本發(fā)明涉及分子生物學(xué)，具體地說，涉及牙齦卟啉單胞菌提取物在制備胚胎腭裂模型相關(guān)產(chǎn)品中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、口腔微生物是人體三大菌庫之一，除了與口腔疾病如齲齒和牙周病有關(guān)外，其與全身疾病如心腦血管疾病，糖尿病，不良妊娠結(jié)局，呼吸系統(tǒng)疾病等的關(guān)系也越來越受到重視。目前認(rèn)為口腔微生物能夠經(jīng)由口腔黏膜和牙周袋，通過直接播散、血行、免疫等多種途徑傳播到不同的身體部位，從而引起全身或局部感染。2017年第四次全國口腔健康流調(diào)顯示，在我國成人牙周疾病患病率高達(dá)80%以上，且在妊娠婦女中高發(fā)，因而以牙齦卟啉單胞菌為代表的牙周致病菌引起的牙周病已成為當(dāng)今最常見的公共衛(wèi)生問題之一。隨著研究方法和技術(shù)的進(jìn)步，近幾年牙齦卟啉單胞菌被發(fā)現(xiàn)與多種疾病有關(guān)，如阿爾茨海默癥、糖尿病、腫瘤、動脈粥樣硬化等，它含有多種致病因子，主要分為2大類，包括其自身成分在內(nèi)的脂多糖、菌毛、纖毛、外膜、夾膜、熱休克蛋白等，以及其分泌產(chǎn)物如牙齦素、膜外囊泡等。腭裂作為人類最常見的顱面出生缺陷，其病因復(fù)雜，遺傳和環(huán)境因素均有參與。由于復(fù)雜的子宮微環(huán)境是直接影響胚胎發(fā)育的環(huán)境因素，擾亂子宮微環(huán)境可能導(dǎo)致胚胎畸形，因而母體感染細(xì)菌或病毒等一直被認(rèn)為是腭裂發(fā)生的重要的致病因子。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為胎兒在子宮的無菌環(huán)境中發(fā)育，然而，最近的證據(jù)表明母體口腔微生物可以垂直傳播到子宮，影響子宮微環(huán)境，其中與宮內(nèi)感染有關(guān)的多為牙齦卟啉單胞菌等牙周致病菌。一項病例對照研究也揭示了母親牙周病與子代腭裂之間可能存在的強烈關(guān)聯(lián)，然而其確切關(guān)系尚不清楚。因而明確牙齦卟啉單胞菌感染對腭部發(fā)育及腭裂發(fā)生的影響及其主要途徑，不僅能為臨床遺傳咨詢、疾病預(yù)防提供依據(jù)，而且對優(yōu)生優(yōu)育和提高我國出生人口質(zhì)量具有重要的意義。

2、由于獲取腭裂的產(chǎn)婦或胚胎樣本困難，且根據(jù)胚胎學(xué)和病因?qū)W研究，小鼠是一種容易獲得的實驗動物，其產(chǎn)仔率高，與人類的基因序列同源程度高（99%），被公認(rèn)為是大多數(shù)研究的合適動物模型。因此多選用小鼠作為腭裂體內(nèi)實驗研究的重要模型。而目前關(guān)于牙齦卟啉單胞菌對包括小鼠在內(nèi)的腭部發(fā)育和腭裂發(fā)生的影響尚未見報道。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供牙齦卟啉單胞菌提取物用于構(gòu)建腭裂動物模型的方法，進(jìn)而提出以牙齦卟啉單胞菌為代表的微生物的新應(yīng)用。

2、本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

3、第一方面，本發(fā)明提供了使用牙齦卟啉單胞菌提取物構(gòu)建胚胎腭裂模型的方法。其通過在妊娠第2.5天至14.5天每隔1天向孕鼠施用牙齦卟啉單胞菌提取物來構(gòu)建，所述孕鼠為用藥前懷有正常胎鼠的孕鼠。

4、所述胎鼠的腭裂是因牙齦卟啉單胞菌提取物的使用造成腭發(fā)育階段巨噬細(xì)胞胞葬作用異常和腭突成骨異常進(jìn)而導(dǎo)致腭融合異常引起的。

5、本發(fā)明在妊娠的特定時期，對孕鼠施用牙齦卟啉單胞菌提取物，可有效引起胚胎腭裂，進(jìn)而成功構(gòu)建腭裂動物模型，方法簡單，成功率高，為孕期以牙齦卟啉單胞菌為代表的微生物感染母體進(jìn)而影響子代頜面發(fā)育及相關(guān)研究提供了新的方法。

6、本發(fā)明的構(gòu)建方法中，施用方法為尾靜脈注射聯(lián)合經(jīng)口灌胃，每天的注射劑量為4mg/kg。

7、尾靜脈注射聯(lián)合經(jīng)口灌胃的方法操作方便、實驗結(jié)果說明性強，胚胎死亡率低。

8、本發(fā)明構(gòu)建的模型可以觀察出生后胎鼠腭部的表型變化，以及檢測融合階段巨噬細(xì)胞胞葬情況和腭突細(xì)胞成骨情況，從而更好地說明牙齦卟啉單胞菌提取物對腭裂發(fā)生的影響。

9、第二方面，本發(fā)明提供了牙齦卟啉單胞菌提取物在構(gòu)建胚胎腭裂藥物中的應(yīng)用。

10、本發(fā)明的應(yīng)用中，所述藥物的活性成分以游離形式或可藥用鹽的形式存在。

11、所述的活性成分或其可藥用鹽還可以依據(jù)施用情況的需求，以水合物或其它溶劑的形式使用。

12、本發(fā)明的應(yīng)用中，所述藥物含有至少一種可藥用載體。

13、本發(fā)明的應(yīng)用中，所述藥物的給藥方式為口服、靜脈注射。

14、本發(fā)明的藥物可以用現(xiàn)有常規(guī)的方法進(jìn)行制備，例如通過常規(guī)的混合、制粒、包糖衣、溶解或冷凍干燥法來制備。其可包含治療有效量的藥理學(xué)活性成分或者還可以同時包含一種或多種可藥用的載體。本發(fā)明藥物優(yōu)選的給藥途徑是靜脈注射和口服灌胃。

15、本發(fā)明的藥物的劑型可以是糖衣片、片劑或膠囊。各劑型中單個劑量所包含的活性成分的單位含量本身不一定需要構(gòu)成有效量，其可以通過施用多個劑量單位來達(dá)到所必需的有效量，即靜脈注射2mg/kg+經(jīng)口灌胃2mg/kg。

16、在制備用于口服劑型的藥物時，可以使用任何常規(guī)的藥用介質(zhì)，例如水、二醇類、油類或醇類；或在口服固體制劑例如粉劑、膠囊和片劑的情況中可使用載體如淀粉、糖、微晶纖維素、稀釋劑、造粒劑、潤滑劑、粘合劑、崩解劑等等。

17、本發(fā)明的應(yīng)用中，所述藥物在胚胎形成至腭發(fā)育（腭突融合）時施用。

18、本發(fā)明的有益效果至少在于：

19、本發(fā)明提供了一種新的利用牙齦卟啉單胞菌提取物制備胚胎腭裂模型的構(gòu)建方法，擴(kuò)展了以牙齦卟啉單胞菌為代表的微生物的應(yīng)用領(lǐng)域及牙周病與系統(tǒng)性疾病的聯(lián)系，深入了母體微生物如何影響胚胎發(fā)育并為腭裂發(fā)生和預(yù)防治療機(jī)理研究提供了理論基礎(chǔ)。本發(fā)明的胚胎腭裂動物模型建模周期短，操作簡單，費用低，腭裂率達(dá)12.5%。

20、說明書附圖

21、圖1為空白對照組（control）、實驗組（p.?g）的部分體式顯微鏡觀察結(jié)果。

22、圖2為空白對照組（control）、實驗組（p.?g）的部分he染色結(jié)果。

23、圖3為空白對照組（control）、實驗組（p.?g）的部分masson染色結(jié)果（藍(lán)染部分為骨膠原纖維），實驗組成骨能力下降是腭裂發(fā)生的原因之一。

24、圖4為空白對照組（control）、實驗組（p.?g）的masson染色定量分析結(jié)果。

25、圖5為空白對照組（control）、實驗組（p.?g）的部分免疫熒光染色顯示e15時巨噬細(xì)胞對凋亡上皮細(xì)胞行使胞葬功能的部分觀察結(jié)果（mertk示行使胞葬功能的巨噬細(xì)胞，tunel示凋亡上皮細(xì)胞，胞葬異常是牙齦卟啉單胞菌提取物導(dǎo)致腭裂發(fā)生的主要原因）。

26、圖6為空白對照組（control）、實驗組（p.?g）的胞葬功能定量分析結(jié)果。

27、實施方式

28、下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的優(yōu)選實施方式進(jìn)行詳細(xì)說明。需要理解的是以下實施例的給出僅是為了起到說明的目的，并不是用于對本發(fā)明的范圍進(jìn)行限制。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不背離本發(fā)明的宗旨和精神的情況下，可以對本發(fā)明進(jìn)行各種修改和替換。

29、下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

30、本發(fā)明具體實施方式部分中，所用部分實驗材料、試劑如下：

31、c57bl/6小鼠，雌鼠：健康，6-8周，22-25g；雄鼠：健康，8-10周，25-28g。

32、使用試劑：牙齦卟啉單胞菌（atcc33277），無菌脫纖維羊血（kj-db-0010s，科晶生物），trypticase?soy?agar?(cm0131,?oxoid,?uk)，anti-mertk?(ab300136,?abcam),?一步法tunel細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（c1089,?碧云天）。

33、牙齦卟啉單胞菌提取物制備方法：牙齦卟啉單胞菌培養(yǎng)于37℃厭氧條件下，培養(yǎng)基為trypticase?soy?agar添加10%脫纖維羊血。將109?cfu/ml的細(xì)菌懸浮液離心后棄培養(yǎng)液使用生理鹽水重懸，使用超聲細(xì)胞破碎儀（jyd-150,?之信儀器有限公司）在冰上進(jìn)行破碎（300w，開10s，關(guān)10s，90個循環(huán))，確保細(xì)菌完全裂解。用孔徑0.22?μm的過濾器（pr03683,millipore,?usa）對超聲提取液進(jìn)行滅菌。bca法測定總蛋白濃度，-80℃保存。

34、實施例

35、本實施例對牙齦卟啉單胞菌提取物在構(gòu)建胚胎腭裂模型中的效果進(jìn)行了驗證。實驗流程如下：

36、1.?選取8-10周齡的c57bl/6雄鼠和雌鼠，按照1：2的比例于當(dāng)天晚上9點進(jìn)行合籠，約10-12小時后，將雌鼠和雄鼠分籠，同時觀察雌鼠陰栓的生成情況，將觀察到陰栓的雌鼠記為懷孕的0.5天（即e0.5）并記錄體重；

37、2.?將孕鼠隨機(jī)分為兩組，實驗組給予含牙齦卟啉單胞菌提取物的生理鹽水（p.?g組，n?=?12），對照組給予單純生理鹽水（control組，n?=?12）。?在e2.5-e14.5，每隔1天將含4mg/kg提取物的生理鹽水或等量單純生理鹽水通過尾靜脈注射和口腔灌注兩種給藥方式（每種給藥方式各2mg/kg）給予兩組孕鼠。

38、3.?在e16.5以脫頸法處死孕鼠后，收集胎鼠腭部組織樣本，通過體式顯微鏡觀察腭部發(fā)育情況。

39、具體地，體式顯微鏡觀察為在體式顯微鏡下直觀觀察腭部e16.5的發(fā)育情況，觀察步驟如下：

40、在e16.5將孕鼠實施頸椎脫臼處死，收集胚胎，放入預(yù)冷pbs中。將所有胎鼠用顯微外科剪取下頭部，從口角處去掉下頜以及舌部，暴露腭部，置于體視顯微鏡下觀察。部分觀察照片見圖1。

41、圖1為空白對照組（control）、實驗組（p.?g）的部分體式顯微鏡觀察結(jié)果。圖中標(biāo)尺代表1mm；箭頭部分指示的是腭部組織。

42、從圖可知，在e16.5天，對照組小鼠腭部已經(jīng)完全融合，實驗組（p.?g）部分胎鼠發(fā)生明顯腭裂。

43、最終根據(jù)上述實驗，統(tǒng)計結(jié)果見表1。

44、表1

45、 分組 孕鼠數(shù) 發(fā)生腭裂數(shù)/總胚胎數(shù) control 6 0/38 p.?g 6 4/32

46、具體本實施例的結(jié)果為：實驗組（p.?g）組胎鼠有12.5%?的腭裂率，與對照組具有統(tǒng)計學(xué)差異。

47、實施例

48、根據(jù)實施例1的實驗研究結(jié)果，本實施例再次構(gòu)建了實驗組，以進(jìn)一步驗證牙齦卟啉單胞菌提取物構(gòu)建胚胎腭裂模型的效果。

49、具體實驗流程與實施例1相同，區(qū)別僅在于：

50、步驟3中，在e16.5以脫頸法處死孕鼠后，收集胎鼠腭部組織樣本，e16.5樣本進(jìn)行he染色和masson染色。

51、he染色為以石蠟包埋切片后，通過he染色在顯微鏡下觀察e16.5腭部的發(fā)育情況，具體步驟如下：

52、(1)組織切片在烤箱上進(jìn)行烘烤，65℃，3h;

53、(2)二甲苯進(jìn)行兩次脫蠟，每次10min;

54、(3)梯度酒精水化：100%酒精?進(jìn)行兩次，每次各2min；95%酒精?進(jìn)行兩次，每次各2min；80%酒精-2min、70%酒精-2min、50%酒精-2min；

55、(4)?pbs沖洗3次，5min/次。輕柔地將切片擦凈后放入蘇木素染缸里進(jìn)行染色，2-3min;

56、(5)?pbs沖洗3次，5min/次。輕柔地將和切片擦凈后放入伊紅染缸里進(jìn)行染色，30s-1min;

57、(6)?pbs沖洗3次，5min/次。梯度酒精脫水；70%-酒精-2min，80%酒精-2min，95%酒精-2min，100%酒精進(jìn)行兩次，每次各2min;

58、(7)?二甲苯進(jìn)行兩次，每次分別透明5min;

59、(8)?透明完成后進(jìn)行封片。用吸管將中性樹膠滴至組織標(biāo)本處，去除多余樹膠后蓋蓋玻片，注意不要產(chǎn)生氣泡。

60、he染色完成后將組織切片在光學(xué)顯下觀察。部分觀察結(jié)果見圖2。

61、圖2為對照組（control）和實驗組（p.?g）的部分he染色觀察結(jié)果。圖中標(biāo)尺代表200μm，圖中“ps”代表胎鼠的腭突，圖中“t”代表胎鼠的舌部。從圖可知，在e16.5，對照組小鼠腭部已經(jīng)完全融合，實驗組（p.?g）部分胎鼠發(fā)生明顯腭裂。

62、masson染色為以石蠟包埋切片后，通過masson染色在顯微鏡下觀察e16.5腭部成骨發(fā)育情況，具體步驟如下：

63、(1)組織切片在烤箱上進(jìn)行烘烤，65℃，3h;

64、(2)二甲苯進(jìn)行兩次脫蠟，每次10min;

65、(3)梯度酒精水化：100%酒精?進(jìn)行兩次，每次各2min；95%酒精?進(jìn)行兩次，每次各2min；80%酒精-2min、70%酒精-2min、50%酒精-2min；

66、(4)?pbs沖洗3次，5min/次。輕柔地將切片擦凈后放入masson復(fù)合染液染缸里進(jìn)行染色，5-10min;

67、(5)?蒸餾水稍沖洗。1%磷酸鎢處理約5min;

68、(6)?不用水洗。輕柔地將切片放入苯胺藍(lán)液中復(fù)染5mim;

69、(7)?1%冰醋酸水處理1min;

70、(8)?pbs沖洗3次，5min/次。梯度酒精脫水；70%-酒精-2min，80%酒精-2min，95%酒精-2min，100%酒精進(jìn)行兩次，每次各2min;

71、(9)?二甲苯進(jìn)行兩次，每次分別透明5min;

72、(10)?透明完成后進(jìn)行封片。用吸管將中性樹膠滴至組織標(biāo)本處，去除多余樹膠后蓋蓋玻片，注意不要產(chǎn)生氣泡。

73、masson染色完成后將組織切片在光學(xué)顯下觀察。部分觀察結(jié)果見圖3，4。

74、圖3為對照組（control）和實驗組（p.?g）的部分masson染色觀察結(jié)果。圖中標(biāo)尺代表200μm，圖中箭頭所指為藍(lán)染的骨膠原纖維。圖4為對腭部骨化面積的定量分析，并使用graphpad?prism?8軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，存在統(tǒng)計學(xué)差異。從圖可知，在e16.5，對照組小鼠腭部骨化中心已形成，腭部骨化面積較大，實驗組（p.?g）部分腭部骨化面積較小，成骨發(fā)育不良。

75、實施例

76、根據(jù)實施例1，2的實驗研究結(jié)果，本實施例再次構(gòu)建了實驗組，以進(jìn)一步驗證牙齦卟啉單胞菌提取物對胎鼠腭部融合階段巨噬細(xì)胞胞葬能力的影響情況。

77、具體實驗流程與實施例1，2相同，區(qū)別僅在于：

78、步驟3中，在e15（胎鼠腭部融合階段）以脫頸法處死孕鼠，收集胎鼠腭部組織樣本，進(jìn)行tunel+免疫熒光檢測巨噬細(xì)胞胞葬能力。

79、tunel+免疫熒光染色法具體步驟如下：

80、(1)?脫蠟：二甲苯中脫蠟10分鐘。換用新鮮的二甲苯，再脫蠟10分鐘。無水乙醇5分鐘，換新的無水乙醇3分鐘。95%乙醇3分鐘。85%乙醇3分鐘。75%乙醇3分鐘。50%乙醇3分鐘。pbs?沖洗3次，每次5分鐘；

81、(2)?抗原修復(fù)：浴鍋內(nèi)加蒸餾水，連修復(fù)液一起預(yù)熱至99°，加入切片，煮30min，靜置到室溫，pbs?沖洗3次，每次5分鐘；

82、(3)?按一步法tunel細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書操作：按片子數(shù)量和組織大小取tunel試劑盒內(nèi)適量試劑1?(tdt)?和試劑2（dutp）按2:29混合，加到圈內(nèi)覆蓋組織，切片平放于濕盒內(nèi)，37℃恒溫箱孵育11小時，濕盒內(nèi)加少量水保持濕度。pbs?沖洗3次，每次5分鐘；

83、(4)?封閉：山羊血清工作液封閉，37°或室溫30-60min；室溫避光孵育30分鐘；

84、(5)?滴加一抗（抗mertk抗體，1：100），濕盒內(nèi)4?℃過夜；

85、(6)?4°取出恢復(fù)到室溫（30分鐘），pbs?沖洗3次，每次5分鐘；

86、(7)?滴加二抗，羊抗兔alexa?fluor?488（1：300）熒光二抗避光室溫孵育；

87、(8)?使用含dapi的封片液對細(xì)胞核進(jìn)行染色并進(jìn)行封片處理。組織部位切勿殘留小氣泡，自然晾干，拍照。

88、在熒光顯微鏡下觀察。部分觀察結(jié)果見圖5，6。

89、從圖5可知tunel實驗顯示，對照組（control）和實驗組（p.?g）腭突融合期（e15）腭中嵴上皮縫處均有明顯的細(xì)胞凋亡信號。mertk在巨噬細(xì)胞行使胞葬功能中十分重要。然而，對照組（control）組中，凋亡細(xì)胞主要位于mertk陽性巨噬細(xì)胞區(qū)域，而在實驗組（p.?g）中，游離于mertk陽性巨噬細(xì)胞的凋亡細(xì)胞增加。

90、圖6是將圖5中游離凋亡細(xì)胞和與mertk巨噬細(xì)胞相關(guān)的凋亡上皮細(xì)胞進(jìn)行定量，并使用graphpad?prism?8軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，存在統(tǒng)計學(xué)差異。這說明，說明實驗組（p.g）胎鼠腭部巨噬細(xì)胞的胞葬能力減弱。

91、雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。