本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及芋頭莖尖組織培養(yǎng)中外植體消毒培養(yǎng)的方法及植物植株。

背景技術(shù)：

芋[Colocasia esculenta(L.)Schott]，是一種重要的蔬菜和藥用植物,在我國(guó)具有悠久的栽培歷史。芋還是迄今發(fā)現(xiàn)的耐鹽性最強(qiáng)的蔬菜類作物之一,長(zhǎng)期栽培可以降低土壤的鹽漬化程度,對(duì)灘涂的開發(fā)和利用具有較大的應(yīng)用價(jià)值。

全球芋頭種植面積最大的是非洲，非洲芋頭種植的面積占全球芋頭種植總面積的79.9％；而亞洲種植面積占全球芋頭種植總面積的7.6％，主要種植地點(diǎn)集中在中國(guó)、日本、菲律賓、泰國(guó)等。中國(guó)的檳榔芋產(chǎn)區(qū)主要分布在廣西、廣東、海南、福建，湖北、浙江、山東、四川、江西等地，并以多子芋為主，著名品種有廣西荔浦芋、福建福鼎芋、廣東樂昌炮彈芋、靖江香沙芋等。

近幾年，由于種植結(jié)構(gòu)調(diào)整和人們對(duì)芋頭產(chǎn)品的青睞，芋頭種植面積大幅度提高，出現(xiàn)供需兩旺的勢(shì)頭。芋頭是無(wú)性繁殖作物，以球莖作為生產(chǎn)用種，農(nóng)戶常年留種種植，連續(xù)栽培易引起病理性和生理性退化。芋頭退化是由病毒侵染并在芋塊內(nèi)累代積留引起的，表現(xiàn)為產(chǎn)量和品質(zhì)的明顯降低。大部分病毒不能侵染芋頭莖尖組織，因而通過莖尖組織培養(yǎng)脫毒種芋，將脫毒種芋應(yīng)用于生產(chǎn)是防止芋頭退化的有效措施。在植物組織培養(yǎng)過程中對(duì)植物外植體消毒滅菌的效果是植物組織培養(yǎng)成功的關(guān)鍵。污染是造成組織培養(yǎng)失敗的主要原因之一，很多學(xué)者在初代培養(yǎng)階段，很難得到無(wú)菌苗；或者雖然在初代培養(yǎng)得到了無(wú)菌苗，但在繼代培養(yǎng)時(shí)往往出現(xiàn)大量污染甚至全部污染。

如何降低成本是提高經(jīng)濟(jì)效益的首要問題，因此,組織培養(yǎng)中降低污染率是工廠化生產(chǎn)中不可忽視的技術(shù)環(huán)節(jié)。在植物組織培養(yǎng)過程中,存在兩種類型的污染：一類是通常所說(shuō)的污染，即外植體消毒不徹底,無(wú)菌操作和培養(yǎng)過程中而導(dǎo)致的污染；另一類是包括真菌和細(xì)菌的內(nèi)源菌污染，這也是造成內(nèi)源污染的主要原因。外植體污染是組織培養(yǎng)中眾多污染途徑中最難解決的一個(gè)。

有鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一目的在于提供一種芋頭莖尖組織培養(yǎng)中外植體消毒培養(yǎng)的方法，所述方法中，通過在培育過程中，對(duì)外植體采用適宜的方法進(jìn)行消毒，從而能夠有效避免莖尖組織培養(yǎng)中外植體受到污染，同時(shí)還能夠保證較高的分生組織誘導(dǎo)率。

本發(fā)明的第二目的在于提供一種植物植株，所述植株由本發(fā)明方法培育得到。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：

一種芋頭莖尖組織培養(yǎng)中外植體消毒方法，所述方法包括如下步驟：

(1)將從采集的母芋上選取的子芋浸泡于殺菌劑溶液中消毒后，埋于砂床中催芽；

(2)待發(fā)出的芽體長(zhǎng)至15～20cm后，將子芋從沙盤中取出，并在清洗和除去子芋外皮后，晾干備用；

(3)以酒精擦洗子芋和芽體，然后去除莖尖周圍的葉片和組織，并截取2～3cm的芽體；

將截取的芽體依次用酒精和二氯化汞溶液消毒，然后清洗并干燥；

(4)剝除干燥后的芽體上生長(zhǎng)點(diǎn)外圍包裹的葉片；選取生長(zhǎng)點(diǎn)上部的組織，并誘導(dǎo)培養(yǎng)。

可選的，本發(fā)明中，步驟(1)中所選取的子芋的質(zhì)量為35～70g。

可選的，本發(fā)明中，所述殺菌劑溶液為50％多菌靈可濕性粉劑300～500倍液。

可選的，本發(fā)明中，步驟(1)中所述浸泡的時(shí)間為15～30min。

可選的，本發(fā)明中，步驟(1)中還進(jìn)一步包括每隔3～5日澆水，并保持沙盤濕潤(rùn)的步驟。

可選的，本發(fā)明中，步驟(3)中所述以酒精擦洗子芋和芽體，是以濃度為75～80％的酒精擦洗子芋和芽體。

可選的，本發(fā)明中，步驟(3)中所述依次用酒精和二氯化汞溶液消毒，是以濃度為60～70％的酒精消毒2～3min后，再以二氯化汞溶液消毒6～10min。

可選的，本發(fā)明中，所述二氯化汞溶液為溶有吐溫20的濃度為0.1～0.3％的二氯化汞溶液。

可選的，本發(fā)明中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為添加有BA、NAA以及2～3％蔗糖的基礎(chǔ)MS培養(yǎng)基；

其中，BA的濃度為2～3mg/L，NAA的濃度為0.1～0.2mg/L。

同時(shí)，本發(fā)明還提供了由本發(fā)明所述方法培養(yǎng)得到的芋頭植株。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

本發(fā)明中，通過在芋頭莖尖組織培養(yǎng)過程中，對(duì)外植體(即采集選取得到的子芋和發(fā)芽所得芽體)進(jìn)行反復(fù)消毒，并篩選最優(yōu)的消毒方法、優(yōu)化消毒的條件，從而能夠有效降低芋頭莖尖組織培養(yǎng)過程中的污染率，同時(shí)還能夠保證莖尖頂端分生組織的高誘導(dǎo)率。

附圖說(shuō)明

為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，以下將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹。

圖1為外植體預(yù)培養(yǎng)砂培催芽示意圖；

圖2為外植體清洗示意圖；

圖3為外植體清洗晾干示意圖；

圖4為芽體前處理示意圖；

圖5為誘導(dǎo)出芽示意圖。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購(gòu)買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

本發(fā)明中，培育所用基材芋頭屬天南星科芋屬植物，是一種多年生塊莖植物，其球狀地下莖(塊莖)可食用亦可入藥。芋頭的葉片呈盾形，葉柄長(zhǎng)而肥大，綠色或紫紅色；植株基部形成短縮莖，逐漸累積養(yǎng)分肥大成肉質(zhì)球莖，稱為“芋頭”或“母芋”，球形、卵形、橢圓形或塊狀等。母芋每節(jié)都有一個(gè)腦芽，但以中下部節(jié)位的腋芽活動(dòng)力最強(qiáng)，發(fā)生第一次分蘗，形成小的球莖稱為“子芋”，再?gòu)淖佑蟀l(fā)生“孫芋”，在適宜條件下，可形成曾孫或玄孫芋等。

進(jìn)一步的，本發(fā)明中，首先在10～12月份，在無(wú)病害的芋田里采摘母芋，并選擇生長(zhǎng)健壯、頭大而圓、頂芽飽滿、無(wú)病蟲、無(wú)傷口而且沒有腐爛子芋的母芋；

然后，在所采摘的母芋上，選取頭大尾小、有頂芽、無(wú)病蟲眼而且無(wú)爛尾的子芋，子芋單個(gè)重量范圍為35～70g，優(yōu)選的，子芋的單個(gè)重量以40～60g為宜；

選取的子芋進(jìn)一步在沙床上培養(yǎng)，培養(yǎng)所用沙床最好為潔凈、且未使用過的沙床，這樣能夠有效避免可能的病毒和細(xì)菌對(duì)于子芋的污染。

然后，配置殺菌劑，殺菌劑優(yōu)選為50％多菌靈可濕性粉劑300～500倍液，例如可以為，但不限于50％多菌靈可濕性粉劑的350、400或者450倍液；

接著，將選取的子芋在殺菌劑中浸泡15～30min消毒，例如可以，但不限于浸泡18、20、25min等，進(jìn)行充分消毒；

然后，將消毒后的子芋埋于沙床中進(jìn)行催芽，較優(yōu)選的，可以將消毒后的子芋淺埋于沙床中進(jìn)行催芽，這樣更有利于子芋的發(fā)芽；

子芋埋于沙床中后，每隔3～5d對(duì)沙床澆水，從而保持沙床濕潤(rùn)，同時(shí)也為子芋發(fā)芽創(chuàng)造良好的生長(zhǎng)環(huán)境；

當(dāng)子芋催芽后所生長(zhǎng)出的芽體生長(zhǎng)至15～20cm后，將生芽的子芋從沙床中小心的取出，避免新芽受傷；

然后，用自來(lái)水將子芋外表的沙子沖洗干凈，同時(shí)，用刷子刷掉子芋的褐色表皮；接著，將子芋攤在篩子上過夜晾干，備用。

接著，是對(duì)晾干的子芋的消毒處理，首先是用經(jīng)過滅菌的紗布蘸取濃度為75～80％的酒精液擦洗子芋和芽體，例如可以蘸取濃度為76、77、78或者79％的酒精后，擦洗子芋和生長(zhǎng)出的芽體；

然后，去除所生長(zhǎng)出芽體的莖尖周圍的葉片和組織，并截取2～3cm芽體作為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的基材；這一步驟中所截取的芽體，是以去除了周圍的葉片和組織后的莖尖為起點(diǎn)，然后沿芽體方向延伸2～3cm的芽體結(jié)構(gòu)，即包含莖尖的芽體；

再接下來(lái)，是對(duì)通過截取得到的芽體進(jìn)行進(jìn)一步的消毒，這一步驟的消毒優(yōu)選的是在無(wú)菌操作臺(tái)上進(jìn)行的，這樣也能夠有效避免芽體受到污染。

這一步驟中，首先是以濃度為60～70％的酒精對(duì)截取得到的芽體進(jìn)行2～3min的消毒，例如可以以62、65、67或者69％濃度的酒精對(duì)截取得到的芽體消毒2、2.5或者3min等；

然后，將酒精消毒后的芽體再以含有吐溫20的二氯化汞溶液進(jìn)行消毒，所述溶液中。二氯化汞的濃度優(yōu)選的可以為0.1、0.2或者0.3％等；使用二氯化汞進(jìn)行消毒的時(shí)間可以優(yōu)選的為6、7、8、9或者10min等；

二氯化汞溶液消毒后，將芽體以無(wú)菌水沖洗5～10次，例如可以沖洗5、6、7、8、9或者10次等；將沖洗后的芽體用無(wú)菌濾紙吸去表面的水分，即完成了芽體的消毒。

在子芋消毒處理步驟中，較為優(yōu)選的選用消毒后的工具、裝置和儀器進(jìn)行各個(gè)步驟的操作，在消毒處理過程中，也要盡量避免材料與不潔環(huán)境的接觸，這樣能夠更好的避免在處理過程中對(duì)外植體的污染。

最后進(jìn)行的就是接種和培養(yǎng)的步驟。

在這一步驟中，首先要將所要進(jìn)一步培養(yǎng)的外植體從消毒處理后的芽體上摘取出來(lái)，較為優(yōu)選的，可以在解剖鏡輔助條件下，由外向內(nèi)，依次剝除芽體上的生長(zhǎng)點(diǎn)外圍所包裹的葉片，直至生長(zhǎng)點(diǎn)暴露出來(lái)；

然后，使用解剖針，挑取生長(zhǎng)點(diǎn)上部0.5mm左右大小的組織，作為進(jìn)一步培養(yǎng)的材料，并接種于培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)；

該步驟中，所用培養(yǎng)基為添加有BA、NAA以及2～3％蔗糖的基礎(chǔ)MS培養(yǎng)基；所述培養(yǎng)基中，BA的濃度可以為2～3mg/L，NAA的濃度可以為0.1～0.2mg/L，培養(yǎng)基的pH可以調(diào)整至5.8～6.0；培養(yǎng)的溫度可以控制在25～27℃，并在暗室等暗環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)，并最終得到植物植株。

進(jìn)一步的，本發(fā)明中，芋頭莖尖組織培養(yǎng)中外植體消毒培養(yǎng)的整體步驟方法如下：

(1)將從采集的母芋上選取的子芋浸泡于殺菌劑溶液中15～30min消毒后，埋于砂床中催芽，期間每隔3～5日澆水保持沙盤濕潤(rùn)；

其中，子芋的質(zhì)量為35～70g，所用殺菌劑溶液為50％多菌靈可濕性粉劑300～500倍液；

(2)待發(fā)出的芽體長(zhǎng)至15～20cm后，將子芋從沙盤中取出，并在清洗和除去子芋外皮后，晾干備用；

(3)以濃度為75～80％的酒精溶液擦洗子芋和芽體，然后去除莖尖周圍的葉片和組織，并截取2～3cm的芽體；

將截取的芽體用濃度為60～70％的酒精消毒2～3min后，再以含有吐溫20的0.1～0.3％的二氯化汞溶液消毒6～10min，然后清洗并干燥；

(4)剝除干燥后的芽體上生長(zhǎng)點(diǎn)外圍包裹的葉片；選取生長(zhǎng)點(diǎn)上部的組織，并誘導(dǎo)培養(yǎng)；

培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為添加有BA、NAA以及2～3％蔗糖的基礎(chǔ)MS培養(yǎng)基；培養(yǎng)基中BA的濃度為2～3mg/L，NAA的濃度為0.1～0.2mg/L。

實(shí)施例1

(1)外植體的采集：

在10月～12月間，在無(wú)病芋田中選取健壯、頭大而圓、頂芽飽滿、無(wú)病蟲、無(wú)傷口，同時(shí)不帶有不腐爛子芋的芋頭作為母芋；然后，在母芋上截取頭大尾小、有頂芽、無(wú)病斑蟲眼，同時(shí)無(wú)爛尾的子芋，單個(gè)子芋的質(zhì)量以40～60g為宜；

(2)外植體的預(yù)培養(yǎng)：

準(zhǔn)備潔凈、未使用過的砂床，用50％多菌靈可濕性粉劑400倍液浸泡子芋20min；

然后，將子芋淺埋于砂床中催芽，期間每隔3～5天澆水一次，保持砂床濕潤(rùn)；

(3)外植體的預(yù)處理：

請(qǐng)參考圖1，待生發(fā)出的芽體長(zhǎng)至15～20cm后，將子芋從砂床中小心取出，避免新芽受傷；

然后，請(qǐng)參考圖2，用自來(lái)水將子芋上沾有的砂子沖洗干凈；同時(shí)，用刷子刷掉子芋的褐色外皮；然后，請(qǐng)參考圖3，將洗凈的子芋均勻攤在篩子上過夜晾干備用；

(4)芋頭芽體的消毒：

a.芽體的前處理：用經(jīng)滅菌的紗布蘸取75％的酒精，擦洗整個(gè)子芋本體以及生長(zhǎng)出的芽體；然后，請(qǐng)參考圖4，去除芽體上莖尖周圍的葉片和組織，并以去除了周圍的葉片和組織后的莖尖為起點(diǎn)，然后以該起點(diǎn)為遠(yuǎn)點(diǎn)，并沿芽體方向延伸2～3cm截取芽體，得到長(zhǎng)度為2～3cm、且包含莖尖結(jié)構(gòu)的芽體；

b.芽體的消毒：無(wú)菌操作臺(tái)下，將截取后的芽體用70％酒精消毒2min；然后，再以含有吐溫20的0.1％2氯化汞對(duì)芽體消毒8min；接著，以無(wú)菌水沖洗芽體5次，并用無(wú)菌的濾紙吸去芽體表面的水分；

(5)外植體的接種：

a.外植體的摘取：在解剖鏡下由外向內(nèi)依次剝除芽體上生長(zhǎng)點(diǎn)外圍包裹的葉片，直至生長(zhǎng)點(diǎn)暴露；

b.用解剖針針尖挑取生長(zhǎng)點(diǎn)上部0.5mm左右大小的組織,接種到芋頭芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，并在溫度為25～27℃的暗室中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)出芽植株請(qǐng)參考圖5；

所用培養(yǎng)基為添加有BA、NAA以及2～3％蔗糖的基礎(chǔ)MS培養(yǎng)基；其中，BA的濃度為2～3mg/L，NAA的濃度為0.1～0.2mg/L。

實(shí)驗(yàn)例1

按照實(shí)施例1所述方法，選取100個(gè)子芋，然后，按照實(shí)施例1步驟(1)-(5)中所述方法進(jìn)行莖尖組織培養(yǎng)；然后，對(duì)莖尖組織培養(yǎng)的污染率和莖尖頂端分生組織的誘導(dǎo)率進(jìn)行檢測(cè)。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用本發(fā)明方法，即對(duì)組織培養(yǎng)過程中對(duì)外植體進(jìn)行消毒處理后，污染率能夠控制在3％，莖尖頂端分生組織的誘導(dǎo)率也能夠達(dá)到95％。

而按照現(xiàn)有的芋頭培養(yǎng)技術(shù)，并采用與本發(fā)明中相同的培養(yǎng)液，在以同樣的子芋為基材的情況下，莖尖組織培養(yǎng)的污染率為50％，莖尖頂端分生組織的誘導(dǎo)率僅為70％左右。

本發(fā)明中，通過在莖尖組織培養(yǎng)過程中，對(duì)所用基材外植體采用合理處理的方法，并在外植體選取、培育和分離過程中，均采用適當(dāng)?shù)南痉椒▽?duì)外植體進(jìn)行消毒，從而能夠有效避免在培養(yǎng)過程中外植體被污染，同時(shí)還能夠有效提高莖尖頂端分生組織的誘導(dǎo)率。

盡管已用具體實(shí)施例來(lái)說(shuō)明和描述了本發(fā)明，然而應(yīng)意識(shí)到，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可以作出許多其它的更改和修改。因此，這意味著在所附權(quán)利要求中包括屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的所有這些變化和修改。