本發明涉及臨床消毒技術，具體涉及一種新型免洗抗菌凝膠的制備方法與應用。

背景技術：

耐藥細菌感染是臨床抗感染治療中極為棘手的問題，也是造成重癥感染死亡的首要原因。2014年世界衛生組織《全球抗生素耐藥報告》發出警告，耐藥致病菌在全世界范圍內繼續蔓延擴散，多重耐藥和新耐藥細菌持續不斷出現，耐藥菌感染所致疾病的死亡率依然不斷攀升。美國疾病控制與預防中心(cdc)最新調查數據顯示，美國每年耐藥細菌感染的人數高達200多萬，有耐藥菌感染所致死亡人數達23000余人，每年用于對抗耐藥菌感染的費用高達350億美元。我國細菌耐藥監測網(carss)最新監測數據顯示，目前臨床感染常見的致病菌已經對大多數一線主流抗生素產生耐藥，特別是臨床分離的甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌(mrsa)和甲氧西林耐藥表皮葡萄球菌(mrse)檢出率依然較高。在我國廣州地鐵檢等公共設施超級細菌耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(mrsa)的檢出率為2.5％。為了嚴格控制感染，加強個人衛生防護、去除手部細菌接觸是有效預防耐藥菌感染和傳播的重要措施。特別是醫院中人流量大、耐藥細菌分布密集，患者和家屬、以及醫務人員在就診和治療等過程中，互相接觸的機會較多，做好手部皮膚的清潔與消毒是防止醫院感染的重要措施，以及術前進行手部消毒對于防止手術患者的醫院感染起著至關重要的作用。因此，研制能有效殺滅多重耐藥細菌的免洗消毒凝膠具有重要臨床意義和應用價值。

目前免洗消毒凝膠的種類繁多，其中皮膚消毒劑的成分及含量各有不同。免洗消毒凝膠所采用的溶劑主要為易揮發的有機溶劑，常用的為醇溶劑，尤其采用乙醇、異丙醇為最多，但是這些成分存在消毒作用時效不長、效果不理想、對皮膚刺激較大、易燃等缺點。此外，傳統的抑菌或抗菌凝膠或洗手液不能有效殺死耐藥細菌，抗耐藥細菌效果較差。

技術實現要素：

本發明的目的之一在于提供一種免洗抗菌凝膠。

本發明的免洗抗菌凝膠的制備原料包括：3,3′-(3-溴-4-氟苯亞甲基)-雙-4-羥基香豆素、卡波姆、甘油、乙醇和水。

進一步，免洗抗菌凝膠由3,3′-(3-溴-4-氟苯亞甲基)-雙-4-羥基香豆素、卡波姆、甘油、無水乙醇和去離子水制備而成；其中3,3′-(3-溴-4-氟苯亞甲基)-雙-4-羥基香豆素的質量/體積百分比為0.1％、卡波姆的質量/體積百分比為0.6％、甘油的體積百分比為5.0％、無水乙醇的體積百分比為45％，去離子水的體積百分比為50％。

本發明的另一目的在于提供上述免洗抗菌凝膠的制備方法。

本發明的制備方法包括：在甘油、卡波姆和水的混合溶液中加入配方量的3,3′-(3-溴-4-氟苯亞甲基)-雙-4-羥基香豆素乙醇溶液。

采用試管法檢測免洗抗菌凝膠的最低抑菌濃度，以市售潔芙柔免洗消毒凝膠為對照，對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌為抗菌對象，進行最低抑菌濃度的檢測。結果表明本發明制備的免洗抗菌凝膠對革蘭氏陽性細菌金黃色葡萄球菌(s.aureas，atcc29213)，以及耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(mrsa，xj75302；usa300lac)和中度耐萬古霉素金黃色葡萄球菌(mu50atcc700699)有明顯的殺菌作用，對上述四株細菌的最低抑菌濃度為15.625‰(v/v)，此時3,3′-(3-溴-4-氟苯亞甲基)-雙-4-羥基香豆素的濃度為16μg/ml，對耐藥細菌的殺菌活性強于對照凝膠的殺菌活性。

采用試管法檢測免洗抗菌凝膠的殺菌曲線，以金黃色葡萄球菌(s.aureas，atcc29213)，耐藥菌耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(mrsa，xj75302)、usa300(lac)，中度耐萬古霉素金黃色葡萄球菌(mu50atcc700699)為檢測菌進行殺菌活性的測定。殺菌曲線結果顯示，與對照組相比，凝膠濃度為15.625‰(v/v)對上述四種菌株有明顯的殺菌作用，隨著作用時間的延長，細菌數逐漸降低。

采用mtt法檢測化合物3,3′-(3-溴-4-氟苯亞甲基)-雙-4-羥基香豆素在0.5μg/ml-32μg/ml范圍內對人表皮細胞和人靜脈內皮細胞生長的影響，結果顯示在上述濃度范圍內化合物對人表皮細胞和人靜脈內皮細胞沒有毒性。

在sd大鼠完整皮膚，連續涂抹免洗抗菌凝膠14d，給藥側皮膚均未見紅斑和紅腫，與對照側皮膚比較未見異常。試驗期內，試驗動物受試側皮膚最高積分均值為0，刺激強度屬無刺激性。

附圖說明

圖1為本發明的有效成分3,3′-(3-溴-4-氟苯亞甲基)-雙-4-羥基香豆素的核磁共振圖譜；

圖2為本發明的免洗抗菌凝膠的殺菌曲線。

具體實施方式

實施例1：3,3′-(3-溴-4-氟苯亞甲基)-雙-4-羥基香豆素的合成路線及方法為：

a：將適量的4-羥基香豆素和無水乙醇混合后加熱至4-羥基香豆素溶解；

b：加入3-溴-4-氟苯甲醛，加熱回流；

c：有固體顆粒析出，繼續加熱，待反應結束，冷卻、抽濾，再用乙醇重結晶，最終得純白色顆粒狀結晶。

結構鑒定：

利用質譜(ms)、核磁共振波譜(nmr)、紅外吸收光譜(ir)和紫外吸收光譜(uv)等有機波譜，對合成的3,3′-(3-溴-4-氟苯亞甲基)-雙-4-羥基香豆素進行分子量、結構和純度等鑒定。

鑒定結果為：

3,3′-(3-溴-4-氟苯亞甲基)-雙-4-羥基香豆素

3,3′-(3-bromo-4-fluorobenzylidene)-bis-(4-hydroxycoumarin)

1hnmr(dmso-d6,δ,ppm):7.885-7.901(d,3h),7.763(s,2h),7.562-7.601(t,2h),7.279-7.357(m,4h),6.403(s,1h).

化合物對表皮細胞和靜脈內皮細胞毒性評價

第一步，培養人表皮細胞(hacat細胞系)和人靜脈內皮細胞(huvec細胞系)，收集細胞，用細胞計數板進行細胞計數，按照2.5×10⁴個/孔的濃度接種于96孔板中，5％co2、37℃孵箱中培養。

第二步，實驗前棄去培養基，用pbs淋洗細胞3次。對照組設為3列24個孔，加入含10％胎牛血清的dmem培養基100μl，dmso濃度共8個梯度，從化合物最高濃度32μg/ml和dmso濃度1％開始，向下倍比稀釋，5％co2、37℃孵育8～24h。

第三步，每孔加入20μlmtt溶液(5mg/ml，即0.5％mtt)，繼續培養4h后終止培養，倒去孔內培養液，每孔加入150μl二甲基亞砜，低速震蕩10min，使結晶物充分溶解，在酶聯免疫檢測儀od490nm處檢測各孔的吸光度值。

結果如表1所示，與空白對照組相比，化合物3,3′-(3-溴-4-氟苯亞甲基)-雙-4-羥基香豆素在0.5μg/ml-32μg/ml范圍內對人表皮細胞和靜脈內皮細胞生長沒有統計學差異，顯示化合物對上述細胞活性沒有影響，毒性較低。

表1.化合物對表皮細胞和靜脈內皮細胞毒性試驗

實施例2：本發明免洗抗菌凝膠的制備

在本實施例中，免洗抗菌凝膠具體制備步驟如下。

第一步，將0.6g卡波姆940、5ml甘油和適量去離子水攪拌混合后在50～60℃的水中微熱30min。

第二步，放置過夜，使卡波姆940充分溶脹。

第三步，將100mg3,3′-(3-溴-4-氟苯亞甲基)-雙-4-羥基香豆素溶解在45ml無水乙醇中，攪拌均勻，將該溶液緩慢加入到步驟二的混合溶液中，邊加邊攪拌。

第四步，加入適量去離子水配至100ml，將凝膠ph值調至6～7。

ph調節劑可選用三乙醇胺。

另外一種制備方法中，用卡波姆941替換實施例2中的卡波姆940。

又一實施方案中，用卡波姆934替換實施例2中的卡波姆940。

實施例3：實施例2免洗消毒凝膠的最低抑菌濃度測定

第一步，免洗抗菌凝膠和對照凝膠的梯度稀釋方法：吸取100μl制好的免洗抗菌凝膠加入96孔板的每排第1號孔內，l號孔經混合后吸出100μl，加入2號孔內，依次倍比稀釋至8號后，吸出100μl棄去，這樣凝膠的的梯度濃度依次為50％、25％、12.5％、6.25％、3.125％、15.625‰、7.8125‰、3.90625‰(v/v)，相對應的3,3′-(3-溴-4-氟苯亞甲基)-雙-4-羥基香豆素濃度為512μg/ml、256μg/ml、128μg/ml、64μg/ml、32μg/ml、16μg/ml、8μg/ml、4μg/ml。陽性對照為潔芙柔免洗手消毒凝膠，陰性對照為不含有3,3′-(3-溴-4-氟苯亞甲基)-雙-4-羥基香豆素的凝膠。此外，設置單獨使用梯度濃度的3,3′-(3-溴-4-氟苯亞甲基)-雙-4-羥基香豆素溶液作為對照。

第二步，檢測菌的準備：取凍存于-20℃的金黃色葡萄球菌(s.aureas，atcc29213)，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(mrsa，xj75302；usa300lac)以及中度耐萬古霉素金黃色葡萄球菌(mu50atcc700699)四種檢測菌，劃線接種于m-h瓊脂培養基，在孵箱(35±2℃)中孵育20～24h。次日挑取單克隆菌落，接種于3mltsb培養基中，180rpm、37℃搖菌過夜。處于對數生長期的細菌菌液，用m-h肉湯培養基校正濃度至od630＝0.1(含菌量約10⁸cfu/ml)，再用m-h肉湯1:1000稀釋(含菌量約10⁵cfu/ml)。稀釋后的菌液應在15min內接種。

第三步，檢測菌的接種：用微量加樣器取100μl稀釋后的菌液依次加到96孔板中，最終接種細菌濃度為每孔5×10⁴/ml。這時從第1孔到第8孔藥物的濃度依次為25％、12.5％、6.25％、3.125％、15.625‰、7.8125‰、3.90625‰、1.953125‰(v/v)，相對應的3,3′-(3-溴-4-氟苯亞甲基)-雙-4-羥基香豆素濃度為256μg/ml、128μg/ml、64μg/ml、32μg/ml、16μg/ml、8μg/ml、4μg/ml、2μg/ml。振蕩1min，使各孔內菌液混勻，微孔板加蓋以減少孵育過程中的蒸發，并置濕盒內35℃孵育16～20h。同時每組設無凝膠生長對照孔(即只加100μlm-h肉湯和100μl復蘇后的菌液)和無菌對照孔(即只加200μlm-h肉湯)。

第四步，結果判斷：無菌對照孔在整個試驗過程中應始終保持清亮，表明整個實驗是無菌操作。與生長對照孔中細菌生長特性(如微孔內肉湯呈混濁狀，孔底出現沉淀等)相比較進行判斷，無肉眼可見生長的最低凝膠濃度為測定凝膠對檢測菌的最低抑菌濃度(mic)。

結果如表2所示，可以看出，免洗消毒凝膠對金黃色葡萄球菌(s.aureas，atcc29213)，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(mrsa，xj75302；usa300lac)和中度耐萬古霉素金黃色葡萄球菌(mu50atcc700699)有明顯的殺菌作用，對上述四個細菌的最低抑菌濃度為15.625‰，此時3,3′-(3-溴-4-氟苯亞甲基)-雙-4-羥基香豆素濃度為16μg/ml。與對照免洗手消毒凝膠和陰性對照凝膠相比，本發明免洗抗菌凝膠對藥物敏感菌和多重耐藥的金黃色葡萄球菌均有明顯殺菌活性，且比單獨使用3,3′-(3-溴-4-氟苯亞甲基)-雙-4-羥基香豆素的抗菌活性高(由表2所示，本發明免洗抗菌凝膠內含16μg/ml3,3′-(3-溴-4-氟苯亞甲基)-雙-4-羥基香豆素時有抑菌效果，3,3′-(3-溴-4-氟苯亞甲基)-雙-4-羥基香豆素水溶液中內含32μg/ml3,3′-(3-溴-4-氟苯亞甲基)-雙-4-羥基香豆素時有抑菌濃度)。

表2.免洗抗菌凝膠的最低抑菌濃度

實施例4：實施例2免洗抗菌凝膠殺菌曲線的測定

第一步，取無菌錐形瓶8個，分別標記為“生長對照和免洗抗菌凝膠”。每瓶分別加入6ml營養肉湯。

第二步，在免洗抗菌凝膠標記的錐形瓶中加入定量免洗抗菌凝膠，其濃度為15.625‰(v/v)，生長對照組加同等體積的去離子水。

第三步，在各錐形瓶中加入6μl濃度為0.5麥氏比濁標準的待測菌液金黃色葡萄球菌(s.aureas，atcc29213)，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(mrsa，xj75302；usa300lac)和中度耐萬古霉素金黃色葡萄球菌(mu50atcc700699)，各管菌液的最終濃度約為10⁵cfu/ml。

第四步，加菌后立即將錐形瓶均勻渦旋15s，倍比連續稀釋1000倍后，分別取0.1ml菌液接種于m-h瓊脂平板上(各接種兩份)，用l型玻棒均勻涂布接種，35℃孵育過夜后做菌落計數，并取其平均數。

第五步，37℃分別培養0.5，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18h后，將錐形瓶均勻渦旋15s，同上法倍比連續稀釋100～10⁷倍后，分別取0.1ml菌液接種于m-h瓊脂平板上(各接種三份)，35℃孵育過夜后，取菌落數在30-300之間的平板計數，并取其平均數。

第六步，cfu＝三塊板的菌落平均數×稀釋倍數，即為原液中每毫升菌液中的活菌數。肉眼計數不同時間點的菌落，并求其平均值，從而在對數坐標紙繪制不同時間點的殺菌曲線圖。

結果如圖2所示，與對照組相比，抗菌凝膠作用后的金黃色葡萄球菌(s.aureas，atcc29213)，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(mrsa，xj75302；usa300lac)和中度耐萬古霉素金黃色葡萄球菌(mu50atcc700699)的生長均受到明顯的抑制。隨著作用時間的延長，抗菌凝膠作用后的上述四種細菌菌落數逐漸減少，說明抗菌凝膠對藥物敏感菌和多重耐藥的金黃色葡萄球菌有快速、明顯的殺滅作用。

實施例5：實施例2抗菌凝膠皮膚刺激試驗

第一步，選健康、成年、皮膚無損傷的sd大鼠10只，將實驗動物背部脊柱兩側背毛剪掉，不損傷表皮，去毛范圍1.5cm×1.5cm。

第二步，取免洗抗菌凝膠受試物0.5ml直接涂在皮膚上，然后用二層紗布(2cm×2cm)和一層無刺激油紙覆蓋，再用無刺激膠布固定，另一側作為對照。刺激4h后，用生理鹽水除去殘留受試物。

第三步，每天涂抹1次，連續14d，每次涂抹后24h觀察結果。

結果表明，連續涂抹14d，給藥側皮膚均未見紅斑和紅腫，與對照側皮膚比較未見異常。試驗期內，試驗動物受試側皮膚最高積分均值為0，刺激強度屬無刺激性。