本發(fā)明涉及單克隆抗體的制備技術(shù)，尤其是涉及一種可獲取大量鼠源性單克隆抗體的小鼠模型建立方法。
背景技術(shù)：
1975年Kohler和Milstein建立了雜交瘤技術(shù)，將小鼠骨髓瘤細胞與產(chǎn)生綿羊紅細胞的小鼠脾細胞融合，形成的雜交瘤細胞既能產(chǎn)生抗體又能進行分裂繁殖，且產(chǎn)生的抗體只能識別一種抗原決定簇，稱為單克隆抗體。目前單克隆抗體主要應(yīng)用于疾病的預(yù)防、診斷和治療，生物物質(zhì)的純化及蛋白結(jié)構(gòu)功能的研究中。治療性單抗（單克隆抗體）的市場在新藥開發(fā)中有逐年增長的趨勢，1997年單抗的銷售額是50億美金，以后每年都有40%到50%的增長，至2003年已達到1997年的十倍，達500億美金，由此可見單抗技術(shù)是生物技術(shù)領(lǐng)域中升起的一顆新星。
隨著對單克隆抗體藥物研究的不斷深入以及新藥的不斷推出，單克隆抗體藥一直處于較高的增長率。單克隆抗體不僅在體外診斷試劑上得以廣泛應(yīng)用，還可直接用于對人類疾病的診斷、預(yù)防、治療以及免疫機制的研究，為人類惡性腫瘤的免疫診斷與免疫治療開辟了廣闊的前景。
我國的單克隆抗體藥物從無到有發(fā)展迅速，已在我國醫(yī)藥市場發(fā)揮著越來越重要的作用，但是單克隆抗體在我國市場仍屬高端產(chǎn)品，主要依賴進口。
目前在國內(nèi)外實驗室廣泛采用的制備單抗的方法主要有兩大系統(tǒng)，一是體外培養(yǎng)法；二是動物體內(nèi)生產(chǎn)法。
雜交瘤細胞系并不是嚴格的貼壁依賴細胞（anchorage dependent cell，ADC），因此既可以進行單層細胞培養(yǎng)，又可以進行懸浮培養(yǎng)。目前雜交瘤細胞的單層細胞培養(yǎng)法是各個實驗室最常用的體外培養(yǎng)手段，即將雜交瘤細胞加入培養(yǎng)瓶中，以含20%小牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)，細胞濃度以1×106-2×106/ml為佳，然后收集培養(yǎng)上清，其中單抗含量約10-50ug/ml。顯然，這種方法制備的單抗量極為有限，無疑是不適用于單抗的大規(guī)模生產(chǎn)。要想在體外大量制備單抗，就必須進行雜交瘤細胞的大量（高密度）培養(yǎng)。因為單位體積內(nèi)細胞數(shù)量越多，細胞存活時間越長，單抗的濃度就越高，產(chǎn)量就越大。目前對于雜交瘤細胞的大量培養(yǎng)方法包括以下幾種：
1、懸浮培養(yǎng)法：即小規(guī)模懸浮培養(yǎng)多采用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)，通過攪拌使細胞呈懸浮狀態(tài)；而大規(guī)模懸浮培養(yǎng)多采用發(fā)酵式的生物反應(yīng)器，美國、加拿大、法國和德國等幾家公司生產(chǎn)這類反應(yīng)器，其培養(yǎng)方式可分為純批式、流加式、半連續(xù)式和連續(xù)式。
2、微載體培養(yǎng)法：微載體（Microcarrier）是以小的固體顆粒作為細胞生長的載體，在攪拌作用下微載體懸浮于培養(yǎng)液中，細胞則在固體顆粒表面生長成單層。可用作細胞大量培養(yǎng)的微載體主要以交聯(lián)瓊脂糖或葡聚糖、聚苯乙烯、玻璃等作為基質(zhì)的產(chǎn)品，其中以Cytodex I，Biosilon和Superbeads為好。
3、中空纖維細胞培養(yǎng)系統(tǒng)：該系統(tǒng)由中空纖維生物反應(yīng)器、培養(yǎng)基容器、供氧器和蠕動泵等組成。盡管該培養(yǎng)系統(tǒng)在大規(guī)模生產(chǎn)單抗時成本較低，并可獲得高產(chǎn)量高純度的抗體，但是由于設(shè)備價格昂貴，限制了其使用范圍。
4、微囊化細胞培養(yǎng)系統(tǒng)：該系統(tǒng)是先將雜交瘤細胞微囊化，然后將此具有半透膜的微囊置于培養(yǎng)液中進行懸浮培養(yǎng)，一定時間后，從培養(yǎng)液中分離出微囊，沖洗后打開囊膜，離心后即可獲得高濃度的單抗。
5、雜交瘤細胞的無血清培養(yǎng)：雜交瘤細胞的體外培養(yǎng)絕大多數(shù)應(yīng)用DMEM或RPMI-1640為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加10-20%胎牛或新生小牛血清。由于血清中含有上百種的蛋白質(zhì)，這給單抗的純化帶來很大麻煩，而未純化的含有異種蛋白的單抗用于動物治療可誘發(fā)變態(tài)反應(yīng)。無血清培養(yǎng)的實質(zhì)就是用各種不同的添加劑來代替血清，然后進行雜交瘤細胞的培養(yǎng)。采用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)雜交瘤細胞制備單抗，有利于單抗的純化，有助于大規(guī)模生產(chǎn)，可減少細胞污染的機會，且成本較低。但無血清培養(yǎng)細胞的生產(chǎn)率低、細胞密度小，影響了單抗的產(chǎn)量；同時無血清培養(yǎng)基還缺少血清中保護細胞免受環(huán)境中蛋白酶損傷的抑制因子等。
雖然以上體外培養(yǎng)生產(chǎn)單抗的方法隨著技術(shù)的不斷發(fā)展會趨于更加完善，但依然無法代替從動物體內(nèi)獲取單克隆抗體。
動物體內(nèi)生產(chǎn)單抗：鑒于絕大多數(shù)動物用雜交瘤均由BALB/c小鼠的骨髓瘤細胞與同品系的脾細胞融合而得，因此使用的動物當然首選BALB/c小鼠。通過將雜交瘤細胞接種于小鼠腹腔內(nèi)，在小鼠腹腔內(nèi)生長雜交瘤，并產(chǎn)生腹水，得到大量的腹水單抗且抗體濃度很高。雖然該方法操作簡便、經(jīng)濟，但是傳統(tǒng)的注射方式使得小鼠產(chǎn)生腹水率較低，且需要不斷的進行體外培養(yǎng)和免疫注射，實際實驗操作成本較高且流程復(fù)雜，并不利于大規(guī)模化生產(chǎn)，導(dǎo)致臨床試驗及醫(yī)藥成本較高。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種可獲取大量鼠源性單克隆抗體的小鼠模型建立方法。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明可采取下述技術(shù)方案：
本發(fā)明所述的制備單克隆抗體的小鼠模型建立方法包括下述步驟：
第一步，將分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株從種子庫取出解凍，并培養(yǎng)至對數(shù)生長期，然后進行細胞預(yù)處理及計數(shù)；
第二步，將第一步處理好的雜交瘤細胞株注射進8~10周齡的第一批BALB/c小鼠腹腔中，形成一代小鼠模型；
第三步，注射后第6天，觀察一代小鼠模型情況并進行腹水采集；
第四步，將第三步中第一次采集的一代小鼠模型的腹水注射進8-10周齡的第二批BALB/c小鼠腹腔中，形成二代小鼠模型；
第五步，重復(fù)第三步和第四步，依次得到第三代至第十代小鼠模型。
所述使用的BALB/c小鼠在使用前采用降植烷或液體石蠟對其腹腔進行預(yù)處理。
所述BALB/c小鼠采用SPF級小鼠。
本發(fā)明的優(yōu)點在于流程簡單，操作便捷，安全性高。可保證雜交瘤細胞在第一代小鼠模型腹腔內(nèi)大量繁殖并分泌有效的抗體，取自上一代小鼠模型的腹水注射在下一代小鼠模型腹腔內(nèi)，腹水產(chǎn)生的周期較常規(guī)注射雜交瘤細胞的BALB/c小鼠腹水提前2-3天，同時小鼠注射雜交瘤細胞后產(chǎn)生腹水的成功率也由86%提高到98%以上，利用本發(fā)明建立的小鼠模型制備單克隆抗體，不僅縮短了獲取鼠源性單克隆抗體制備的周期，保證了BALB/c小鼠的有效利用率，提高了整體的工作效率，節(jié)約了單克隆抗體制備的成本，也避免了細胞培養(yǎng)過程中的復(fù)雜性操作及雜交瘤細胞在培養(yǎng)過程中污染的風險，便于后期持續(xù)性大量獲取鼠源性的單克隆抗體用于醫(yī)療體外診斷行業(yè)。
具體實施方式
下面對本發(fā)明制備單克隆抗體的小鼠模型建立方法進行更加詳細的說明。
本發(fā)明的制備單克隆抗體的小鼠模型建立方法包括下述步驟：
第一步，將分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株從種子庫取出解凍，為保證雜交瘤細胞株的成活率可采用快速解凍法（即從冷庫中取出后快速放在預(yù)熱好的37℃水浴鍋內(nèi)進行解凍，保證在50s內(nèi)完成），然后將解凍后的雜交瘤細胞株用提前配制好的無血清培養(yǎng)基清洗兩遍（每毫升雜交瘤細胞液加入6毫升DMEM培養(yǎng)基，然后用移液槍進行懸浮后1500r/min，3min離心，去上清，共重復(fù)兩遍），有效去除雜交瘤細胞凍存液中的二甲基亞砜等有毒物質(zhì)，保證解凍后的雜交瘤細胞成活率；然后用將添加有40%小牛血清和添加有飼養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基對清洗后的雜交瘤細胞重懸后在平皿里培養(yǎng)4-7天，并每天定期觀察雜交瘤細胞的生產(chǎn)狀態(tài)；
第二步，當觀察分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞生長到對數(shù)生長期的時候（一般在倒置顯微鏡下觀察細胞數(shù)量覆蓋平皿底部的3/4面積，并且細胞狀態(tài)良好即為細胞生長對數(shù)期），對雜交瘤細胞開始重懸（因為雜交瘤細胞為半貼壁半懸浮型細胞），1500r/min，3min離心去除原有培養(yǎng)基成分，使用PBS或無血清培養(yǎng)基進行稀釋，計數(shù)；然后將雜交瘤細胞株注射進8~10周齡的第一批BALB/c小鼠腹腔中（每只小鼠注射雜交瘤細胞株的細胞密度為6×105/0.2ml），形成一代小鼠模型；
第三步，注射后第6天，觀察一代小鼠模型情況：主要對腹部明顯膨大，以手觸摸時有緊張感，且腹部顏色明顯加深的小鼠開始進行腹水采集（使用16號針頭，采集腹水量為每只小鼠腹腔內(nèi)腹水量的最大值(由于小鼠的大小、體型、性別、狀態(tài)都會影響小鼠的腹水量，采集時需要每天將小鼠腹腔內(nèi)的腹水盡量采集干凈，這樣有利于傷口的愈合及在小鼠腹腔內(nèi)新生的腹水聚集，便于第二天再次采集腹水），每天一次，一般可持續(xù)采集5~10天；
第四步，將第三步中第一次采集的一代小鼠模型的腹水注射進8-10周齡的第二批BALB/c小鼠腹腔中（每只小鼠注射腹水量為0.2ml），形成二代小鼠模型；由于注射的腹水本身來自鼠源，親和力更強，更有利于二代小鼠模型腹水的產(chǎn)生；
第五步，注射后第6天，觀察二代小鼠模型情況，對符合要求的二代小鼠模型開始進行腹水采集，仍然每天一次，持續(xù)采集5~10天；
第六步，將第一次采集的二代小鼠模型的腹水注射進8-10周齡的第三批BALB/c小鼠腹腔中，形成三代小鼠模型；依次類推，得到第十代小鼠模型。
將第一代至第十代小鼠模型中第2次及以后采集的腹水及時進行離心（4000r/min,5min）分離（每天一次），除去細胞成分及其他不溶物后，收集上清，按照測定的抗體效價分裝后，得到的單克隆抗體凍存-80℃冷柜中或凍干保存?zhèn)溆谩?/p>
其中BALB/c小鼠可采用SPF級小鼠，由于安全等級更高，可保證實驗的順利進行。
BALB/c小鼠在使用前7天~26天需要采用降植烷或液體石蠟（0.3-0.5ml）對其腹腔進行預(yù)處理，由于降植烷或液體石蠟是免疫抑制劑，能降低小鼠免疫力，降低小鼠對雜交瘤細胞的排斥反應(yīng)，同時能刺激小鼠產(chǎn)生白細胞介素6，是漿細胞的生長因子；為雜交瘤細胞提供適宜的生長環(huán)境，有利于腹水的形成。