本發(fā)明屬于植物培育技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種葉面噴施京尼平苷促進(jìn)羽衣甘藍(lán)生長(zhǎng)的方法及其評(píng)價(jià)方法。

背景技術(shù)：

京尼平苷，英文名稱geniposide，化學(xué)式c17h24o10。易溶于水，溶于乙醇，不溶于石油醚，熔點(diǎn)161～162℃，無毒，通常狀況下為白色結(jié)晶。它是一種由茜草科植物梔子的成熟果實(shí)中提取出來的環(huán)烯醚萜葡萄糖苷，在梔子類藥材中京是主要的藥效部分，其含量一般在3％～8％。

京尼平苷具有一定的抗炎癥和治療軟組織損傷等人體外傷的治療作用?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，京尼平苷對(duì)心血管疾病和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療中也有著很良好的表現(xiàn)。另外在藥理學(xué)方面的研究表明，京尼平苷在治療肝膽類疾病中還具有保肝解毒、抗氧化等生物活性。主要原理是京尼平苷可提高生物體內(nèi)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(gst)的活性，進(jìn)而增加肝內(nèi)谷胱甘肽(gsh)的含量，而谷胱甘肽是生物體重要的解毒劑和抗氧化劑之一，是生物組織內(nèi)的一種重要保護(hù)機(jī)制，因此京尼平苷實(shí)際上是間接達(dá)成了化學(xué)性肝損傷的治愈效果。

京尼平苷除了藥用以外，在另外的領(lǐng)域也有一定的研究應(yīng)用，如可用作合成食用色素、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、生物檢測(cè)劑等。尤其是對(duì)于植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)方方面，京尼平苷是目前為止人們發(fā)現(xiàn)的含量最高的天然植物激素，具有很強(qiáng)的生理活性。京尼平苷對(duì)于植物扦插生根和增產(chǎn)具有很強(qiáng)的促進(jìn)作用，能夠顯著提升扦插植物的存活率，并提高植物產(chǎn)量。同時(shí)京尼平苷本身是無毒易溶于水的物質(zhì)，使用起來非常安全方便，且降解的產(chǎn)物沒有毒副作用。因此京尼平苷作為植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的應(yīng)用前景應(yīng)該是非常良好的，然而近年來對(duì)于京尼平苷在植物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用報(bào)道和文獻(xiàn)研究較少，很大程度上阻礙了京尼平苷在植物領(lǐng)域內(nèi)的應(yīng)用發(fā)展。

羽衣甘藍(lán)，英文名稱kale，學(xué)名brassicaoleraceavar.acephala。二年生的草本植物，是食用甘藍(lán)(卷心菜)的園藝向變種。羽衣甘藍(lán)的結(jié)構(gòu)和形狀均與普通的卷心菜相似，區(qū)別之處在于羽衣甘藍(lán)的中心不會(huì)像普通的卷心菜一樣卷成團(tuán)。總狀花序是頂生，花期為4～5月，傳粉類型是蟲媒花，花瓣為黃色；果實(shí)為扁圓形角果；種子是褐色圓球形。羽衣甘藍(lán)用于園藝美化方面的種類可以分為很多種，按植株高度可分為高型株和矮型株；按葉片表現(xiàn)的形狀和姿態(tài)可以分皺葉、不皺葉及深裂葉等品種；按顏色區(qū)分，邊緣葉的顏色有翠綠色、深綠色、灰綠色、黃綠色等不同品種，中心葉的顏色則有純白色、淡黃色、肉色、玫瑰紅、紫紅等不同品種。

羽衣甘藍(lán)具備很強(qiáng)的耐寒性。其幼苗和成熟植株能在短期內(nèi)經(jīng)受嚴(yán)寒霜凍的危害而不枯萎凋零，但這些表現(xiàn)并不代表羽衣甘藍(lán)可以在長(zhǎng)期嚴(yán)寒的條件中進(jìn)行種植。羽衣甘藍(lán)種子發(fā)芽的最適溫度為18℃～25℃，而植株生長(zhǎng)最適溫度為20℃～25℃。羽衣甘藍(lán)一般采種用的植株需要在2℃～10℃下栽培30天以上的時(shí)間才能通過春化抽薹然后進(jìn)入開花的階段。羽衣甘藍(lán)也可以在夏季高達(dá)35℃的高溫中種植生長(zhǎng)，但在高溫季節(jié)較為缺水的情況下所收獲的葉片葉質(zhì)較堅(jiān)硬，纖維很多。不過充足的陽光光照還是必須的，充足的光照可以使葉片生長(zhǎng)更加快速，長(zhǎng)成的植株品質(zhì)更好。

羽衣甘藍(lán)的生長(zhǎng)過程對(duì)水分需求量較大，干旱缺水時(shí)葉片生長(zhǎng)非常緩慢，所以在種植羽衣甘藍(lán)時(shí)要注意勤澆水。羽衣甘藍(lán)對(duì)土壤適應(yīng)性較強(qiáng)，種植的時(shí)候以腐殖質(zhì)豐富肥沃沙壤土或粘質(zhì)壤土進(jìn)行種植最為合適。在鈣質(zhì)豐富且土壤的ph值在5.5～6.8之間時(shí)生長(zhǎng)最為茂盛。栽培羽衣甘藍(lán)的過程中要經(jīng)常注意追施薄肥，特別是氮肥，并配施少量的鈣質(zhì)，有利于羽衣甘藍(lán)植株生長(zhǎng)和提高生產(chǎn)品質(zhì)。

京尼平苷作為一種天然物質(zhì)成分在醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣泛的研究和應(yīng)用，尤其是在心腦血管以及肝膽疾病方面有著很大的實(shí)用性。雖然京尼平苷在植物生理方面的研究也有一些研究，但展現(xiàn)的研究成果與醫(yī)藥領(lǐng)域相比太少，而且很大一部分文獻(xiàn)的年限相對(duì)久遠(yuǎn)，最近幾年的研究文獻(xiàn)和報(bào)道也是寥寥無幾。并且近年來這一部分文獻(xiàn)和報(bào)道的研究對(duì)象基本都是玉米幼苗、小麥、青菜等很常見的農(nóng)作物，或是對(duì)京尼平苷從梔子或者杜仲這些植物中提取的提取工藝研究，對(duì)于京尼平苷在其他植物體內(nèi)的各種影響研究幾乎是一片空白。

而對(duì)于羽衣甘藍(lán)，目前學(xué)術(shù)上羽衣甘藍(lán)的研究多是研究脅迫作用以及羽衣甘藍(lán)的雜交遺傳研究，對(duì)其植物體內(nèi)的生理指標(biāo)的研究也是少之又少。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明選擇了可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、葉綠素含量、抗壞血酸含量、硝態(tài)氮含量、還原型谷胱甘肽含量、過氧化氫酶(cat)活性這七種植物生理指標(biāo)，主要探究的就是京尼平苷在不同于常見作物的植物體內(nèi)的生理影響作用。選擇這七種指標(biāo)的原因是近年來的文獻(xiàn)研究和報(bào)道中多數(shù)研究的對(duì)象都包括了這七個(gè)指標(biāo)，通過這七個(gè)指標(biāo)的影響可以將羽衣甘藍(lán)與其他植物作物進(jìn)行對(duì)比來探究與京尼平苷對(duì)不同植物的影響有何差別。因此本發(fā)明借由本次實(shí)驗(yàn)，一是繼續(xù)發(fā)掘京尼平苷對(duì)于其他植物常見的生理指標(biāo)的影響，研究其常規(guī)作用；二是希望可以對(duì)目前仍為空白的其他植物領(lǐng)域的研究提供一份有力的實(shí)驗(yàn)證據(jù)和理論基礎(chǔ)，讓京尼平苷的應(yīng)用范圍更加廣泛完善。

本發(fā)明提供一種葉面噴施京尼平苷促進(jìn)羽衣甘藍(lán)生長(zhǎng)的方法，所述方法包括如下步驟，(1)種植：將實(shí)驗(yàn)田劃分為等份的六份，并將所有幼苗平均分成六份種植在對(duì)應(yīng)的區(qū)域，所有的植株都進(jìn)行同等條件的施肥澆水處理；(2)噴施京尼平苷溶液：于種植15日開始每隔5天對(duì)植株進(jìn)行葉面均勻噴施一次京尼平苷溶液，每株每次噴施20ml。

進(jìn)一步的，所述的(2)噴施京尼平苷溶液是指分別配制濃度0、10、20、30、40、50mg/l的京尼平苷水溶液，之后按照劃分順序進(jìn)行噴灑，每株每次噴施20ml，其中0mg/l濃度的為對(duì)照組，即使用清水噴施，并于半年后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

進(jìn)一步的，噴施京尼平苷溶液的濃度為20mg/l時(shí)京尼平苷對(duì)羽衣甘藍(lán)葉片的可溶性糖含量的促進(jìn)作用最大，噴施京尼平苷溶液的濃度為20mg/l時(shí)京尼平苷對(duì)羽衣甘藍(lán)葉片的可溶性蛋白含量的促進(jìn)作用最大。

進(jìn)一步的，噴施京尼平苷溶液的濃度為30mg/l時(shí)京尼平苷對(duì)羽衣甘藍(lán)葉片的葉綠素含量的促進(jìn)作用最大。

進(jìn)一步的，噴施京尼平苷溶液的濃度為30mg/l時(shí)京尼平苷對(duì)羽衣甘藍(lán)葉片的抗壞血酸含量的促進(jìn)作用最大。

進(jìn)一步的，噴施京尼平苷溶液的濃度為30mg/l時(shí)京尼平苷對(duì)羽衣甘藍(lán)葉片的硝態(tài)氮含量的促進(jìn)作用最大。

進(jìn)一步的，噴施京尼平苷溶液的濃度為20mg/l時(shí)京尼平苷對(duì)羽衣甘藍(lán)葉片的還原性谷胱甘肽含量的促進(jìn)作用最大。

進(jìn)一步的，噴施京尼平苷溶液的濃度為20mg/l時(shí)京尼平苷對(duì)羽衣甘藍(lán)葉片的過氧化氫酶活性抑制作用最大。

本發(fā)明還提供一種對(duì)上述方法培植的羽衣甘藍(lán)進(jìn)行生長(zhǎng)指標(biāo)評(píng)價(jià)的方法，以白色葉片品種的羽衣甘藍(lán)為實(shí)驗(yàn)材料，用六種不同濃度的京尼平苷水溶液即0、10、20、30、40、50mg/l噴施羽衣甘藍(lán)成熟植株的葉片，并對(duì)可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、葉綠素含量、抗壞血酸含量、硝態(tài)氮含量、還原型谷胱甘肽含量、過氧化氫酶(cat)活性生理指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明：不同濃度京尼平苷對(duì)可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、葉綠素含量、抗壞血酸含量、硝態(tài)氮含量、還原型谷胱甘肽含量均表現(xiàn)出促進(jìn)作用，對(duì)于過氧化氫酶活性則表現(xiàn)出了抑制作用。

本發(fā)明還提供按照上述方法在促進(jìn)羽衣甘藍(lán)生長(zhǎng)中的應(yīng)用，噴施京尼平苷溶液為10mg/l的濃度下，京尼平苷對(duì)葉綠素、抗壞血酸以及硝態(tài)氮有最小促進(jìn)作用，對(duì)過氧化氫酶活性有最小抑制作用；20mg/l濃度下，京尼平苷對(duì)可溶性糖、可溶性蛋白和還原型谷胱甘肽有最大促進(jìn)作用；30mg/l濃度下，京尼平苷對(duì)葉綠素、抗壞血酸和硝態(tài)氮含量有最大促進(jìn)作用，對(duì)于過氧化氫活性則有最大抑制作用；50mg/l的濃度下，京尼平苷對(duì)可溶性糖、可溶性蛋白和還原型谷胱甘肽含量有最小促進(jìn)作用

本發(fā)明取得了有益的技術(shù)效果，本發(fā)明選擇這七種指標(biāo)的原因是近年來的文獻(xiàn)研究和報(bào)道中多數(shù)研究的對(duì)象都包括了這七個(gè)指標(biāo)，通過這七個(gè)指標(biāo)的影響可以將羽衣甘藍(lán)與其他植物作物進(jìn)行對(duì)比來探究與京尼平苷對(duì)不同植物的影響有何差別。因此借由本次實(shí)驗(yàn)，一是繼續(xù)發(fā)掘京尼平苷對(duì)于其他植物常見的生理指標(biāo)的影響，研究其常規(guī)作用；二是希望可以對(duì)目前仍為空白的其他植物領(lǐng)域的研究提供一份有力的實(shí)驗(yàn)證據(jù)和理論基礎(chǔ)，讓京尼平苷的應(yīng)用范圍更加廣泛完善。本發(fā)明的不同濃度京尼平苷對(duì)可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、葉綠素含量、抗壞血酸含量、硝態(tài)氮含量、還原型谷胱甘肽含量均表現(xiàn)出促進(jìn)作用，對(duì)于過氧化氫酶活性則表現(xiàn)出了抑制作用。

附圖說明

圖1不同濃度京尼平苷對(duì)羽衣甘藍(lán)可溶性糖含量的影響；

圖2不同濃度京尼平苷對(duì)羽衣甘藍(lán)葉片可溶性蛋白含量的影響；

圖3不同濃度京尼平苷對(duì)羽衣甘藍(lán)葉片葉綠素相對(duì)含量的影響；

圖4不同濃度京尼平苷對(duì)羽衣甘藍(lán)葉片抗壞血酸含量的影響；

圖5不同濃度京尼平苷對(duì)羽衣甘藍(lán)葉片硝態(tài)氮含量的影響；

圖6不同濃度京尼平苷對(duì)羽衣甘藍(lán)葉片還原性谷胱甘肽含量影響；

圖7不同濃度京尼平苷對(duì)羽衣甘藍(lán)葉片過氧化氫酶活性的影響。

具體實(shí)施方式

實(shí)驗(yàn)方法：將實(shí)驗(yàn)田劃分為等份的六份，并將所有幼苗平均分成六份種植在對(duì)應(yīng)的區(qū)域。所有的植株都進(jìn)行同等條件的施肥澆水處理。于種植15日開始每隔5天對(duì)植株進(jìn)行葉面均勻噴施一次。分別配制濃度0、10、20、30、40、50mg/l的京尼平苷水溶液，之后按照劃分順序進(jìn)行噴灑，每株每次噴施20ml，其中0mg/l濃度的為對(duì)照組，即使用清水噴施，并于2017年3月11日開始實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

可溶性蛋白含量測(cè)定：用考馬斯亮藍(lán)染色法進(jìn)行測(cè)定。具體操作如下：取2g羽衣甘藍(lán)葉片，加入水3ml研磨成漿，轉(zhuǎn)入10ml離心管，再用4ml水沖洗研缽兩次，一并轉(zhuǎn)入離心管中，用3000r/min離心10分鐘，將上清液轉(zhuǎn)入25ml容量瓶中定容，取0.5ml樣品液于試管中，加入考馬斯亮藍(lán)(g-250)染色液5ml充分搖勻，放置5分鐘，測(cè)量od值，記錄結(jié)果?？扇苄缘鞍缀渴呛饬恐参锎x反應(yīng)強(qiáng)弱和對(duì)外界逆境抵抗能力的一個(gè)重要指標(biāo)，葉片中的可溶性蛋白大多是參與各種各樣代謝反應(yīng)的酶類，也是植物進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)的重要物質(zhì)之一。京尼平苷對(duì)可溶性蛋白含量影響呈先上升后下降的促進(jìn)作用，參見附圖2。且0～20mg/l時(shí)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在20mg/l處達(dá)到促進(jìn)作用的最高峰，之后持續(xù)下降，最后于50mg/l濃度處達(dá)到促進(jìn)作用的最低值。經(jīng)過數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)后，由于10～40mg/l與對(duì)照顯著性差異均表現(xiàn)出差異性顯著(0.01＜p＜0.05)，而50mg/l處表現(xiàn)為不顯著(p＞0.05)。因此可以認(rèn)為京尼平苷對(duì)羽衣甘藍(lán)的可溶性蛋白含量有一定促進(jìn)作用，且最適濃度為20mg/l。

可溶性糖含量測(cè)定：用蒽酮比色法進(jìn)行測(cè)定，具體操作如下：取1g羽衣甘藍(lán)葉片加水3～5ml水研磨3兩次，轉(zhuǎn)入試管中，80℃水浴加熱30min，不時(shí)搖動(dòng)，取出冷卻至室溫，3000r/min離心10min，取上清液定容至25ml。取四支干凈試管編號(hào)1、2、3、4，在1中加入蒸餾水1ml，在2、3、4中分別加入1ml樣品液，并向四支試管中均加入10ml蒽酮試劑，搖勻后使用分光光度計(jì)測(cè)出各管的od值。將2～4管的od值求出平均值，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出含糖量?？扇苄蕴鞘侵参锕夂献饔盟a(chǎn)生的主要產(chǎn)物向外部運(yùn)輸和在莖稈細(xì)胞中儲(chǔ)存的主要形式，可溶性糖含量多少是體現(xiàn)葉片光合能力的一個(gè)重要指標(biāo)。本次實(shí)驗(yàn)測(cè)定的是可溶性糖的總糖含量。京尼平苷對(duì)可溶性糖含量影響呈先上升后下降的促進(jìn)作用，參見附圖1，且0～20mg/l時(shí)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在20mg/l處達(dá)到促進(jìn)作用的最高峰，之后持續(xù)下降，并于50mg/l濃度處達(dá)到促進(jìn)作用的最低值。經(jīng)過數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，10～40mg/l濃度區(qū)間與對(duì)照差異均表現(xiàn)出顯著性差異(0.01＜p＜0.05)，而50mg/l處表現(xiàn)為不顯著(p＞0.05)。所以可以由此得出結(jié)論，京尼平苷對(duì)羽衣甘的藍(lán)可溶性糖含量有一定促進(jìn)作用，且最適濃度為20mg/l。

抗壞血酸含量測(cè)定：具體操作方法如下，稱取羽衣甘藍(lán)葉片10g，放在研碎中加入2％草酸溶液約5ml研碎。通過漏斗將研碎的樣品倒入100ml容量瓶中，研碎及杵用2％草酸溶液沖洗，并將洗夜一并倒入容量瓶中，最后用2％草酸溶液定容，過濾，濾液備用。取濾液10ml于蒸發(fā)皿中，用已標(biāo)定過的2，6-二氯酚靛酚溶液滴定呈粉紅色，并且在30s內(nèi)不退色為終點(diǎn)，記下染料的用量(重復(fù)3次，取平均值)?？箟难崾侨祟悹I(yíng)養(yǎng)所需的維生素中重要的維生素之一，嚴(yán)重缺乏抗壞血酸時(shí)會(huì)導(dǎo)致人體患上壞血病。抗壞血酸的含量多少也是衡量蔬菜、水果品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。京尼平苷對(duì)于抗壞血酸含量整體呈現(xiàn)促進(jìn)作用，參見附圖4，且0～30mg/l時(shí)呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，并在30mg/l濃度處達(dá)到最大值。之后開始進(jìn)入下降趨勢(shì)，由圖中數(shù)據(jù)位置可得出此時(shí)最低促進(jìn)濃度是10mg/l。經(jīng)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，10～50mg/l與對(duì)照顯著性差異均表現(xiàn)為顯著(0.01＜p＜0.05)，因此可以認(rèn)為京尼平苷對(duì)羽衣甘藍(lán)抗壞血酸含量有著顯著的促進(jìn)作用，且最適促進(jìn)濃度為30mg/l。

硝態(tài)氮含量測(cè)定：具體操作如下：稱新鮮羽衣甘藍(lán)葉片1～2g研成勻漿，(或稱經(jīng)70℃烘干磨碎過60目，即孔徑0.25mm篩的干樣100mg)裝入20ml具塞刻度試管，加無離子水10～20ml，蓋緊塞子，置于45℃恒溫水浴浸提1h，其間不斷搖動(dòng)，然后過濾或離心(如含色素需脫色)，濾液備用。吸取樣品液0.1ml放入的試管中，再分別加入0.4ml的5％水楊酸-硫酸溶液，搖勻，在室溫下放置20min后，再加入8％naoh溶液9.5ml，搖勻冷卻至室溫，以空白作參比，在410nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。樣品中硝態(tài)氮含量(μg/g)＝mx×v/v1×w，mx：標(biāo)準(zhǔn)曲線查出測(cè)定液中硝態(tài)氮含量(μg)，v：樣品提取液總體積(ml)，v1：用于測(cè)定的樣品液(ml)，w：樣品鮮重或干重(g)。硝態(tài)氮含量是評(píng)價(jià)葉菜類蔬菜品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)。硝態(tài)氮含量過多會(huì)轉(zhuǎn)化為對(duì)生物體有毒性的亞硝酸鹽，從而引發(fā)機(jī)體的部分病變；硝態(tài)氮含量過少植物則無法進(jìn)行相應(yīng)的生理代謝作用，阻礙了植物的健康生長(zhǎng)。因此，測(cè)定植物中硝態(tài)氮含量，除了能反映植物體內(nèi)的氮素營(yíng)養(yǎng)狀況，還可以鑒定蔬菜及其加工品質(zhì)的好壞。京尼平苷對(duì)于硝態(tài)氮含量整體呈現(xiàn)促進(jìn)作用，參見附圖5，且0～30mg/l時(shí)呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，并在30mg/l濃度處得到最大值。之后開始進(jìn)入下降趨勢(shì)，由圖中數(shù)據(jù)位置可得出此時(shí)最低促進(jìn)濃度是10mg/l。經(jīng)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，各個(gè)濃度與對(duì)照差異均表現(xiàn)出顯著性差異(0.01＜p＜0.05)。因此可以認(rèn)為京尼平苷對(duì)羽衣甘藍(lán)的硝態(tài)氮含量有顯著的促進(jìn)作用，且最適促進(jìn)濃度為20mg/l。

還原型谷胱甘肽含量測(cè)定：具體操作如下：取材后，稱取2.5g羽衣甘藍(lán)葉片置于研缽中，加入5ml經(jīng)4℃預(yù)冷的50g/l三氯乙酸溶液(含5mmol/lna2-edta)，在冰浴條件下研磨成勻漿后，于4℃、12000g離心20min。收集上清液來測(cè)定谷胱甘肽含量，測(cè)量提取液體積。取1支試管，依次加入1ml蒸餾水、1ml0.1mol/l磷酸緩沖液(ph7.7)和0.5ml4mmol/ldtnb溶液，混勻，即為繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的0號(hào)管液。以此溶液作為參比，在波長(zhǎng)412nm處對(duì)分光光度計(jì)進(jìn)行調(diào)零。另取2支試管，分別加入1ml上清液、1ml0.1mol/l磷酸緩沖液(ph7.7)。向一支試管加入0.5ml4mmol/ldtnb溶液，另一支試管中加入0.5ml0.1mol/l磷酸緩沖液(ph6.8)，將兩支試管置于25℃保溫10min。根據(jù)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法，迅速測(cè)定顯色液在波長(zhǎng)412nm處的吸光度，分別記作ods和odc。重復(fù)3次顯色反應(yīng)后，分別記錄樣品管混合液的吸光度(ods)和空白對(duì)照管反應(yīng)混合液的吸光度(odc)。根據(jù)吸光度差值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的還原型谷胱甘肽量，計(jì)算還原型谷胱甘肽含量(μmol/g)。還原型谷胱甘肽含量(μmol/g)式中，n為由標(biāo)準(zhǔn)曲線查的的溶液中還原型谷胱甘肽物質(zhì)的量(μmol)；v為樣品提取液總體積(ml)；vs為吸取樣品液體積(ml)；m為樣品質(zhì)量(g)。還原型谷胱甘肽是一種含巰基的低分子肽，在植物中的含量非常豐富，是植物機(jī)體內(nèi)的重要活性物質(zhì)。它能幫助清除生物體內(nèi)的自由基，是植物體內(nèi)受到氧化脅迫時(shí)所產(chǎn)生的過氧化物的最有效的清除劑之一。植物機(jī)體內(nèi)的氧化型谷胱甘肽可以轉(zhuǎn)化為還原型谷胱甘肽，還原型谷胱甘肽含量則是反映植物體內(nèi)谷胱甘肽活性的重要指標(biāo)。京尼平苷對(duì)于谷胱甘肽含量整體呈現(xiàn)促進(jìn)作用，參見附圖6，且0～20mg/l時(shí)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在20mg/l處得到促進(jìn)作用的最高峰，之后持續(xù)下降，最后于50mg/l濃度處得到促進(jìn)作用的最低值。經(jīng)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。10～40mg/l濃度區(qū)間與對(duì)照顯著性差異均表現(xiàn)出差異性顯著(0.01＜p＜0.05)，而50mg/l處表現(xiàn)為不顯著(p＞0.05)。因此可以認(rèn)為京尼平苷對(duì)羽衣甘藍(lán)谷胱甘肽含量便顯出一定的促進(jìn)作用，且最適促進(jìn)濃度為20mg/l。

葉綠素含量測(cè)定：采集成熟、長(zhǎng)勢(shì)好的無病害蟲羽衣甘藍(lán)葉片，用干凈的紗布擦凈葉片表面污物避開主脈部分進(jìn)行取樣。稱取約0.1000g碎片(長(zhǎng)、寬均為0.2-0.3cm)置于20ml比色管中，加入15ml的萃取液(丙酮∶酒精＝1∶1混合液)，避光浸泡24h，直至看到葉片材料完全失去綠色為止，中間顛倒混合幾次，使得萃取液的顏色均勻。用紫外-可見分光光度計(jì)在445nm、470nm、474nm、485nm、642.5nm、649nm和665nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定胡蘿卜素、葉黃素提取液的吸光值。并按照以下公式，計(jì)算單位面積胡蘿卜素、葉黃素和總類胡蘿卜素的含量：

葉綠素a濃度(mg.l^-1)＝9.99a665-0.0867a642.5

葉綠素b濃度(mg.l^-1)＝17.7a642.5-3.04a665

總類胡蘿卜素濃度(mg.l^-1)＝4.92a474-0.0255[a]-0.225[b]

類胡蘿卜素總含量(mg/g.fw)＝類胡蘿卜素(mg.l^-1)*提取液總體積(l)/樣品鮮重(g)。

其中公式中[a]為葉綠素a的濃度(mg.l^-1)，[b]為葉綠素b的濃度(mg.l^-1)。

葉綠素在光合作用的光能吸收和轉(zhuǎn)化中起關(guān)鍵作用，植物體內(nèi)葉綠素含量水平的高低以及光合速率的快慢與植物的生長(zhǎng)過程有密切關(guān)系。京尼平苷對(duì)羽衣甘藍(lán)葉綠素含量影響趨勢(shì)較為平緩參見附圖3，推測(cè)是由于所用的白葉羽衣甘藍(lán)本身葉片含量不多所導(dǎo)致的。而0～30mg/l時(shí)呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，并在30mg/l濃度處達(dá)到最大值。之后略微下降并趨于平緩，由圖中數(shù)據(jù)點(diǎn)的位置可看到此時(shí)最低促進(jìn)濃度是10mg/l。經(jīng)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，各組的顯著性差異均呈現(xiàn)出極大差異(p＜0.01)，借此可以推斷京尼平苷對(duì)羽衣甘藍(lán)葉綠素含量有著極顯著的促進(jìn)作用，且最適促進(jìn)濃度為30mg/l。

過氧化氫酶活性測(cè)定：具體操作如下：稱取剪碎混勻的羽衣甘藍(lán)葉片1.00g置與預(yù)冷的研缽中，加入適量預(yù)冷的ph7.0磷酸緩沖液和少量石英砂冰浴研磨成勻漿后，轉(zhuǎn)入10ml容量瓶中，并用緩沖液沖洗研缽數(shù)次，合并沖洗液，并定容到10ml。取提取液5ml于離心管中，在4℃、15000g下離心15min，上清液即為過氧化氫酶粗提液，4℃下保存?zhèn)溆?。?0ml具塞試管，加2ml酶提取液于沸水浴中加熱煮死，冷卻備用。取10ml具塞試管，3支為測(cè)定管(3個(gè)重復(fù))，1支為對(duì)照，按下表加入試劑：

將上述4支試管于25℃水浴中預(yù)熱3min后，逐管加入0.2ml0.2mol/l的h2o2溶液，每加完一管立即在紫外分光光度計(jì)上測(cè)定a240(蒸餾水調(diào)零)，每隔30s讀數(shù)一次，共測(cè)3min，記錄4支試管的測(cè)定值。(需用石英比色杯)。以1min內(nèi)a240降低0.1(三支測(cè)定管的平均值)的酶量為1個(gè)酶活單位(u)，先求出3支測(cè)定管各自1min內(nèi)a240降低值，按下式計(jì)算cat活性。

過氧化氫酶活性(u/gfw/min)＝δa240×vt/(0.1×v1×t×fw)

式中δa240＝as0-(as1+as2+as3)/3

as0-加入煮死酶液的對(duì)照管吸光值；

as1，as2，as3-樣品測(cè)定管吸光值；

vt-酶提取液總體積(ml)；

v1-測(cè)定時(shí)用酶液體積(ml)；

fw-樣品鮮重(g)；

0.1-a240每下降0.1為1個(gè)酶活單位(u)；

t一加過氧化氫到最后一次讀數(shù)時(shí)間(min)。

植物組織在逆境情況下或衰老時(shí)，由于體內(nèi)活性氧代謝加強(qiáng)而使h2o2等氧化性物質(zhì)產(chǎn)生累積。h2o2能夠直接或間接地將細(xì)胞內(nèi)核酸，蛋白質(zhì)等生物大分子進(jìn)行氧化，并使細(xì)胞膜蛋白受到很嚴(yán)重的損害，從而加速細(xì)胞的衰老和解體。過氧化氫酶可以分解和清除h2o2，是組成植物體內(nèi)重要的酶促防御系統(tǒng)的酶類之一。京尼平苷對(duì)于過氧化氫酶活性整體表現(xiàn)為抑制作用，參見附圖7，且0～30mg/l濃度區(qū)間呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)，在30mg/l時(shí)得到最低值，即京尼平苷對(duì)過氧化氫酶的最大抑制濃度。之后開始上升，并10mg/l濃度處有最小抑制作用。由數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，各濃度的差異均表現(xiàn)出顯著差異性(0.01＜p＜0.05)，由此可以得出結(jié)論，京尼平苷對(duì)羽衣甘藍(lán)體內(nèi)的過氧化氫活性表現(xiàn)出顯著的抑制作用，且最大抑制作用濃度為30mg/l。

京尼平苷對(duì)羽衣甘藍(lán)的可溶性糖、可溶性蛋白、硝態(tài)氮、還原性谷胱甘肽、葉綠素、抗壞血酸的含量均有促進(jìn)作用，而對(duì)于過氧化氫酶活性則相反，是存在抑制作用。究其原因可能是京尼平苷本身有利于植物光合效率的提高，間接促進(jìn)了可溶性糖、可溶性蛋白等的積累，而可溶性糖、可溶性蛋白也能夠參加植物體內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)作用，從而提高植物對(duì)逆境的適應(yīng)能力，減少植物體內(nèi)自由基、活性氧的產(chǎn)生，因而導(dǎo)致了酶的活性下降。另外，對(duì)于羽衣甘藍(lán)的葉綠素含量，京尼平苷雖然表面上呈現(xiàn)平緩的促進(jìn)趨勢(shì)，然而白葉羽衣甘藍(lán)本身葉片中葉綠素含量也較少，并且根據(jù)最后的數(shù)據(jù)分析，顯著性差異反而體現(xiàn)出了極大的顯著性(p＜0.01)。因此，京尼平苷對(duì)于羽衣甘藍(lán)的葉綠素含量有極其顯著的促進(jìn)作用。

而在另外五個(gè)指標(biāo)中，京尼平苷均表現(xiàn)出了良好的促進(jìn)作用。錢善勤等學(xué)者的研究也表明，京尼平苷對(duì)多種作物型，植物的生長(zhǎng)及生理指標(biāo)都有很好的促進(jìn)作用。本次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果中可以看出，主要的促進(jìn)濃度體現(xiàn)在20mg/l和30mg/l兩個(gè)濃度中，10、40、50mg/l三個(gè)濃度也有促進(jìn)但普遍體現(xiàn)的影響較為薄弱。京尼平苷本身是從植物中提取的，使用上安全、無毒副作用，對(duì)于植物和土地沒有污染，因此可以認(rèn)為京尼平苷是很好的植物生理調(diào)節(jié)劑。但由于本次實(shí)驗(yàn)是畢業(yè)論文性質(zhì)的實(shí)驗(yàn)而非嚴(yán)格意義上的生物學(xué)研究實(shí)驗(yàn)，而且由于實(shí)條件和時(shí)間的限制，許多重要的生理指標(biāo)實(shí)驗(yàn)諸如sod活性等的測(cè)定工作無法展開，所以本次的實(shí)驗(yàn)只能在較為基本且普遍的程度上體現(xiàn)出京尼平苷對(duì)植物的生長(zhǎng)及生理指標(biāo)的促進(jìn)作用。如需進(jìn)行大量且精確的驗(yàn)證則應(yīng)該在專業(yè)的大型生物實(shí)驗(yàn)田以及實(shí)驗(yàn)條件設(shè)備齊全的大型實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。因此由本次實(shí)驗(yàn)的結(jié)論來看，京尼平苷作為生物調(diào)節(jié)劑對(duì)日本進(jìn)口白葉羽衣甘藍(lán)的各項(xiàng)生理指標(biāo)具有很好的調(diào)節(jié)作用，然而對(duì)其他植物上的使用進(jìn)行大量推廣的構(gòu)想還需進(jìn)行對(duì)其他植物更進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

上述內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，本發(fā)明不限于這里所述的特定實(shí)施例，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說能夠進(jìn)行各種明顯的變化、重新調(diào)整和替代而不會(huì)脫離本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，雖然通過以上實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了較為詳細(xì)的說明，但是本發(fā)明不僅僅限于以上實(shí)施例，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的情況下，還可以包括更多其它等效實(shí)施例，而本發(fā)明的范圍由所附的權(quán)利要求范圍決定。