到的壯苗剪去基部后，接種于培養(yǎng)基中，進行生根培養(yǎng)。

在上述的半楓荷種子萌發(fā)途徑的組培快繁方法中，所述的步驟2中的培養(yǎng)基包括以下組分：改良MS培養(yǎng)基、GA₃0.2～0.8mg/L、VB₂1.0～5.0mg/L、白糖30g/L、瓊脂3.6g/L；

所述的步驟2的培養(yǎng)溫度為25～27℃，光照強度為1500～2000lx、光照時間為10小時/天。

在上述的半楓荷種子萌發(fā)途徑的組培快繁方法中，所述的步驟3中的培養(yǎng)基包括以下組分：改良MS培養(yǎng)基、6-BA0.5mg/L、2,4-D0.2～0.5mg/L、VB₂1.0～6.0mg/L、白糖30g/L、瓊脂3.6g/L；

所述的步驟3的培養(yǎng)溫度為25～27℃，光照強度為1500～2000lx、光照時間為10小時/天。

在上述的半楓荷種子萌發(fā)途徑的組培快繁方法中，所述的步驟4中的培養(yǎng)基包括以下組分：改良MS培養(yǎng)基、6-BA0.3～0.5mg/L、NAA0.05～0.4mg/L、VB₂1.0～3.0mg/L、白糖30g/L、瓊脂3.6g/L；

所述的步驟4的培養(yǎng)溫度為25～27℃，光照強度為1500～2000lx、光照時間為10小時/天。

在上述的半楓荷種子萌發(fā)途徑的組培快繁方法中，所述的步驟5中的培養(yǎng)基包括以下組分：改良MS培養(yǎng)基、6-BA0.03～0.08mg/L、NAA0.05～0.3mg/L、土白糖30g/L、瓊脂3.6g/L；

所述的步驟5的培養(yǎng)溫度為24～28℃、光照強度為2000～3000lx、光照時間為10小時/天。

在上述的半楓荷種子萌發(fā)途徑的組培快繁方法中，所述的步驟6中的培養(yǎng)基包括以下組分：改良MS培養(yǎng)基、6-BA0.5～0.8mg/L、NAA0.1～0.3mg/L、VB₂ 1.0～5.0mg/L、白糖30g/L、瓊脂3.6g/L；

所述的步驟6的光照強度為1500～2000lx，每天光照培養(yǎng)12小時。

在上述的半楓荷種子萌發(fā)途徑的組培快繁方法中，所述的步驟7中的培養(yǎng)基包括以下組分：改良MS培養(yǎng)基、NAA1.0～2.0mg/L、6-BA0.1～1.0mg/L、VB₂2.0mg/L、GA₃1.0mg/L、蔗糖30g/L、瓊脂3.6g/L；

所述的步驟7的光照強度為2000～3000lx，每天光照培養(yǎng)12小時。

在上述的半楓荷種子萌發(fā)途徑的組培快繁方法中，所述的步驟8中的培養(yǎng)基包括以下組分：1/2改良MS培養(yǎng)基、NAA1.0mg/L、IBA1.0mg/L、GA₃2.0mg/L、蔗糖30g/L、瓊脂3.6g/L；

所述的步驟8的光照強度為2000～3000lx，光照培養(yǎng)12小時。

在上述的半楓荷種子萌發(fā)途徑的組培快繁方法中，所述的改良MS培養(yǎng)基中NH₄NO₃含量為340mg/L、KNO₃含量為1318mg/L。

在上述的半楓荷種子萌發(fā)途徑的組培快繁方法中，所述的1/2改良MS培養(yǎng)基中包含：

NH₄NO₃ 170mg/L；

KNO₃ 659mg/L；

MgSO₄·7H₂O 185mg/L；

KH₂PO₄ 85mg/L；

CaCl₂·2H₂O 220mg/L；

MnSO₄·4H₂O 22.3mg/L；

ZnSO₄·7H₂O 8.6mg/L；

H3BO3 6.2mg/L；

KI 0.83mg/L；

Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg/L；

CuSO₄·5H₂O 0.025mg/L；

CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L；

FeSO₄·7H₂O 27.8mg/L；

Na₂-EDTA·2H₂O 37.3mg/L；

甘氨酸2.0mg/L；

鹽酸硫胺素0.1mg/L；

鹽酸吡哆醇0.5mg/L；

IV B煙酸0.5mg/L；

肌醇100mg/L。

本發(fā)明的有益效果如下：

本發(fā)明在以種子為外植體，對半楓荷進行研究的基礎上，通過對種子苗的大量增殖形成的叢生芽，使叢生芽在不同因素影響下進行壯苗生根，以期增強試管苗生命活力，以縮短適應外界環(huán)境時間從而提高成活率。

本發(fā)明的完整的技術路線為：以種子為外植體誘導愈傷組織愈傷組織增殖、叢生芽誘導、最后通過壯苗與生根培養(yǎng)而建立起半楓荷完整的快繁體系。

本發(fā)明的誘導率是用種子萌發(fā)為種苗的，誘導率達到93％。誘導種苗形成直徑大小在0.8～1.6cm的淺綠色愈傷組織，經愈傷組織增殖培養(yǎng)基使其增殖系數達到10.8。誘導叢生芽并使其增值系數達到7.9。苗高3.0～4.0cm，壯苗率100％(壯苗率(％)＝(壯苗株數/接種株數)x100％)^[14]。生根率為94.6％。利用此方法可以快速地培育出大量的半楓荷組培苗，從而有效地保護和繁殖該物種，滿足市場對半楓荷的需求。

附圖說明

圖1和2為實施例1的種子萌發(fā)培養(yǎng)結果；

圖3和4為實施例1的愈傷組織誘導與增值結果；

圖5和6為實施例1的愈傷組織分化結果；

圖7和8為實施例1的叢生芽誘導結果；

圖9、10和11為實施例1的壯苗培養(yǎng)結果；

圖12、13、14和15為實施例1的生根培養(yǎng)結果。

具體實施方式

下面結合具體實施方式，對本發(fā)明的技術方案作進一步的詳細說明，但不構成對本發(fā)明的任何限制。

實施例1

一種半楓荷種子萌發(fā)途徑的組織培養(yǎng)

(1)半楓荷種子的萌發(fā)培養(yǎng)：將取于廣西防城港那勤的成熟的野生半楓荷蒴果，將成熟的半楓荷蒴果，晾曬到九成干后取出種子，作為外植體原材料；將選取好的種子用洗潔精清洗，置于超凈工作臺上，再用0.1％的次氯酸鈉原液浸泡5～7min，然后用無菌水沖洗5～8次；將外植體消毒后接種于無菌誘導培養(yǎng)基中，在溫度為25～27℃、光照強度為1500～2000lx、光照時間為10小時/天的條件下培養(yǎng)，15天種子萌發(fā)率達到77％，30天后萌發(fā)率達到93％。見附圖1和圖2。

種子萌發(fā)培養(yǎng)基為：

B1：改良MS+GA₃0.2mg/L+VB₂1.0mg/L+白糖30g/L+瓊脂3.6g/L；

B2：改良MS+GA₃0.5mg/L+VB₂1.0mg/L+白糖30g/L+瓊脂3.6g/L；

B3：改良MS+GA₃0.8mg/L+VB₂2.0mg/L+白糖30g/L+瓊脂3.6g/L；

B4：改良MS+GA₃0.8mg/L+VB₂3.5mg/L+白糖30g/L+瓊脂3.6g/L；

(2)半楓荷愈傷組織的誘導與增值：選取半楓荷種子萌發(fā)后的下胚軸作為誘導材料，剪切成1.5～2.0cm的莖段后，接種于無菌誘導培養(yǎng)基中在溫度為25～27℃、光照強度為1500～2000lx、光照時間為10小時/天的條件下培養(yǎng)20～30天，形成直徑大小在0.8～1.6cm的淺綠色的愈傷組織；將生長良好的愈傷組織轉接入增殖培養(yǎng)基中，進行增殖培養(yǎng)培養(yǎng)的環(huán)境條件為：溫度25～27℃、光照1500～2000lx、光照時間10小時/天。45天增殖系數達到10.8，愈傷組織顏色深綠。見附圖3和4。

誘導愈傷組織培養(yǎng)成分：

B5：改良MS+6-BA0.5mg/L+2,4-D0.2mg/L+VB₂1.0mg/L+白糖30g/L+瓊脂3.6g/L；

B6：改良MS+6-BA0.5mg/L+2,4-D0.2mg/L+VB₂6.0mg/L+白糖30g/L+瓊脂3.6g/L；

B7：改良MS+6-BA0.5mg/L+2,4-D0.5mg/L+VB₂1.0mg/L+白糖30g/L+瓊脂3.6g/L；

B8：改良MS+6-BA0.5mg/L+2,4-D0.5mg/L+VB₂6.0mg/L+白糖30g/L+瓊脂3.6g/L；

B9：改良MS+6-BA0.5mg/L+2,4-D0.2mg/L+VB₂3.0mg/L+白糖30g/L+瓊脂3.6g/L；

誘導愈傷組織增值培養(yǎng)基成分：

B10：改良MS+6-BA0.3mg/L+NAA0.05mg/L+VB₂2.0mg/L+白糖30g/L+瓊脂3.6g/L；

B11：改良MS+6-BA0.3mg/L+NAA0.1mg/L+VB₂3.0mg/L+白糖30g/L+瓊脂3.6g/L；

B12：改良MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.3mg/L+VB₂1.0mg/L+白糖30g/L+瓊脂3.6g/L；

B13：改良MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.4mg/L+VB₂2.0mg/L+白糖30g/L+瓊脂3.6g/L；

(3)半楓荷愈傷組織的分化。將愈傷組織切成1.0cm²大小的塊狀物轉入分化培養(yǎng)基中，在溫度為24～28℃、光照強度為2000～3000lx、光照時間為10小時/天的條件下，培養(yǎng)45～60天，愈傷組織先是長出根部，在根長到2.0cm左右開始長出芽部分，45天后芽高約1.5cm，真葉2-4片；見附圖5和6。

B14：改良MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+VB₂2.0mg/L+白糖30g/L+瓊脂3.6g/L；

B15：改良MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.3mg/L+VB₂3.0mg/L+白糖30g/L+瓊脂3.6g/L；

B16：改良MS+6-BA0.8mg/L+NAA0.1mg/L+VB₂4.0mg/L+白糖30g/L+瓊脂3.6g/L；

B17：改良MS+6-BA0.8mg/L+NAA0.3mg/L+VB₂5.0mg/L+白糖30g/L+瓊脂3.6g/L；

(4)半楓荷叢生芽誘導。種子萌發(fā)30天后，一般已長出2～4片真葉，即可將其帶節(jié)的莖剪下接到誘導叢生芽增殖的培養(yǎng)基中，并置于光照強度為1500～2000lx下培養(yǎng)，每天光照培養(yǎng)12小時；培養(yǎng)30-40天后植株高約3.0～5.0cm，增殖系數為2.8。見附圖7和圖8。

叢生芽誘導培養(yǎng)基成分：

B18：改良MS+6-BA0.05mg/L+NAA0.1mg/L+VB₂2.0mg/L+白糖30g/L+瓊脂3.6g/L；

B19：改良MS+6-BA0.05mg/L+NAA0.3mg/L+VB₂ 25mg/L+白糖30g/L+瓊脂3.6g/L；

B20：改良MS+6-BA0.08mg/L+NAA0.1mg/L+VB₂ 1.0mg/L+白糖30g/L+瓊脂3.6g/L；

B21：改良MS+6-BA0.08mg/L+NAA0.3mg/L+VB₂3.5mg/L+白糖30g/L+瓊脂3.6g/L；

(5)半楓荷壯苗培養(yǎng)：將經分化的叢生芽剪去基部，接種于下面壯苗培養(yǎng)基中：并置于光照強度為2000～3000lx下培養(yǎng)，每天光照培養(yǎng)12小時；培養(yǎng)30-40天后植株高約3.0～4.0cm，根數4～6條，根長2～3cm。見附圖9、圖10、圖11。

壯苗培養(yǎng)基：

B22：改良MS+NAA1.0mg/L+6-BA0.5mg/L+VB₂2.0mg/L+GA₃1.0mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂3.6g/L；

B23：改良MS+NAA1.5mg/L+6-BA0.1mg/L+VB₂2.0mg/L+GA₃1.0mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂3.6g/L；

B24：改良MS+NAA2.0mg/L+6-BA0.1mg/L+VB₂2.0mg/L+GA₃1.0mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂3.6g/L；

B25：改良MS+NAA2.0mg/L+6-BA1.0mg/L+VB₂2.0mg/L+GA₃1.0mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂3.6g/L；

(6)半楓荷生根培養(yǎng)：將經壯苗后的植株剪去基部接種于生根培養(yǎng)基中：并置于光照強度為2000～3000lx下培養(yǎng)，每天光照培養(yǎng)12小時；培養(yǎng)30～40天后植株高約3.0～4.0cm，80％出根，根數4～6條，根長2～3cm。見附圖12、圖13、圖14、圖15。

生根培養(yǎng)基成分：

B26：1/2改良MS+NAA1.0mg/L+IBA1.0mg/L+GA₃2.0mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂4g/L；

B27：1/2改良MS+NAA2.0mg/L+IBA1.0mg/L+GA₃2.0mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂4g/L；

B28：1/2改良MS+NAA1.0mg/L+IBA2.0mg/L+GA₃2.0mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂4g/L；

B29：1/2改良MS+NAA2.0mg/L+IBA2.0mg/L+GA₃2.5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂4g/L；

表1、表2和表3示出了改良MS、1/2改良MS、MS的組分。

表1改良MS

表2 1/2改良MS

表3MS

以上所述的僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡在本發(fā)明的精神和原則范圍內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。