本發明涉及寵物外周血凍存技術領域，具體地說，涉及一種用于寵物外周血直接凍存的試劑及方法。

背景技術：

寵物(主要指作為伴侶動物的狗和貓)能夠陪伴人類，緩解日常生活中的壓力，愉悅心情，促進人類健康，成為家庭中的一員。隨著我國經濟的發展、老齡化程度的加重，對寵物的需求越來越大。寵物數量增加的同時，寵物食品、寵物用品、寵物培訓等產業得到了蓬勃的發展。寵物健康領域并沒有受到足夠的關注，也尚未形成規范。相比人類健康市場，寵物健康市場有很大的空間尚待挖掘。關愛寵物，關注寵物健康。

寵物外周血中除了占絕大多數的血細胞外，還含有豐富的單核細胞、細胞因子。最近研究表明，通過置換年輕動物和老年動物的血液，可以讓年輕動物表現出衰老狀態，而老年動物可以返老還童，這些奧秘可能與年輕血液中的細胞因子有關。外周血不僅取材方便，而且功能豐富，其中T淋巴細胞可以經過嵌合抗原受體改造，體外擴增后用于治療淋巴瘤等惡性腫瘤；NK細胞可以幫助機體抵抗衰老，用于美容；MSC細胞可以有效緩解機體炎癥反應，用于治療關節炎等。然而這些有益效果均取決于一份健康的外周血，一旦寵物衰老或者患病后這些細胞的活力都會顯著下降，使用非自體的外周血細胞又會產生免疫排斥反應。因此，在寵物年輕健康的時候為其凍存一份外周血十分必要。

目前市面上尚未有針對寵物外周血直接凍存的產品存在。參考人類健康領域，外周血一般通過兩種方式凍存，一種是離心濃縮后加入凍存試劑凍存，另一種是提取血液中的不同細胞進行分別凍存。這兩種方式操作上都十分復雜，而且會丟失諸如細胞因子在內的一些有益成分。

技術實現要素：

發明要解決的技術問題

鑒于上述技術課題，發明人反復研究后意外地發現，將二甲基亞砜、羥甲基纖維素鈉、MEM培養基配制成凍存試劑，并將二甲基亞砜、羥甲基纖維素鈉的濃度調整為遠高于傳統凍存試劑中的濃度時，可以實現直接凍存的效果，即，使用該濃度的凍存試劑時，無需對外周血進行濃縮離心等操作，將該凍存試劑與外周血以大致1:1的比例混合后直接凍存于-80℃左右，復蘇后總細胞活力幾乎與新鮮血液相同，可以達到非常優良的凍存效果。

用于解決上述技術問題的方案

(1)一種凍存試劑，包括：羥甲基纖維素鈉10～20W/V％，二甲基亞砜15～35V/V％，MEM培養基65～85V/V％。

(2)一種凍存試劑，包括：羥甲基纖維素鈉10～15W/V％，二甲基亞砜15～30V/V％，MEM培養基65～85V/V％。

(3)如(1)或(2)所述的凍存試劑，還包括：

聚乙烯吡咯烷酮0.1～0.5W/V％，葡萄糖1～10W/V％，肌苷3～7W/V％，碳酸氫鈉0.5～2.5W/V％。

(4)如(1)或(2)所述的凍存試劑在寵物外周血凍存中的用途。

(5)如(3)所述的凍存試劑在寵物外周血凍存中的用途。

(6)一種外周血直接凍存方法，包括如下步驟：

a.將(1)～(3)中任一項所述的凍存試劑分別注入細胞凍存管；

b.采集寵物外周血；

c.30分鐘內，將步驟b中采集的外周血加入步驟a的凍存管中，混勻；

d.將凍存管-80±5℃下凍存一天一夜；

e.將凍存管移入液氮長期存儲。

發明效果

本發明的寵物外周血凍存試劑可以直接凍存寵物外周血，與傳統方法相比，無需對血液進行離心濃縮，最大限度的保留了血液中的有益成分。使用過程中，只需將凍存試劑與血液以大致1：1的比例混合，混勻后可直接在-80℃左右凍存，無需使用傳統凍存試劑時的程序降溫步驟。除此之外，本發明的寵物外周血凍存凍存方法配合該凍存試劑使用，方便、快捷，效果穩定，凍存的外周血在復蘇后，細胞活率高，可以方便寵物在衰老狀態及疾病狀態時利用自身健康外周血中細胞成分進行美容、治療關節炎、抗衰老、腫瘤的免疫治療等。

附圖說明

圖1是對照組的單核細胞2h差速貼壁100X明場照片。

圖2是本發明實施例4的9m單核細胞2h差速貼壁100X明場照片。

具體實施方式

本發明的第一方面是寵物外周血凍存試劑。

本發明的寵物外周血凍存試劑中，主要成分為羥甲基纖維素鈉、二甲基亞砜(DMSO)和MEM培養基。

本發明的凍存試劑中，羥甲基纖維素鈉的濃度優選為10～20W/V％，如果羥甲基纖維素鈉的濃度低于10W/V％，外周血在該試劑中直接凍存的話，復蘇后的細胞存活率較低，無法滿足凍存的要求。如果羥甲基纖維素鈉的濃度高于20W/V％，外周血在該試劑中直接凍存的話，高濃度的羥甲基纖維素鈉會導致外周血中細胞脫水，直接導致細胞死亡。羥甲基纖維素鈉的濃度更優選為10～15W/V％。

本發明的凍存試劑中，二甲基亞砜的濃度優選為15～35V/V％，如果二甲基亞砜的濃度低于15V/V％，外周血在該試劑中直接凍存的話，復蘇后的細胞存活率較低，無法滿足凍存的要求。如果二甲基亞砜的濃度高于35V/V％，外周血在該試劑中直接凍存的話，高濃度的二甲基亞砜會導致嚴重的細胞膜毒性，影響凍存復蘇效率。二甲基亞砜的濃度更優選為15～30V/V％，例如更優選為20V/V％。

本發明的凍存試劑優選還包含增效成分聚乙烯吡咯烷酮0.1～0.5W/V％，葡萄糖1～10W/V％，肌苷3～7W/V％，碳酸氫鈉0.5～2.5W/V％。通過添加這些成分，可以使發明效果更好。

較優的，本發明的凍存試劑含有羥甲基纖維素鈉10W/V％，二甲基亞砜20V/V％，MEM培養基80V/V％；以及聚乙烯吡咯烷酮0.3W/V％，葡萄糖5W/V％，肌苷4W/V％，碳酸氫鈉1.5W/V％。

本發明的第二方面是配合該直接凍存試劑使用的外周血的凍存方法，包括如下步驟：

a.將本發明的外周血凍存試劑分別注入細胞凍存管；

b.采集寵物外周血；

c.30分鐘內，將步驟b中采集的外周血加入步驟a的凍存管中，混勻；

d.將凍存管-80±5℃下凍存一天一夜；

e.將凍存管移入液氮長期存儲。

實施例

下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。

下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。例如，W/V％表示每100ml中含有的重量，單位為g。V/V％表示每100ml中含有的體積，單位為ml。

除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。

1.寵物外周血凍存試劑的制備

分別按照表1所示的量，量取二甲基亞砜(簡稱DMSO，購自SIGMA)、MEM培養基(購自GIBCO)放入250ml藍口瓶(購自蜀牛)，輕搖混勻。然后按照表1所示的量稱取羥甲基纖維素鈉(購自SIGMA)、聚乙烯吡咯烷酮(簡稱PVP，購自SIGMA)、葡萄糖(購自SIGMA)、肌苷(購自SIGMA)、碳酸氫鈉(購自SIGMA)加入上述藍口瓶中，搖晃混勻。待固體全部溶解后用0.22μm濾器(購自MILLIPORE)過濾除菌，過濾至經過高壓滅菌的100ml藍口瓶(購自蜀牛)，制備實施例和比較例，保存于4℃冰箱備用。

表1：凍存試劑的制備

2.寵物外周血的凍存方法

依次按照如下步驟凍存寵物外周血：

a.將大約5ml如表1所示制備的各實施例和比較例的凍存試劑分別注入各10ml細胞凍存管(購自SIGMA)中；

b.使用含乙二胺四乙酸抗凝劑的紫色頭蓋真空采血管(購自康捷)采集寵物外周血約5ml，輕柔顛倒混勻，置于冰上；

c.30min內，將步驟b中采集的外周血分別加入步驟a的凍存管中，輕柔顛倒混勻；

d.立即放入-80℃冰箱(購自PANASONIC)短期凍存；

e.在-80℃冰箱凍存24h后移入液氮(購自MVE)長期存儲；

f.需復蘇時，取出凍存管后迅速放入37℃水浴中，搖晃解凍，解凍后馬上進行后續操作。

3.效果試驗

3.1寵物外周血凍存復蘇后總細胞活力檢測

分別取出含有實施例/比較例的凍存試劑和外周血的凍存管后，迅速放入37℃水浴箱(購自力辰科技)中，搖晃解凍，設置不同凍存復蘇時間點，凍存3個月后復蘇標記為3m，凍存6個月后復蘇標記為6m，凍存9個月后復蘇標記為9m。

另取5ml新鮮的外周血與5ml實施例4的凍存液混合均勻，未經凍存，標記為空白對照組。

使用自動細胞計數儀(購自LIFE TECH)，對各組進行細胞計數及存活率計算。各組分別重復三次，取平均值作為結果。

表2：寵物外周血凍存復蘇后總細胞活力檢測(n＝3)

由實驗結果可知，使用本發明的實施例1～6的凍存試劑直接凍存外周血3個月、6個月、9個月復蘇后總細胞活力相較新鮮血液沒有顯著變化，說明本發明的直接凍存試劑在方便、快捷實現凍存的同時能很好的保護外周血中細胞。

比較例1、2中，羥甲基纖維素鈉的濃度低于10W/V％，復蘇后的細胞存活率較低，無法滿足凍存的要求。

比較例3的凍存試劑中，二甲基亞砜的濃度低于15V/V％，復蘇后的細胞存活率較低，無法滿足凍存的要求。

比較例4的凍存試劑中，羥甲基纖維素鈉的濃度高于20W/V％，復蘇后的細胞普遍皺縮，存活率較低，無法滿足凍存的要求。

比較例5的凍存試劑中，二甲基亞砜的濃度高于35V/V％，復蘇后的細胞碎片較多，存活率較低，無法滿足凍存的要求。

3.2寵物外周血凍存復蘇后單核細胞差速貼壁法培養比較

在上述3.1項中計數完畢后，將空白對照組和實施例4的9m復蘇的外周血移至15ml無菌離心管中。離心機(購自湘儀)900轉3min離心，棄去上清，使用10ml含有10％胎牛血清(購自GIBCO)的DMEM高糖培養基(購自GIBCO)重懸。種入100mm細胞培養皿(購自CORNING)中，5％CO₂，37℃培養箱培養。2h后換液，棄去未貼壁細胞，貼壁細胞大多數為單核細胞。實驗結果如圖1和圖2所示，圖1為空白對照組單核細胞2h差速貼壁100X明場照片，圖2為在實施例4凍存試劑中凍存24h并移入液氮9m后，單核細胞2h差速貼壁100X明場照片。由圖1和圖2可見，兩者無明顯差別，說明本發明的直接凍存試劑在方便、快捷實現凍存的同時能很好的保護外周血中細胞。

以上已對本發明創造的較佳實施例進行了具體說明，但本發明創造并不限于所述實施例，熟悉本領域的技術人員在不違背本發明創造精神的前提下還可作出種種的等同的變型或替換，這些等同的變型或替換均包含在本申請權利要求所限定的范圍內。