本發明涉及應用生物技術原理人工培育真菌的技術領域，具體涉及蛹蟲草的培育，更具體地涉及蛹蟲草子實體生長期增加營養和防止雜菌擴散的培育方法。

背景技術：

蛹蟲草又名北冬蟲夏草、北蟲草、蛹草、東北蟲草，寄生在鱗翅目、鞘翅目、雙翅目等昆蟲蛹體上，菌性屬中溫性，主要分布在東北、華北、西北等省區。蟲生菌統稱為蟲草屬，屬子囊菌綱肉座菌目麥角菌科。蛹蟲草作為蟲草屬，更為國內外學者普遍接受。蛹蟲草入藥歷史并不悠久，但蛹蟲草與冬蟲夏草在生物學上同屬一個屬，有十分相同或相似的化學成分，而且蛹蟲草的蟲草素、k、ca、se、維生素等對人體有益的成分的含量高于野生冬蟲夏草。大量的藥理藥化實驗及臨床實踐證明，蛹蟲草與野冬蟲夏草一樣對人體有相同或相似的功能，但是蛹蟲草的價格卻遠遠低于名貴的冬蟲夏草，這就給蛹蟲草帶來很大的市場商機。

蛹蟲草從其制菌種到其成熟階段極易受雜菌的感染，又尤其是生長中后期由于子實體逐漸接近成熟度，子實體自身免疫力隨著成熟度的增加而逐漸下降，并且作為蛹蟲草子實體的營養培養基中的營養隨著蛹蟲草子實體的吸收而逐漸減少，這時子實體自身自帶的雜菌或外界感染的雜菌就會開始繁殖并呈現出一個逐漸遞增的趨勢，而剛好子實體還沒有完全長成成熟的蟲草花，此時若不及時采取有效的措施就極易感染雜菌，例如：白霉、綠霉、木霉等。

技術實現要素：

本發明提供一種蛹蟲草子實體生長期的培育方法，其可有效促進蛹蟲草的生長和/或抑制蛹蟲草的染菌，從而提高蛹蟲草的產量和品質。

一種蛹蟲草子實體生長期的培育方法，其特征在于，在蛹蟲草子實體生長營養不足和/或受到雜菌感染時，向蛹蟲草培養基的料盒注入加水稀釋且經過高溫高壓滅菌的牛奶。

本發明解決了蛹蟲草中后期營養不足、雜菌對蛹蟲草子實體侵蝕的問題，阻礙了雜菌在空氣中的傳播。本發明對蛹蟲草注入稀釋過后的純牛奶，不但能阻礙雜菌的生長和擴散還能為失去營養的培養基增加營養，使中后期的蛹蟲草子實體得到二次生長。

其作用原理為：（1）通過稀釋后的牛奶注入染菌或缺乏營養的料盒里，阻斷雜菌和外部空氣接觸，從而無法繼續蔓延傳染。（2）據專家分析鑒定，每100g牛奶中例如含蛋白質3.5g，脂肪4.0g，碳水化合物5g，鈣120mg，磷93mg，鐵0.2mg，維生素b2（核黃素）0.13mg，尼克酸0.2mg，維生素a42mg，維生素c1mg；蛹蟲草生長后期由于培養基營養匱乏，而注入稀釋后的純牛奶可以促進蛹蟲草再次吸收營養，從而促進子實體生長。

選擇牛奶根據成本價值考慮以過期或臨期為佳，變質牛奶不在考慮范圍內。過期或臨期牛奶必須經過加水稀釋高溫高壓滅菌，殺菌完畢的純牛奶在熱量上得到散失，可防止牛奶在蛹蟲草子實體繼續發酵產生大量的熱量，從而將子實體跟部燒傷漚爛。

稀釋的純牛奶須將雜菌全部覆蓋，阻斷雜菌氧氣的吸收，防止雜菌因空氣流動傳染給其它蛹蟲草培養基。進一步，注入牛奶的高度為沒過蛹蟲草培養基至蛹蟲草子實體2/3的高度；且注入牛奶的高度優選為沒過蛹蟲草子實體1/2的高度。

進一步，注入牛奶的操作在蛹蟲草子實體生長30天以上進行。

進一步，所述蛹蟲草子實體生長營養不足的表現為：蛹蟲草子實體生長至3cm以上（優選3.5cm以上），并觀察4-7天，發現蛹蟲草子實體成長緩慢，并且子實體頂端顏色逐步變淺，開始趨向老化。

進一步，所述受到雜菌感染的表現為：蛹蟲草培養基表面出現點狀雜菌（例如白霉、綠霉），并且雜菌感染未超過5%。

進一步，在感染雜菌木霉的情況下，首先將感染木霉的蛹蟲草培養基料盒隔離并丟棄，然后再對剩余的料盒進行注入牛奶的操作。

進一步，對于受到雜菌感染的情況，在進行注入牛奶的操作后，還用二氯異氰尿酸鈉潔霉精對培養房進行消毒。例如，用二氯異氰尿酸鈉潔霉精（有效成分含量：40%）按照1：1（即1公斤水：1袋潔霉精40g），對培養房進行消毒處理。此時，優選培養房溫度保持在20-23℃，濕度控制在80%左右，光照15-19小時，光照強度100-150勒克司。

進一步，當蛹蟲草子實體生長既營養不足又受到雜菌感染時（例如生長緩慢、感染白霉、綠霉、木霉），首先用二氯異氰尿酸鈉潔霉精對培養房進行消毒，然后再進行注入牛奶的操作。例如二氯異氰尿酸鈉潔霉精（有效成分含量：40%）按照1:1（即1公斤水:1袋潔霉精40g）進行消毒。

進一步，所述牛奶以牛奶:水質量比1:6-10（優選1:8）的比例進行稀釋。

由于本發明蛹蟲草子實體生長期的培育方法的有益性，因此可廣泛用于蛹蟲草的通用培育中。

具體實施方式

本發明的基礎源于批量生產之后的中后期階段，并沒有因為本發明而提供特殊的菌種配置或養殖上的差異，因此，本發明可以應用于批量生產，且本發明對于菌種的配置、生長環境的溫度、濕度、光照強度等存在普遍應用性，沒有特殊的要求。

所述蛹蟲草菌種可以為市售的各種蛹蟲草菌種，本發明的方法對蛹蟲草菌種的選擇沒有特別要求。所述蛹蟲草菌種可以在接種于培養基之前，按照本領域的常規方法預先培養為固體菌種或液體菌種的形式，優選為液體菌種的形式。所述蛹蟲草菌種可以按照常規的方法接種于培養基，本發明沒有特別的要求。

在一個具體的實施方案中，在進行注入牛奶的操作前，先將培養房溫度降到16-18℃，且為了防止雜菌在空氣中的傳播，先用二氯異氰尿酸鈉消毒粉1:10稀釋并用打藥機對培養房空氣進行整體消毒，然后再將高溫高壓滅完菌的稀釋牛奶注入料盒里。所述高溫高壓滅完菌是在120-130℃和0.12-0.18mpa下蒸汽滅菌30-90min。

牛奶必須經過稀釋和高溫高壓滅菌，注水罐的出水口要反復進行消毒，以防止交叉感染。蛹蟲草培養基表面長白霉或綠霉點，注入稀釋純牛奶的量以剛好沒過蛹蟲草子實體株體一半為最佳，既可以給蛹蟲草提供營養，又可以阻隔外界空氣，致使雜菌與空氣隔離不再泛濫傳播，太少則會被蛹蟲草培養基吸收之后露出培養基，雜菌一旦接觸空氣又會擴散和傳播。但是，當注入的稀釋純牛奶沒過蛹蟲草子實體整個株體時，蛹蟲草由于無法呼吸外界空氣，又會致使整個株體腐爛死亡。

本發明發現木霉是隨著空氣傳播最快也是最泛濫的，發現蛹蟲草培養基感染木霉，如不及時處理，蛹蟲草培養基將會成片感染，甚至危害到整個培養房。因此，將感染木霉的蛹蟲草培養基料盒輕輕拿下并且做隔離處理，隨后燒毀丟棄，并將高溫高壓殺菌完畢的稀釋牛奶（稀釋牛奶需優選沒過蛹蟲草子實體一半，并且將蛹蟲草培養基全部淹沒）注入沒有感染的蛹蟲草培養基料盒里，可防止木霉擴散。

最后的消毒也是非常關鍵的，為了防止雜菌在空氣的流動傳播，有必要及時做好殺菌消毒工作。例如，用二氯異氰尿酸鈉潔霉精（有效成分含量：40%）按照1:1（即1公斤水:1袋潔霉精40g），高濃度消毒。

在一個更具體的實施方案中，本發明提供的蛹蟲草培育的方法是：（1）將過期或臨期的純牛奶以1：8（即1公斤牛奶：8公斤水）比例進行稀釋，然后進行高溫高壓滅菌（在110-130℃和0.12-0.18mpa下進行蒸汽滅菌20-80min）；（2）將冷卻的稀釋牛奶裝進無菌注水罐里（此無菌注水罐須提前在110-130℃和0.12-0.18mpa下進行蒸汽滅菌20-80min滅菌，注水罐底步出水管用二氯異氰尿酸鈉消毒粉1:10配置消毒水進行擦拭消毒）；（3）向蛹蟲草子實體生長營養不足和/或受到雜菌感染的蛹蟲草培養料盒中注入該加水稀釋且經過高溫高壓滅菌的牛奶（稀釋牛奶沒過蛹蟲草子實體的一半，并且將蛹蟲草培養基全部淹沒）。

本發明通過人工掃菌刺激蛹蟲草原基生長到蛹蟲草子實體生長階段的中后期，是蛹蟲草培養基所含養料下降的過度期，此時蛹蟲草子實體成長緩慢或出現染雜菌的趨勢。因此，本發明作用時間在蛹蟲草子實體生長30天以上為最佳時期，在本實例中注入過期或臨期鮮牛奶6-7天可明顯看見蛹蟲草子實體的變化。

本發明優選使用臨期或過期的鮮牛奶，而不是變質的鮮牛奶，變質的鮮牛奶是牛奶中的細菌和有害菌的滋生，是牛奶酸敗、變味的一個過程，里面的營養物質已經大打折扣。本實例中的過期或臨期純牛奶，必須經過高溫高壓滅菌之后才能使用，這是為了避免純牛奶中滋生細菌等影響蛹蟲草子實體正常生長或再次交叉感染。

在一個具體的實施方案中，冷卻好的稀釋牛奶裝進無菌注水罐里（此無菌注水罐須提前在120-130℃和0.12-0.18mpa下進行蒸汽滅菌30-90min滅菌，注水罐底步出水管用二氯異氰尿酸鈉消毒粉1:10配置消毒水擦拭消毒），在注臨期或過期純牛奶時輕輕拿下料盒棉塞，將注奶管深入培養料盒1cm長即可開始注入牛奶。

蛹蟲草子實體在生長過程中可以按照正常養殖程序進行即可，注完稀釋純牛奶的蛹蟲草子實體除了水位上的變化，蛹蟲草子實體肉眼分辨不出變化，具體變化差異要在6-7天以后才會顯著體現出來。

在后期如果發現蛹蟲草個別培養基料盒水位明顯下降，可再次注入高溫高壓滅菌完畢的稀釋純牛奶，具體制作方法將不在一一詳細說明。

注入稀釋的臨期或過期的純牛奶因為蛹蟲草培養基料盒水分的增加，培養室濕度控制在最常見的80%即可，可以不用刻意去減少或增加濕度，溫度控制在20-23℃，光照15-19小時，光照強度為100-150勒克司。

已經注入過期或臨期稀釋純牛奶的染有雜菌的培養基料盒，要勤于觀察，一旦發現稀釋純牛奶水位下降明顯要及早作出處理，及時增加稀釋純牛奶水位，并將每天消毒劑濃度增加一倍進行房間的消毒。后期按照正常程序繼續養殖即可到子實體采收階段。

采收階段的蛹蟲草由于吸收了稀釋純牛奶后株體含水量增加，過度用力會使蛹蟲草子實體內部水分析出，影響蛹蟲草包裝品質，因此在采收時需輕握輕采、輕拿輕放。

本發明對于蛹蟲草生長中后期出現的生長緩慢、感染雜菌等均適用，不存在菌種差異與地域差異。

以下通過實施例對本發明作進一步詳細的說明，但這些內容不應理解為對本發明的限制。其中未具體載明的操作方法依照本領域的常規操作進行，使用的試劑、原料和菌種等均市售獲得。其中培養基的組分購自北京奧博星。其中，無另外說明的比例關系，均為質量比。

實施例

蛹蟲草菌種在接種于培養基之前，預先培養為液體菌種的形式，并按照常規的方法接種于培養基，本發明沒有特別的要求。

培養基在接完菌種之后放到遮光的環境培養（暗培養）11天，溫度在18℃，濕度保持在60%即可，當蛹蟲草培養基料面長滿雪白的魚鱗狀氣生菌絲，且料面底部蛹蟲草菌絲已經扎根完成，就將蛹蟲草培養基轉入到裝有白熾燈的培養房進行見光轉色處理。

蛹蟲草向下扎根延伸的就是蛹蟲草菌絲，長出培養基的就是氣生菌絲，當看見料盒長滿雪白色均勻的魚鱗狀氣生菌絲以及翻轉料盒發現料盒底部成規則的網狀時，即發菌完成。

進行轉色操作。為了縮短氣生菌絲轉色為黃色的時間，進行如下步驟：進行光照刺激，將培養房白熾燈打開，每天的光照時間為18小時，光照強度為150勒克司，光照期間的溫度為20℃；無光照期間的溫度為22℃，相對空氣濕度為60%。36小時之后可見蛹蟲草培養基氣生菌絲逐漸轉變為黃色。在氣生菌絲轉變為黃色的情況下進行人工的掃菌刺激。

通過人工掃菌能夠刺激蛹蟲草菌絲的生長，刺激蛹蟲草原基的形成，并縮短蛹蟲草長原基的時間，但是人工掃菌刺激不是在任何時候都能進行的。首先，在人工掃菌的的時候必須確保蛹蟲草培養基上的氣生菌絲已經成功轉色成黃色，一旦此步驟沒有完成將不能進行掃菌。另外，蛹蟲草氣生菌絲在培養間還會繼續成長，在轉色期間發現蛹蟲草氣生菌絲高出培養基表面0.02mm左右，且拱出的單個魚鱗狀面積為0.6-0.9平方毫米時，此時光照轉色階段結束，可以進入到人工掃菌刺激蛹蟲草菌絲生長的階段。

人工掃菌刺激階段3-7天可見培養基表面長出蛹蟲草原基，進入蛹蟲草原基分化出芽階段，繼續培養至蛹蟲生長至30-40天，蛹蟲草株體生長至3-4厘米時，蛹蟲草逐漸走向成熟至老化階段，此時盒與盒蛹蟲草蛹蟲草由于所處位置的不同其水分和溫度有一定的差異故而單盒蛹蟲草在生長高度、生長密度、粗度均存在很大的差異，從而單盒之間的產量以及整個批號的產量都會造成很大的影響。當蛹蟲草步入成熟或老化階段時各種雜菌：白霉、綠霉、木霉等有害菌隨著蛹蟲草子實體老化抗病能力減弱而逐漸增加。

當發現蛹蟲草株體長度達到3-3.5或4厘米時，或盒與盒之間高度、粗度存在差異時，或是生長中后期巡視發現雜菌以點狀形態出現在培養基表面，同時為了預防點狀雜菌生長呈片狀或是造成交叉感染其它沒有被污染的蛹蟲草時，即向配培養料盒注入稀釋的高溫高壓滅菌后的純牛奶（牛奶:水質量比為1:8）。通過注入稀釋過后的純牛奶，在給蛹蟲草增加營養物質的同時還能有效隔離蛹蟲草雜菌與空氣接觸，防止雜菌面積擴散以及通過空氣傳播造成周圍蛹蟲草雜菌污染。

注入牛奶的操作如下：滅菌冷卻好的稀釋牛奶裝進無菌注水罐里（此無菌注水罐提前在125℃和0.15mpa下進行蒸汽滅菌45min滅菌，注水罐底步出水管用二氯異氰尿酸鈉消毒粉1:10配置消毒水擦拭消毒），在注牛奶時輕輕拿下料盒棉塞，將注奶管深入培養料盒1cm長即可開始注入牛奶。

蛹蟲草子實體在生長過程中可以按照正常養殖程序進行即可，注完稀釋純牛奶的蛹蟲草子實體除了水位上的變化，蛹蟲草子實體肉眼分辨不出變化，具體變化差異要在6-7天以后才會顯著體現出來。在后期如果發現蛹蟲草個別培養基料盒水位明顯下降，可再次注入高溫高壓滅菌完畢的稀釋純牛奶，具體制作方法同上。

注入稀釋的臨期或過期的純牛奶因為蛹蟲草培養基料盒水分的增加，培養室濕度控制在80%，溫度控制在22℃，光照17小時，光照強度為150勒克司。

已經注入稀釋純牛奶的染有雜菌的培養基料盒，要勤于觀察，一旦發現稀釋純牛奶水位下降明顯要及早作出處理，及時增加稀釋純牛奶水位，此時觀察發現蛹蟲草株體在高度上增加1.5-2.5厘米。每天消毒劑濃度增加一倍，進行房間消毒。后期按照正常程序繼續養殖即可到子實體采收階段。

采收階段的蛹蟲草由于吸收了稀釋純牛奶后株體含水量增加，過度用力會使蛹蟲草子實體內部水分析出，影響蛹蟲草包裝品質，因此在采收時需輕握輕采、輕拿輕放。

對比例1

按照實施例的步驟和條件進行蛹蟲草的培育，所不同的是未進行上述注入牛奶的操作而是直接注入無菌水。

蛹蟲草子實體在生長過程中按照正常養殖程序進行，注完無菌水的蛹蟲草子實體除了水位上的變化，蛹蟲草子實體肉眼分辨不出變化，具體變化差異要在6-7天以后才會顯著體現出來。在后期如果發現蛹蟲草個別培養基料盒水位明顯下降明顯，同樣再注一次無菌水，水位沒過培養基表面高出1-1.5厘米即可，溫度控制在22℃，光照17小時，光照強度為150勒克司。

后期按照正常程序繼續養殖即可到子實體采收階段。

采收階段的蛹蟲草由于吸收了無菌水后株體含水量增加，過度用力會使蛹蟲草子實體內部水分析出，影響蛹蟲草包裝品質，因此在采收時需輕握輕采、輕拿輕放。

結論：觀察發現，對比例1在注入無菌水2天后，培養基出現吸水膨脹現象，并且水位下降0.5厘米，蛹蟲草子實體無變化；在注入無菌水7天后，生長緩慢的蛹蟲草子實體整個株體顏色變深，株體變粗，高度成長了約0.3cm，長有綠霉點、白霉點的蛹蟲草的感染部分沒有擴散，木霉也沒有繼續感染剩余的蛹蟲草。然而，相比于同期的實施例，對比例1比注入稀釋純牛奶的蛹蟲草子實體生長高度要低0.8-1厘米，對比例1最佳增長高度僅約為1.8cm；同時觀察發現，實施例感染雜菌的蛹蟲草點狀雜菌沒有擴散，而對比例1的有部分擴散。

對比例2

按照實施例的步驟和條件進行蛹蟲草的培育，所不同的是，發現蛹蟲草在生長中后期盒與盒之間蛹蟲草高度和粗度存在差異時以及發現蛹蟲草中后期感染雜菌（白霉、綠霉、木霉等）時，不做任何處理。將濕度控制在80%，溫度控制在22℃，光照17小時，光照強度為150勒克司，培養至蛹蟲草成熟采收。此時發現，蛹蟲草盒與盒之間高矮分化明顯，感染雜菌的蛹蟲草有將近5%需要丟棄處理，并且雜菌感染面積擴散。

實施例加入稀釋后的純牛奶采收的蛹蟲草單盒平均干品為35.7g，色澤金黃，鮮艷。對比例1中加入無菌水采收的蛹蟲草單盒干品平均僅為28.6g，顏色略淺于加入稀釋后的純牛奶的蛹蟲草。對比例2不做任何處理的蛹蟲草單盒凈重僅為23.7g，損失嚴重。