本發明涉及生物技術領域，尤其是植物組織培養技術領域，具體涉及一種利用dna甲基化抑制劑構建植物群體的方法。

背景技術：

作為育種工作的物質基礎，育種資源的豐富度直接決定良種選育的效率。當前，除了深入挖掘我國植物種質資源、規模化引進我國十分短缺又迫切需要的基因資源外，利用人工方法創造新的種質資源是解決育種資源匱乏、創造新的種質資源的有效途徑。

目前人工方法創造新的植物種質資源主要包括誘變技術和轉基因技術。與轉基因技術相比，誘變技術雖然具有變化性狀不可控、可能出現有害變化性狀等缺點，但其同時也具有變化群體大、性狀豐富等優點，通過選擇，能夠從變化群體中獲得優良的種質資源。

誘變技術分物理誘變和化學誘變。物理誘變主要使用各種高能射線輻射誘導基因組發生變化。化學誘變是使用各種化學藥劑誘導細胞發生變化，具有簡單、高效、安全的特點。

dna甲基化抑制劑是一種化學誘變劑，其中常用的為5-氮雜胞苷(5-azac)。5-azac是一類不改變基因組序列，但能使基因組甲基化水平降低的堿基類似物，能夠誘導生物發生變化。甲基化變化后，能夠導致相關基因的表達發生變化，引起一系列生理生化變化，從而使植物發生各種性狀的變化(chanetal.,2005；zhang,2008)。研究發現，用甲基化抑制劑處理后，植物整體甲基化水平降低，能夠誘發出一些新的性狀。在小麥的研究中發現，用5-azac處理能夠促進其開花(horváthetal.,2003)；5-azac處理的小麥植株在分蘗數、分蘗率和千粒重均比對照高(陳芳和王子成，2011)。5-azac處理的亞麻出現了矮化和早熟性狀(fiddesetal.,2005)。用5-azac處理水稻能使其對白葉枯病的抗性得到提高(akimotoetal.,2007)。

楊樹屬于楊柳科(salicacae)楊屬(populusl.)植物，為多年生木本喬木，是重要的造林綠化樹種和工業用材樹種。優良的種質資源是楊樹良種選育及雜交育種的必要材料。特別是歐洲黑楊(p.nigra)，僅在我國新疆北部地區有少量分布，基因資源相當匱乏(丁明明等，2008)。因此，亟待開發出一種創造優良楊樹基因資源的方法。

技術實現要素：

本發明針對現有技術中存在的上述缺陷，為進一步豐富楊樹等林木種質資源，提供了一種利用dna甲基化抑制劑構建植物群體的方法。該方法不僅能夠創造新的種質資源，還能夠為表觀遺傳學研究提供材料。

為此，本發明提供了一種利用dna甲基化抑制劑構建植物群體的方法，其包括以下步驟：

1、外植體的選擇、消毒預處理和培養；

2、無菌苗的擴繁；

3、無菌葉片的選擇及預處理；

4、無菌葉片甲基化抑制劑處理；

5、再生芽的生根培養；

6、再生植株的溫室移栽；

其中，所述dna甲基化抑制劑為5-氮雜胞苷(5-azac)。

在本發明優選的實施方案中，步驟1中外植體的選擇是剪取半木質化的新發枝條，剪去葉片，清洗后，放入超凈工作臺；外植體的消毒預處理為剪取5cm左右的莖段，采用75％的酒精滅菌30秒，10％的次氯酸鈉消毒8-10分鐘，用無菌水沖洗外植體3次，滅菌濾紙吸干；外植體的培養是將消毒滅菌后的外植體接種在ms啟動培養基中。

在本發明優選的實施方案中，步驟1中在對外植體進行培養之前，還包括在無菌條件下將外植體材料上與消毒劑接觸過的界面進行切除的步驟。

在本發明優選的實施方案中，步驟2中無菌苗的擴繁是切取上述莖段外植體上生長的1-1.5cm高的芽，接種在生根培養基中，所述生根培養基為1/2ms+iba0.01mg/l+naa0.01mg/l+蔗糖25g/l+植物凝膠2.5g/l。

在本發明優選的實施方案中，步驟3中無菌葉片的選擇是選擇中上部完全展開的葉片；無菌葉片的預處理是在無菌條件下，用醫用手術刀切去0.2mm左右的葉片邊緣，并垂直于葉脈劃3-4個0.5cm左右的傷口。

在本發明優選的實施方案中，步驟4中無菌葉片甲基化抑制劑處理是將劃傷的葉片放置在添加不同濃度5-azac的分化培養基上進行處理，5-azac的濃度分別為0μmol/l、100μmol/l、200μmol/l、400μmol/l、600μmol/l、800μmol/l和1000μmol/l，分化培養基為ms+ba0.5mg/l+naa0.03mg/l+蔗糖30g/l+植物凝膠2.5g/l。

在本發明優選的實施方案中，步驟5中再生芽的生根培養是將0.5-1.0cm的再生芽切下，接種到生根培養基中，所述生根培養基為1/2ms+iba0.01mg/l+naa0.01mg/l+蔗糖25g/l+植物凝膠2.5g/l。

在本發明優選的實施方案中，步驟6中再生植株的溫室移栽是將生根良好、苗高5cm左右的再生植株根系上的培養基徹底清洗，移栽到全自動溫室中，營養缽土壤配方為腐殖土6份、珍珠巖2份、河沙2份。

在本發明優選的實施方案中，培養外植體和處理后葉片的環境條件為光周期16h/8h、光照強度2500lux、溫度27℃/21℃。

在本發明優選的實施方案中，外植體為楊樹外植體，更加優選為歐洲黑楊外植體。

由上述描述可知，與現有技術相比，本發明具備如下優點：

1、本發明提供了一種利用dna甲基化抑制劑5-azac創造植物群體的方法。該方法不改變植物基因組序列，僅改變基因組甲基化水平，具有安全、高效的特點。

2、本發明提供了一種利用dna甲基化抑制劑構建植物群體的方法，其通過在植物組織培養過程中，在分化培養基中添加不同濃度的dna甲基化抑制劑5-azac，從而獲得再生植株群體。該方法簡單易行，能夠在短時間內創造出類型豐富的群體。

3、本發明提供了一種利用dna甲基化抑制劑構建植物群體的方法，其不僅能夠創造新的種質資源，而且獲得的各種變化類型為深入研究甲基化調控機理提供了珍貴材料。

綜上所述，本發明通過在楊樹葉片組織培養的分化培養階段，將不同濃度的5-azac添加在分化培養基中，誘導再生植株發生改變，獲得生長及生理生化等表型性狀產生廣泛變化的群體。本發明可用于楊樹等林木種植資源創新及新品種創制，也可用于構建植物表觀遺傳學研究的突變體庫，具有廣闊的應用前景。

附圖說明

圖1：不同濃度5-azac對歐洲黑楊n46再生芽的影響。

a：未添加5-azac處理，分化11天的狀況；

b：添加400μmol/l5-azac，分化38天的狀況。

圖2：歐洲黑楊5-azac誘導群體中葉片形狀的代表性變化類型。

a：600μmol/l5-azac處理群體中葉片性狀變化株系；

b：800μmol/l5-azac處理群體中葉片性狀變化株系；

c：1000μmol/l5-azac處理群體中葉片性狀變化株系；

d：0μmol/l、600μmol/l、800μmol/l和1000μmol/l5-azac處理群體中葉片性狀變化類型。

具體實施方式

下面通過實施例對本發明作進一步的詳細說明，旨在用于說明本發明而非限定本發明。應當指出，對于本領域技術人員而言，在不脫離本發明原理的前提下，還可以對本發明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也同樣落入本發明的保護范圍之內。

實施例1：利用dna甲基化抑制劑5-azac構建歐洲黑楊群體

1、外植體采集植株培養

將冬眠的歐洲黑楊無性系n46穗條剪成15cm長度，插入直徑6cm的營養缽中，營養土為草炭土、珍珠巖和河沙混合配制(6:2:2)，放置于控溫自動化日光溫室中，溫度25-28℃，期間進行日常的肥水管理和病蟲害防治。

2、外植體選擇

扦插30天后，選取生長健壯、無病蟲害、腋芽飽滿的歐洲黑楊n46半木質化新發枝條，剪去幼嫩的尖端及葉片，保留2mm葉柄，作為外植體。

3、外植體消毒滅菌

(1)清洗

用流動的自來水進行外植體清洗，時間為30分鐘，之后用濾紙吸干表面水分，放入超凈臺中。

(2)酒精滅菌

將上述莖段移入無菌培養皿中，加入75％酒精，輕輕晃動，約30秒后，迅速取出。

(3)次氯酸鈉滅菌

將上述莖段移入無菌培養皿中，倒入50-80ml10％的次氯酸鈉溶液，消毒8-10分鐘，期間輕輕晃動2-3次。

(4)無菌水清洗

將上述莖段移入無菌培養皿中，用無菌水沖洗外植體3次，用滅菌的濾紙吸干外植體表面水分。

4、外植體培養

將上述處理的莖段置于無菌培養皿中，用滅菌過的醫用手術剪刀，將與消毒劑接觸過的莖段兩端界面切除1-1.5mm，之后接種在ms啟動培養基中。

將培養瓶移入組織培養箱，設置培養箱的培養條件為光周期16h/8h，光照強度2500lux，培養溫度為27℃/21℃。

5、無菌苗培養及擴繁

莖段外植體培養20天左右，無菌條件下，切取1-1.5cm高的芽，接種在添加iba0.01mg/l、naa0.01mg/l、蔗糖25g/l、植物凝膠2.5g/l的1/2ms生根培養基中，30天左右擴繁一次，培養環境同上。

6、無菌葉片預處理

選取無菌苗為中上部完全展開葉片，在無菌條件下，用醫用手術刀切去0.2mm左右的葉片邊緣，并垂直于葉脈劃3-4個0.5cm左右傷口。

7、無菌葉片5-azac處理

將預處理的葉片放置在添加不同濃度dna甲基化抑制劑5-azac的ms分化培養基(ba0.5mg/l、naa0.03mg/l、蔗糖30g/l、植物凝膠2.5g/l)上，移入組織培養箱進行培養，5-azac的濃度分別為0μmol/l、100μmol/l、200μmol/l、400μmol/l、600μmol/l、800μmol/l和1000μmol/l。

8、再生芽生根培養

實驗發現，dna甲基化抑制劑5-azac處理會導致葉片分化時間延遲，分化芽減少，處理濃度越高，延遲時間越長、分化芽數越少，參見說明書附圖1。當分化出的再生芽生長到0.5-1.0cm時，將再生芽從基部切下，接種到生根培養基(1/2ms+iba0.01mg/l+naa0.01mg/l+蔗糖25g/l+植物凝膠2.5g/l)中。

9、再生植株溫室移栽

將生根良好、苗高5cm左右的再生植株根系上的培養基徹底清洗，移栽到全自動溫室中，營養缽土壤配方為腐殖土6份、珍珠巖2份，河沙2份。

10、變化群體表型測定

移栽成活后，對其葉片形態進行觀測，參見附圖2。期間進行常規肥水管理，但不噴灑農藥。并于移栽成活3個月后，進行株高、葉綠素、光合生理及保護酶活性的測定，以確定群體的變化范圍，具體見表1-4。

表15-azac誘導歐洲黑楊n46群體生長性狀變化情況

表25-azac誘導歐洲黑楊n46群體的葉綠素含量變化情況

表35-azac誘導歐洲黑楊n46群體的光合特性變化情況

表45-azac誘導歐洲黑楊n46群體的保護酶活性的變化情況