本發(fā)明屬于農(nóng)作物栽培技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種玉米單倍體種子快速催芽及去雜的方法。

背景技術(shù)：

玉米利用單倍體誘導(dǎo)系作父本雜交產(chǎn)生的種子中，大約有10％的母本單倍體種子，這些單倍體種子經(jīng)加倍就是我們所需要的雙單倍體自交系。由于單倍體誘導(dǎo)系胚部和胚乳糊粉層都攜帶紫色標(biāo)記，而被誘導(dǎo)母本材料一般不攜帶這些色素標(biāo)記，因此雜交一代種子中母本單倍體表現(xiàn)為胚部無(wú)紫色標(biāo)記、胚乳糊粉層攜帶紫色標(biāo)記(簡(jiǎn)稱pw種子)，雜合種子中胚部和胚乳糊粉層都攜帶紫色標(biāo)記(簡(jiǎn)稱pp種子)，利用上述原理能夠簡(jiǎn)便的區(qū)分單倍體種子和雜合種子。但實(shí)際應(yīng)用中存在以下兩個(gè)問(wèn)題：

①不同母本背景顯色程度不盡相同，導(dǎo)致部分籽粒顯色不明顯，在籽粒階段很難辨別紫色素標(biāo)記，最終會(huì)導(dǎo)致所選取的pw種子中混有10-25％的pp種子，給下一步加倍及去雜過(guò)程增添大量額外工作。

②被誘導(dǎo)母本材料一般為分離群體，被誘導(dǎo)后代中pw種子發(fā)芽勢(shì)不盡相同，因此并不能保證所有pw種子出芽時(shí)間一致，即某一時(shí)間點(diǎn)不同pw種子幼苗長(zhǎng)短不一，這就給后一步幼苗的加倍處理造成較大麻煩，因?yàn)橛酌缂颖稌r(shí)需要幼苗長(zhǎng)度基本保持在一致。

針對(duì)以上問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種玉米單倍體種子快速的浸種催芽及去雜方法，該方法主要包括種子消毒處理、適溫浸種、種子去雜、恒溫催芽、幼苗去雜五個(gè)步驟。通過(guò)本發(fā)明可以達(dá)到以下目的和效果：a)在浸種和催芽階段通過(guò)兩次簡(jiǎn)便的區(qū)分混雜種子和幼苗雜株，使最終幼苗中雜株率降低至5％以下；b)利用一種簡(jiǎn)便的消毒滅菌方法，解決單倍體種子在浸種催芽階段易感病的問(wèn)題，使催芽48小時(shí)后幼苗染病率低于5％；c)單倍體種子從浸種至幼苗伸長(zhǎng)至2-4厘米只需72-90小時(shí)，大量縮短發(fā)芽時(shí)間；d)催芽過(guò)程中將種子置于濾紙上，上下覆蓋麻布，利用麻布進(jìn)行保濕透氣，并利用濾紙隔離防止胚根插入麻布中不易提取幼苗，同時(shí)濾紙能夠快速均勻的吸收儲(chǔ)存于麻布中的水分保證種子吸水充足和一致；e)依據(jù)不同幼苗的伸長(zhǎng)情況選取特定長(zhǎng)度待加倍幼苗而不影響其它未達(dá)標(biāo)幼苗的繼續(xù)生長(zhǎng)，并保持最終pw種子發(fā)芽率在92％以上；。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種玉米單倍體種子快速催芽及去雜方法，該方法主要包括種子消毒處理、適溫浸種、種子去雜、恒溫催芽、幼苗去雜五個(gè)步驟，可降低浸種催芽過(guò)程中感病率，有效縮短發(fā)芽時(shí)間，提高發(fā)芽率和pw種子的純度。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種玉米單倍體種子快速催芽及去雜方法，其步驟是：

1、初篩及種子消毒：選取胚部無(wú)紫色標(biāo)記、糊粉層有紫色標(biāo)記的玉米擬單倍體種子，浸于清水中，室溫(20-30℃，以下相同)浸泡4-6小時(shí)，然后置于稀釋75-100倍的福爾馬林中，室溫消毒30-60分鐘；

2、適溫浸種：取消毒后的種子置于浸種液中28-30℃浸種20-28小時(shí)，所述的浸種液含有體積比為4000-6000：1：50-75的蒸餾水：復(fù)硝酚鈉：30％過(guò)氧化氫溶液；

3、混雜種子剔除：步驟2中經(jīng)浸種過(guò)的單倍體種子胚部色素顯色明顯，剔除胚部有紫色標(biāo)記的混雜種子；

4、恒溫催芽：將步驟3留取的種子置于濾紙上，濾紙的上、下層分別覆蓋麻布，蒸餾水浸濕濾紙及上下層麻布，光照3000-6000lx、恒溫28℃條件下催芽；

5、雜株剔除：幼苗長(zhǎng)度大于1厘米時(shí)，剔除芽鞘尖為紫色的雜株幼苗。

6、選取特定長(zhǎng)度幼苗：步驟5后，依據(jù)不同幼苗的伸長(zhǎng)情況選取特定長(zhǎng)度幼苗用于下一步加倍處理，同時(shí)不影響其它未達(dá)標(biāo)準(zhǔn)長(zhǎng)度幼苗的繼續(xù)生長(zhǎng)。

優(yōu)選的，步驟1中福爾馬林的稀釋倍數(shù)為75倍，消毒時(shí)間為30分鐘。

優(yōu)選的，步驟2)中浸種液由體積比為4000：1：53的蒸餾水：復(fù)硝酚鈉：30％過(guò)氧化氫溶液組成。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)及有益效果：

1、第一次種子去雜仍是基于胚部顯色原理，但通過(guò)浸種后，顯色更加明顯，降低了肉眼辨別難度；第二次去雜是基于芽鞘尖顯色原理，即雜株芽鞘尖表現(xiàn)出紫色標(biāo)記，單倍體芽鞘尖無(wú)標(biāo)記來(lái)區(qū)分，分辨標(biāo)準(zhǔn)簡(jiǎn)便，操作易行。兩次去雜過(guò)程能夠簡(jiǎn)便的將雜株率降至5％以下，無(wú)需借助儀器。

2、該種子消毒方法，操作簡(jiǎn)便效果顯著，使催芽48小時(shí)后種子感病率降至5％以下，基本不會(huì)由于種子感病而影響發(fā)芽率。

3、該浸種催芽方法僅用時(shí)72-90小時(shí)幼苗即可伸長(zhǎng)至2-4厘米，顯著減少發(fā)芽時(shí)間；同時(shí)在操作中，可選取特定長(zhǎng)度幼苗用于下一步加倍處理，并不影響其它未達(dá)標(biāo)準(zhǔn)長(zhǎng)度幼苗的繼續(xù)生長(zhǎng)。

4、該區(qū)分雜合子的方法在加倍處理前進(jìn)行，避免待移栽田間后操作，大量減少了后續(xù)加倍和移栽工作；同時(shí)該方法僅依據(jù)色素變化肉眼即可觀察，操作簡(jiǎn)便易行。

附圖說(shuō)明

圖1為浸泡后混雜種子辨別，箭頭標(biāo)識(shí)處為浸種后紫色標(biāo)記顯現(xiàn)。

圖2為幼苗雜株的辨別，箭頭處為雜株芽鞘尖有紫色標(biāo)記。

圖3為選取特定長(zhǎng)度幼苗用于下一步加倍處理，發(fā)芽先后幼苗之間不相互影響。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：不同滅菌條件下玉米單倍體種子催芽效果的比較

選取正常擬單倍體種子700粒，分成7份各100粒；于室溫浸泡4-6小時(shí)后，分別用如表1所示7種消毒處理方法，然后將種子置于濾紙上，濾紙的上、下層分別覆蓋麻布，蒸餾水以浸濕濾紙及上下層麻布，光照3000-6000lx、恒溫28℃條件下催芽。結(jié)果顯示，48小時(shí)后，稀釋50倍、75倍及100倍福爾馬林溶液(40％甲醛溶液)消毒效果較好，基本能夠?qū)ЬN子率控制在5％以內(nèi)，但稀釋50倍福爾馬林溶液對(duì)種子發(fā)芽率有明顯的影響。因此，推薦消毒組合稀釋75-100倍福爾馬林溶液消毒30-60分鐘，最優(yōu)組合為稀釋75倍福爾馬林溶液消毒30分鐘。

表1不同滅菌條件下催芽結(jié)果

實(shí)施例2：浸種液對(duì)玉米單倍體種子發(fā)芽勢(shì)的影響

選取正常擬單倍體種子400粒，利用實(shí)例1中最優(yōu)消毒方法(稀釋75倍福爾馬林溶液消毒30分鐘)消毒后，分成4份，各100粒，用如表2所示4種浸種液進(jìn)行浸種20-28小時(shí)。結(jié)果顯示，72小時(shí)(包括浸種時(shí)間)發(fā)芽勢(shì)，組合①、②、③明顯優(yōu)于對(duì)照組④，同時(shí)組合①優(yōu)于組合②、③；最終發(fā)芽率也是組合①、②、③明顯優(yōu)于對(duì)照組④，同時(shí)組合①優(yōu)于組合②、③。因此，浸種液最佳組合為組合①，即蒸餾水：復(fù)硝酚鈉：30％過(guò)氧化氫溶液(v:v:v)＝4000:1:53，復(fù)硝酚鈉的產(chǎn)品信息為：為一種總有效成分含量1.8％的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，含鄰硝基苯酚鈉0.6％，對(duì)硝基苯酚鈉0.9％，5-硝基鄰甲氧基苯酚鈉0.3％，水劑，由旭化學(xué)工業(yè)(漳州)有限公司制造。

表2浸種液對(duì)玉米單倍體種子發(fā)芽的影響

實(shí)施例3：玉米單倍體種子快速催芽及去雜方法

1、種子消毒：選取經(jīng)過(guò)初篩選的玉米擬單倍體種子，即胚部無(wú)紫色標(biāo)記、糊粉層有紫色標(biāo)記的種子，置于清水中，室溫下浸泡4-6小時(shí)，然后置于稀釋75-100倍的福爾馬林(40％甲醛溶液)中，室溫消毒30-60分鐘；利用該方法消毒后，約95％的種子在后續(xù)浸種催芽過(guò)程中能夠保持不發(fā)病狀態(tài)，同時(shí)基本不影響發(fā)芽率。

2、適溫浸種：取消毒后的種子置于浸種液中28-30℃浸種20-28小時(shí)，所述的浸種液含有體積比為4000-6000：1：50-75的蒸餾水：1.8％有效成分含量的復(fù)硝酚鈉：30％過(guò)氧化氫溶液。

3、混雜種子剔除：步驟2中經(jīng)浸種過(guò)的單倍體種子胚部色素顯色更加明顯，能夠清晰準(zhǔn)確區(qū)分約80-90％混雜種子，剔除胚部出現(xiàn)紫色標(biāo)記的混雜種子(見(jiàn)圖1)。

4、恒溫催芽：將步驟3留取的種子置于濾紙上，濾紙的上、下層分別覆蓋麻布(麻布保水透氣的同時(shí)，利用濾紙隔離胚根與麻布，防止胚根插入麻布空隙中，不便于拔取幼苗)，噴施蒸餾水以浸濕濾紙及上下層麻布，光照3000-6000lx、恒溫28℃條件下催芽；24-32小時(shí)后種子將露白，48-60小時(shí)后幼苗將伸長(zhǎng)至1-4厘米。

5、雜株剔除：步驟4中，長(zhǎng)度大于1厘米的幼苗可以清晰辨別芽鞘尖部色素累計(jì)情況(見(jiàn)圖2)，芽鞘尖成紫色為雜株予以剔除，此步驟能夠區(qū)分剩余大多數(shù)雜株，最終雜株率降至5％以下；剩余幼苗可以進(jìn)行下一步加倍處理。

6選取特定長(zhǎng)度幼苗：步驟5后，依據(jù)不同幼苗的伸長(zhǎng)情況選取特定長(zhǎng)度幼苗用于下一步加倍處理，同時(shí)不影響其它未達(dá)標(biāo)準(zhǔn)長(zhǎng)度幼苗的繼續(xù)生長(zhǎng)。

實(shí)施例4：玉米單倍體種子快速催芽方法中消毒及浸種對(duì)催芽效果的影響

本實(shí)施例比較了消毒及浸種處理對(duì)玉米單倍體種子催芽效果的影響，方法如下：

對(duì)照組(ck)：利用傳統(tǒng)的砂：水＝100：18基質(zhì)發(fā)芽，種子埋藏于基質(zhì)中；

處理一(消毒+浸種液)：用稀釋75倍的福爾馬林消毒30分鐘；浸種液為蒸餾水：1.8％有效成分含量復(fù)硝酚鈉：30％過(guò)氧化氫溶液(v：v：v)＝4000：1：53，浸種20小時(shí)；

處理二(消毒+無(wú)浸種液)：用稀釋75倍的福爾馬林消毒30分鐘；浸種液為蒸餾水；

處理三(不消毒+浸種液)：用蒸餾水消毒30分鐘；浸種液為蒸餾水：1.8％復(fù)硝酚鈉：30％過(guò)氧化氫溶液＝4000：1：53，浸種20小時(shí)；

處理四(不消毒+無(wú)浸種液)：用蒸餾水消毒30分鐘；浸種液為蒸餾水，浸種20小時(shí)；

結(jié)果顯示(如表3)，對(duì)照組主要缺點(diǎn)在于不便于及時(shí)區(qū)分和提出雜株，及不便于分批分離幼苗；不消毒組種子帶菌率明顯高于消毒組，同時(shí)對(duì)最終發(fā)芽率有一定的影響；無(wú)浸種液組主要缺點(diǎn)是72小時(shí)發(fā)芽勢(shì)明顯低于有浸種液組，同時(shí)對(duì)發(fā)芽率有一定的影響。因此，利用新的浸種催芽方法降低了種子感病率、提高了種子發(fā)芽勢(shì)及發(fā)芽率、簡(jiǎn)化了去雜過(guò)程、實(shí)現(xiàn)了無(wú)損分批處理幼苗。

表3不同催芽處理結(jié)果