本發明涉及一種氧化石墨烯-納米銀復合抗菌劑的制備方法，具體是一種在水溶液中利用自組裝將O-羧甲基殼聚糖包裹納米銀均勻負載在氧化石墨烯表面的制備方法。

背景技術：

利用抗菌劑來抑制和殺滅有害細菌是提高人類健康水平的一個重要方法，傳統的抗菌劑，如抗生素、季銨鹽等不但會導致微生物的耐藥性，還會造成嚴重的環境污染。納米銀由于具有較好的廣譜抗菌性、不易產生耐藥性等特點已逐步應用于生物醫學及臨床等相關領域。然而納米銀具有易團聚、易氧化及水溶性差等特點，使得其進一步應用受到限制。氧化石墨烯是一種準二維片層狀碳質材料，其表面還含有較多的含氧官能團如羰基、羧基、羥基等。這些官能團的存在不僅使氧化石墨烯能夠均勻的分散，而且為氧化石墨烯納米銀復合材料的形成提供了有利的結合位點，因此氧化石墨烯是一種理想的納米銀載體材料。

目前在已有的氧化石墨烯-納米銀抗菌劑大多采用銀鹽的絡合反應或氧化石墨烯銀離子混合液加還原劑還原的方法來制備。制備過程中含有大量的硝酸根、鹽酸根及各種有機物等有毒物質，制造出來的納米銀溶液毒性很大，應用領域受到限制。

例如，公布號為CN105772739A的“一種石墨烯/納米銀復合抗菌材料的制備方法”的發明專利，該專利將吸附有銀離子的氧化石墨烯放入還原劑溶液中加熱處理，離心分離即得石墨烯/納米銀復合材料。但是該專利在制備過程中使用毒性較高的乙醛酸作為還原劑，使得在醫用材料應用方面受到限制，易對人體健康產生威脅，同時制備過程中長時間的加熱導致耗能過大。

技術實現要素：

針對目前現有技術的不足，本發明所要解決的技術問題在于提出一種低毒、安全和耗能小的殼聚糖包裹納米銀氧化石墨烯復合抗菌材料的制備方法。

上述目的是通過以下技術方案來實現的。

一種殼聚糖包裹納米銀氧化石墨烯復合抗菌材料的制備方法，所述制備方法是按下列步驟進行的：

(1) 將0.1%wt的硝酸銀溶液與0.1%wt 的O-羧甲基殼聚糖溶液按體積比為20:80-1:99進行混合，室溫攪拌0.5-1h；

(2) 將上述混合溶液置于4mL石英比色皿中，通氮氣20s除盡空氣并密封；

(3) 將石英比色皿置于272nm紫外燈5cm處照射15min，紫外燈功率20w；

(4) 將混合溶液中加入一倍體積無水乙醇在14000r/min轉速下離心60min取沉淀，并用50%wt乙醇離心洗滌兩次；

(5) 沉淀再次溶于超純水，并超聲處理5-10min，即得O-羧甲基殼聚糖包裹納米銀分散液；

(6) O-羧甲基殼聚糖包裹納米銀分散液與氧化石墨烯分散液按體積比為1:5-5:1混合，超聲處理5-10min。

在上述技術方案中，所述超聲處理為水浴超聲處理或探頭超聲處理；所述硝酸銀被還原后是單質銀；所述O-羧甲基殼聚糖包裹納米銀分散液濃度為0.1- 0.5 mg/mL；所述氧化石墨烯分散液濃度為0.1-0.5 mg/mL。

上述技術方案是在本課題組項目研究的基礎上，深入探討了納米粒子與氧化石墨烯組裝過程。首先采用光化學還原法制備O-羧甲基殼聚糖包裹納米銀分散液，再將該分散液與氧化石墨烯分散液混合超聲，本發明基殼聚糖包裹納米銀氧化石墨烯復合抗菌材料的制備方法具有的工藝特點和優越性如下。

O-羧甲基殼聚糖覆蓋于納米銀表面，在水溶液中O-羧甲基殼聚糖包裹的納米銀通過O-羧甲基殼聚糖與氧化石墨烯的氫鍵作用進行自組裝，O-羧甲基殼聚糖覆蓋于納米銀可均勻負載在氧化石墨烯表面，整個反應過程無需加熱，制備方法簡單、快捷、耗能小。

O-羧甲基殼聚糖在納米銀制備過程中充當還原劑和穩定劑，制備過程不引入其他無抗菌效果或有毒試劑，使用安全可靠，可廣泛用于醫療、衛生、環境治理，功能涂料、紡織品抗菌整理等領域。

附圖說明

圖1是本發明殼聚糖包裹納米銀/氧化石墨烯自組裝復合抗菌材料的X射線衍射譜圖。圖中可見在2θ=9.7^o、38.1^o、44.3^o、64.4^o和77.3^o出現五個特征衍射峰，其中9.7^o的衍射峰是氧化石墨烯的特征峰。通過與JCPDS(4-0781)標準卡片對比，我們可以知道38.1^o、44.3^o、64.4^o和77.3^o這四個衍射峰分別是對應著立方相金屬銀的(111)、(200)、(220)和(311)四個晶面的衍射峰。表明本發明所制備的是含有氧化石墨烯和納米銀的復合抗菌劑，其中的銀是立方結構晶系的單質銀。

具體實施方式

本發明上述所提供的一種O-羧甲基殼聚糖包裹納米銀氧化石墨烯復合抗菌材料是按硝酸銀溶液和O-羧甲基殼聚糖溶液進行混合后，經紫外光照射，將獲得的的懸浮液進行離心、洗滌、水溶液分散，并與氧化石墨烯分散液按體積比為1:5-5:1混合制得。

下面通過具體實施例來進一步詳細說明本發明的具體實施方式。

實施例1

(1) 將0.1%wt硝酸銀溶液與0.1%wt O-羧甲基殼聚糖溶液按體積比為5:95加入攪拌器，室溫下攪拌1h。

(2) 將上述混合溶液置于4mL石英比色皿中，通氮氣20s除盡空氣并密封。

(3) 將石英比色皿置于272nm紫外燈5cm處照射15min，紫外燈功率20w。

(4) 將混合溶液中加入一倍體積無水乙醇在14000r/min轉速下離心60min取沉淀，并用50%wt乙醇離心洗滌兩次。

(5) 沉淀再次溶于超純水，并超聲處理10min，即得O-羧甲基殼聚糖包裹納米銀分散液。

(6) 將0.1 mg/mL O-羧甲基殼聚糖包裹納米銀分散液與0.1 mg/mL氧化石墨烯分散液按體積比為5:1混合，超聲處理10min，得到O-羧甲基殼聚糖包裹納米銀氧化石墨烯復合抗菌材料。

通過上述制備方法中，硝酸銀溶液與O-羧甲基殼聚糖溶液的體積之比為5:9.5，O-羧甲基殼聚糖包裹納米銀分散液與氧化石墨烯分散液按體積比為5:1。

微量肉湯稀釋法最小抑菌濃度試驗：

將大腸桿菌(ATCC11229)和金黃色葡萄球菌(ATCC6538)的菌種分別以劃線法接種到配置好的營養瓊脂上，置于恒溫培養箱中在下培養后，取典型的菌落移種到營養肉湯培養基中，再次培養，用營養肉湯對菌懸液進行稀釋，配制成10⁵CFU/mL細菌懸液備用。

選取滅菌的96孔聚苯乙烯板中并排的八個孔，每孔依次加入雙倍濃度的滅菌MH(B)完全培養基100μL、10⁵CFU/mL細菌懸液50μL和倍比稀釋后不同濃度的O-羧甲基殼聚糖包裹納米銀氧化石墨烯復合抗菌材料50μL。此時第1孔至第8孔藥物濃度分別為16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/ml。將96孔聚苯乙烯板置于37^o培養箱內培養24h，用酶標儀檢測630nm處各孔的OD值。

試驗結果表明本實施例O-羧甲基殼聚糖包裹納米銀/氧化石墨烯自組裝復合抗菌材料對大腸桿菌的最小抑菌濃度為1 μ/mL，對金色葡萄球菌的最小抑菌濃度為2 μ/mL。

實施例2

按照實施例1的工藝方法，實施例2的區別在于：O-羧甲基殼聚糖包裹納米銀分散液與氧化石墨烯分散液按體積比為3:3。

微量肉湯稀釋法最小抑菌濃度試驗同實施例1。

試驗結果表明本實施例O-羧甲基殼聚糖包裹納米銀氧化石墨烯復合抗菌材料對大腸桿菌的最小抑菌濃度為4 μ/mL，對金色葡萄球菌的最小抑菌濃度為4 μ/mL。

實施例3

按照實施例1的工藝方法，實施例3的區別在于：O-羧甲基殼聚糖包裹納米銀分散液與氧化石墨烯分散液按體積比為2:4。

微量肉湯稀釋法最小抑菌濃度試驗同實施例1。

試驗結果表明本實施例O-羧甲基殼聚糖包裹納米銀氧化石墨烯復合抗菌材料對大腸桿菌的最小抑菌濃度為0.25 μ/mL，對金色葡萄球菌的最小抑菌濃度為1 μ/mL。