本發(fā)明屬于蘭科植物組織培養(yǎng)滅菌技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種蘭科植物微量種子滅菌及接種方法，適用于離體保存過(guò)程中微量蘭科植物種子的滅菌及接種。

背景技術(shù)：
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蘭科(Orchidaceae)的許多物種在觀賞、藥用及生態(tài)保護(hù)等方面都有較高的價(jià)值，在人們生活和生產(chǎn)過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。由于人為采挖、氣候變化等因素其野生資源日益減少、賴以生存的環(huán)境不斷遭受破壞。同時(shí)，蘭科植物的種子細(xì)如粉塵，在自然環(huán)境下很難萌發(fā)，種群的維持和更新困難。我國(guó)的所有蘭科物種都已被列入《中國(guó)物種紅色名錄》，全世界所有的野生蘭科植物均被列為《野生動(dòng)植物瀕危物種國(guó)際貿(mào)易公約》(CITES)的保護(hù)范圍，對(duì)野生蘭科植物開(kāi)展遷地保護(hù)研究迫在眉睫。采用組織培養(yǎng)技術(shù)對(duì)蘭科植物進(jìn)行離體保存研究是保護(hù)蘭科物種的有效手段。在整個(gè)離體保存操作過(guò)程中，種子的無(wú)菌處理成功與否非常關(guān)鍵?，F(xiàn)有技術(shù)通常是用紗布或?yàn)V紙等包裹種子在次氯酸鈉或氯化汞溶液中進(jìn)行消毒，或種子先消毒再過(guò)濾等方法，整個(gè)操作流程存在滅菌不充分、操作不方便、易污染等情況。特別地，野外能獲得的單個(gè)物種的種子數(shù)量通常有限(果莢開(kāi)裂，殘留的種子很少)，采回的果莢在接種前也易開(kāi)裂，而且在多個(gè)物種同時(shí)接種時(shí)極易發(fā)生混種。采用現(xiàn)有方法均難以對(duì)上述材料順利實(shí)現(xiàn)滅菌和接種要求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在了上述不足之處，借助當(dāng)前普遍可得的DNA純化柱(包含吸附柱和收集管)對(duì)野外獲取的少量的野生蘭科種子進(jìn)行滅菌和接種，使僅用微量種子也能為野生蘭科植物的離體保存提供無(wú)菌種源。該方法將對(duì)蘭科植物種質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)、利用和保護(hù)提供重要的技術(shù)支持。

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種蘭科植物微量種子的滅菌及接種方法，將DNA純化柱、200μl，1ml槍頭、純凈水在121℃高溫滅菌20-30min備用，用對(duì)折過(guò)的硫酸紙收集適量開(kāi)裂的蘭科種子，簡(jiǎn)單的去除果莢碎片雜質(zhì)后，沿著折痕將種子倒入已滅菌的吸附柱中，然后把吸附柱放入收集管，并將吸附柱做好標(biāo)記，在無(wú)菌條件下，向吸附柱中加入600μl的75％乙醇，倒立純化柱1-2次，之后200-1000rpm離心20s，從加乙醇開(kāi)始，直到完成離心，整個(gè)操作過(guò)程控制在28s-35s；倒棄收集管中廢液，向吸附柱中加入600μl無(wú)菌水，反復(fù)吸打無(wú)菌水使種子懸浮，充分漂洗種子，然后200-1000rpm離心20s，洗脫75％乙醇溶液；倒棄收集管中廢液，在無(wú)菌條件下向吸附柱中加入600μl的0.1-0.2％氯化汞溶液滅菌4-6min或2％次氯酸鈉溶液消毒6-10min，期間反復(fù)吸打溶液使種子懸浮充分滅菌，然后200-1000rpm離心20s；倒棄收集管中廢液，再向吸附柱中加入600μl無(wú)菌水，反復(fù)吸打無(wú)菌水使種子懸浮，充分漂洗種子，然后200-1000rpm離心20s，此操作重復(fù)3-4次，使消毒液徹底洗脫；再向離心之后的吸附柱中添加600μl無(wú)菌水，改用量程為200μl的槍頭反復(fù)吸打無(wú)菌水獲得種子懸濁液；另吸取50-300μl不等體積的種子懸濁液到培養(yǎng)基上，實(shí)現(xiàn)接種。

如所述的一種蘭科植物微量種子的滅菌及接種方法，其中DNA純化柱為規(guī)格為1ml吸附柱，2ml收集管。

如所述的一種蘭科植物微量種子的滅菌及接種方法，其中所述的改用量程為200μl的槍頭滅菌前將槍頭前部長(zhǎng)1.5cm的部分剪去，避免槍頭口徑過(guò)小造成種子堵塞槍頭。

如所述的一種蘭科植物微量種子的滅菌及接種方法，其中所述的改用量程為200μl的槍頭反復(fù)吸打無(wú)菌水獲得種子懸濁液，進(jìn)一步吸取50μl種子懸濁液到載玻片上，在體視鏡鏡下統(tǒng)計(jì)種子量，便于計(jì)算后期種子萌發(fā)率。

如所述的一種蘭科植物微量種子的滅菌及接種方法，包括如下步驟：

步驟1：把規(guī)格為吸附柱1ml，收集管2ml的DNA純化柱、200μl和1ml槍頭、純凈水在121℃高溫滅菌20-30min備用；

步驟2：用對(duì)折過(guò)的硫酸紙收集適量開(kāi)裂的鼓槌石斛種子，去除果莢碎片等雜質(zhì)后，沿著折痕將種子倒入已滅菌的吸附柱中，蓋好蓋子。把吸附柱放入收集管，在吸附柱上做好標(biāo)記，然后置于離心管架上；

步驟3：在無(wú)菌操作臺(tái)上，打開(kāi)吸附柱蓋，用1ml移液槍加入600μl 75％乙醇，蓋好蓋子消毒30s，期間倒立1-2次純化柱，整體，在種子消毒的同時(shí)，吸附柱內(nèi)部也得到滅菌，加乙醇，倒立純化柱，上離心機(jī)都在消毒30s之內(nèi)完成，然后600-800rpm離心20s；

步驟4：取出吸附柱，倒棄收集管中廢液，吸附柱放回收集管中，放置于離心管架上。在無(wú)菌操作臺(tái)中，打開(kāi)吸附柱蓋，用1ml移液槍加入600μl 0.2％氯化汞滅菌4-6min，反復(fù)吸打溶液使種子懸浮得到充分滅菌，然后600-800rpm離心20s；

步驟5：取出吸附柱，倒棄收集管中廢液。吸附柱放回收集管中，放置于離心管架上。在無(wú)菌操作臺(tái)中，打開(kāi)吸附柱蓋，此時(shí)吸附柱及種子已經(jīng)過(guò)乙醇、氯化汞消毒處于無(wú)菌狀態(tài)，用1ml移液槍加入600μl無(wú)菌水，反復(fù)吸打無(wú)菌水使種子懸浮，充分漂洗種子，然后600-800rpm離心20s；

步驟6：重復(fù)步驟5，3-4次；

步驟7：用1ml移液槍取600μl無(wú)菌水加入吸附柱中，然后用200μl的移液槍反復(fù)吸打使之呈種子懸濁液，吸取50μl種子懸濁液到載玻片上，在體視鏡下統(tǒng)計(jì)種子量，以便于計(jì)算后期種子萌發(fā)率；另吸取100μl的種子懸濁液接種到培養(yǎng)基上；

步驟8：把培養(yǎng)基移到溫度25±2℃暗培養(yǎng)3-5天，后光照培養(yǎng)一周，種子萌發(fā)。

如所述的一種蘭科植物微量種子的滅菌及接種方法，包括如下步驟：

步驟1：把規(guī)格為吸附柱1ml，收集管2ml的DNA純化柱、200μl和1ml槍頭、純凈水在121℃高溫滅菌20-30min備用；

步驟2：用對(duì)折過(guò)的硫酸紙收集適量開(kāi)裂的虎頭蘭種子，去除果莢碎片等雜質(zhì)后，沿著折痕將種子倒入已滅菌的吸附柱中，蓋好蓋子。把吸附柱放入收集管，在吸附柱上做好標(biāo)記，然后置于離心管架上；

步驟3：在無(wú)菌操作臺(tái)上，打開(kāi)吸附柱蓋，用1ml移液槍加入600μl 75％乙醇，蓋好蓋子消毒30s，期間倒立1-2次純化柱，整體，在種子消毒的同時(shí)，吸附柱內(nèi)部也得到滅菌，加乙醇，倒立純化柱，上離心機(jī)都在消毒30s之內(nèi)完成，然后200-300rpm離心20s；

步驟4：取出吸附柱，倒棄收集管中廢液。吸附柱放回收集管中，放置于離心管架上。在無(wú)菌操作臺(tái)中，打開(kāi)吸附柱蓋，用1ml移液槍加入600μl 0.2％氯化汞滅菌4-6min，反復(fù)吸打溶液使種子懸浮得到充分滅菌，然后200-300rpm離心20s；

步驟5：取出吸附柱，倒棄收集管中廢液。吸附柱放回收集管中，放置于離心管架上。在無(wú)菌操作臺(tái)中，打開(kāi)吸附柱蓋，此時(shí)吸附柱及種子已經(jīng)過(guò)乙醇、氯化汞消毒處于無(wú)菌狀態(tài)，用1ml移液槍加入600μl無(wú)菌水，反復(fù)吸打無(wú)菌水使種子懸浮，充分漂洗種子，然后200-300rpm離心20s；

步驟6：重復(fù)步驟5，3-4次；

步驟7：用1ml移液槍取600μl無(wú)菌水加入吸附柱中，然后用槍頭前部長(zhǎng)約1.5cm的部分被剪去的200μl的移液槍，反復(fù)吸打使之呈種子懸濁液，吸取50μl種子懸濁液到載玻片上，在體視鏡下統(tǒng)計(jì)種子量，以便于計(jì)算后期種子萌發(fā)率，吸取150μl種子懸濁液接到培養(yǎng)基上；

步驟8：把培養(yǎng)物移到溫度23±2℃暗培養(yǎng)一周后，再移至光照條件下培養(yǎng)一個(gè)月后種子膨大開(kāi)始萌發(fā)。

本發(fā)明還提供了一種蘭科植物微量種子的滅菌及接種方法用于離體保存過(guò)程中微量蘭科植物種子的滅菌及接種的方法。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明結(jié)合組織培養(yǎng)技術(shù)的滅菌方法和DNA純化柱等工具，設(shè)計(jì)了一套特別適用于果莢開(kāi)裂、細(xì)小且微量的蘭科植物種子的滅菌和接種方法。該技術(shù)克服了蘭科植物種子在消毒過(guò)程中易出現(xiàn)的滅菌不充分、混種及消毒液殘留的問(wèn)題，能高效地進(jìn)行微量的蘭科植物種子的消毒和接種，有效降低污染率，具有實(shí)驗(yàn)器材易得、節(jié)約材料、成本低廉、操作方便、接種效率高等優(yōu)點(diǎn)?？舍槍?duì)微量、細(xì)小的蘭科種子進(jìn)行批量高效滅菌、徹底去除消毒液殘留等問(wèn)題。當(dāng)接種的種子量較多時(shí)，也可分裝多個(gè)或改用更大體積的純化柱達(dá)成目的。

具體實(shí)施方式：

下面用本發(fā)明的實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此來(lái)限定本發(fā)明。

實(shí)施例1：

1、材料：鼓槌石斛DendrobiumchrysotoxumLindley，種子大小約為0.43×0.10mm。

2、實(shí)驗(yàn)器材：超凈臺(tái)、離心機(jī)、離心管架、DNA純化柱、移液槍、200μl和1ml槍頭、滅菌鍋、體視鏡、載玻片；

3、操作過(guò)程：

步驟1：把DNA純化柱(規(guī)格：吸附柱1ml，收集管2ml)、200μl和1ml槍頭、純凈水在121℃高溫滅菌20-30min備用；

步驟2：用對(duì)折過(guò)的硫酸紙收集適量開(kāi)裂的鼓槌石斛種子，簡(jiǎn)單的去除果莢碎片等雜質(zhì)后沿著折痕將種子倒入已滅菌的吸附柱中，蓋好蓋子。把吸附柱放入收集管，在吸附柱上做好標(biāo)記，然后置于離心管架上。

步驟3：在無(wú)菌操作臺(tái)上，打開(kāi)吸附柱蓋，用1ml移液槍加入600μl 75％乙醇，蓋好蓋子消毒30s，期間倒立1-2次純化柱(整體)，在種子消毒的同時(shí)，吸附柱內(nèi)部也得到滅菌。加乙醇，倒立純化柱，上離心機(jī)都在消毒30s之內(nèi)完成，然后600-800rpm離心20s。

步驟4：取出吸附柱，倒棄收集管中廢液。吸附柱放回收集管中，放置于離心管架上。在無(wú)菌操作臺(tái)中，打開(kāi)吸附柱蓋，用1ml移液槍加入600μl 0.2％氯化汞滅菌4-6min，反復(fù)吸打溶液使種子懸浮得到充分滅菌，然后600-800rpm離心20s。

步驟5：取出吸附柱，倒棄收集管中廢液。吸附柱放回收集管中，放置于離心管架上。在無(wú)菌操作臺(tái)中，打開(kāi)吸附柱蓋，此時(shí)吸附柱及種子已經(jīng)過(guò)乙醇、氯化汞消毒處于無(wú)菌狀態(tài)。用1ml移液槍加入600μl無(wú)菌水，反復(fù)吸打無(wú)菌水使種子懸浮，充分漂洗種子，然后600-800rpm離心20s。

步驟6：重復(fù)步驟5，3-4次。

步驟7：用1ml移液槍取600μl無(wú)菌水加入吸附柱中，然后用200μl的移液槍反復(fù)吸打使之呈種子懸濁液，吸取50μl種子懸濁液到載玻片上，在體視鏡下統(tǒng)計(jì)種子量，以便于計(jì)算后期種子萌發(fā)率；另吸取100μl的種子懸濁液接種到培養(yǎng)基上。

步驟8：把培養(yǎng)基移到溫度25±2℃暗培養(yǎng)3-5天，后光照培養(yǎng)一周，即可觀察到種子萌發(fā)。

實(shí)施例2：

1、材料：虎頭蘭Cymbidium hookerianum H.G.Reichenbach，種子大小約為1.57×0.27mm。

2、實(shí)驗(yàn)器材：超凈臺(tái)、離心機(jī)、離心管架、DNA純化柱、移液槍、200μl和1ml槍頭、滅菌鍋、體視鏡、載玻片；

3、操作過(guò)程：

步驟1：把DNA純化柱(規(guī)格：吸附柱1ml，收集管2ml)、200μl和1ml槍頭、純凈水在121℃高溫滅菌20-30min備用；

步驟2：用對(duì)折過(guò)的硫酸紙收集適量開(kāi)裂的虎頭蘭種子，簡(jiǎn)單的去除果莢碎片等雜質(zhì)后沿著折痕將種子倒入已滅菌的吸附柱中，蓋好蓋子。把吸附柱放入收集管，在吸附柱上做好標(biāo)記，然后置于離心管架上。

步驟3：在無(wú)菌操作臺(tái)上，打開(kāi)吸附柱蓋，用1ml移液槍加入600μl 75％乙醇，蓋好蓋子消毒30s，期間倒立1-2次純化柱(整體)，在種子消毒的同時(shí)，吸附柱內(nèi)部也得到滅菌。加乙醇，倒立純化柱，上離心機(jī)都在消毒30s之內(nèi)完成，然后200-300rpm離心20s。

步驟4：取出吸附柱，倒棄收集管中廢液。吸附柱放回收集管中，放置于離心管架上。在無(wú)菌操作臺(tái)中，打開(kāi)吸附柱蓋，用1ml移液槍加入600μl 0.2％氯化汞滅菌4-6min，反復(fù)吸打溶液使種子懸浮得到充分滅菌，然后200-300rpm離心20s。

步驟5：取出吸附柱，倒棄收集管中廢液。吸附柱放回收集管中，放置于離心管架上。在無(wú)菌操作臺(tái)中，打開(kāi)吸附柱蓋，此時(shí)吸附柱及種子已經(jīng)過(guò)乙醇、氯化汞消毒處于無(wú)菌狀態(tài)。用1ml移液槍加入600μl無(wú)菌水，反復(fù)吸打無(wú)菌水使種子懸浮，充分漂洗種子，然后200-300rpm離心20s。

步驟6：重復(fù)步驟5，3-4次。

步驟7：用1ml移液槍取600μl無(wú)菌水加入吸附柱中，然后用槍頭前部長(zhǎng)約1.5cm的部分被剪去的200μl的移液槍(虎頭蘭種子會(huì)造成200μl槍頭堵塞)反復(fù)吸打使之呈種子懸濁液，吸取50μl種子懸濁液到載玻片上，在體視鏡下統(tǒng)計(jì)種子量，以便于計(jì)算后期種子萌發(fā)率。吸取150μl種子懸濁液接到培養(yǎng)基上。

步驟8：把培養(yǎng)物移到溫度23±2℃暗培養(yǎng)一周后，再移至光照條件下培養(yǎng)一個(gè)月后種子膨大開(kāi)始萌發(fā)。