本發(fā)明專利屬于生物，具體涉及類器官構(gòu)建中組織保存液及制備方法、應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、在構(gòu)建原代貼壁細(xì)胞和類器官中，腫瘤組織離體后，需要存放于相應(yīng)的保存液中，后運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)原代貼壁細(xì)胞培養(yǎng)或腫瘤類器官培養(yǎng)。在運(yùn)輸過程中，組織保存液對(duì)離體后腫瘤組織或正常組織的保存能力是原代細(xì)胞或類器官能否構(gòu)建成功的關(guān)鍵步驟之一。現(xiàn)有的保存液存在以下問題：

2、1、保存液對(duì)組織中細(xì)胞的保存能力較弱，當(dāng)組織運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室后組織中大部分細(xì)胞死亡或凋亡；

3、2、保存時(shí)間較短，一般是24h~48h；超過這個(gè)時(shí)間點(diǎn)，細(xì)胞的死亡率隨時(shí)間的延伸呈直線下降。

4、因此，本文提出了一種類器官構(gòu)建中組織保存液及制備方法、應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決上述問題，本發(fā)明提供一種可提高運(yùn)輸過程中組織細(xì)胞活率的類器官構(gòu)建中組織保存液及制備方法、應(yīng)用。

2、為了達(dá)到上述技術(shù)效果，本發(fā)明提供了類器官構(gòu)建中組織保存液，包括advanceddmem?/f12培養(yǎng)基、青鏈霉素/兩性霉素b三抗母液、glutamax-1、hepes緩沖液、y-27632母液；

3、所述的青鏈霉素/兩性霉素b三抗母液的工作終濃度為0.5-1.5x；

4、所述的glutamax-1的工作終濃度為0.5-1.5x；

5、所述的hepes緩沖液的工作終濃度為4-6unit/ml；

6、所述的y-27632母液的工作終濃度為8-12um。

7、本發(fā)明還提供了類器官構(gòu)建中組織保存液的制備方法，所述方法具體包括以下步驟：

8、s1、在超凈臺(tái)上的離心管中，加入advanced?dmem?/f12培養(yǎng)基；

9、s2、之后依次加入青鏈霉素/兩性霉素b三抗母液、glutamax-1、hepes緩沖液、y-27632混勻，此即為組織保存液；

10、s3、混勻后，用一次性針式濾器過濾除菌，收集保存液于離心管中即可。

11、進(jìn)一步地，所述s3中收集于離心管中的保存液可放于4℃冰箱保存，2周內(nèi)用完，-20℃可保存6個(gè)月。

12、本發(fā)明還提供了組織保存液在類器官構(gòu)建中的應(yīng)用，包括使用本發(fā)明所述的組織保存液，所述應(yīng)用具體包括以下步驟：

13、s1、保存液的配置：在實(shí)驗(yàn)室超凈臺(tái)上，在離心管中配置組織消化液，再用一次性針式濾器過濾保存液，最后收集于離心管中；

14、s2、用冰盒或4℃低溫運(yùn)輸箱把組織保存液帶到手術(shù)室，手術(shù)室中取到組織樣本，放于保存液中；

15、進(jìn)一步地，所述s2中的組織樣本需先用剪刀剪成1cm3的組織塊，放3~5組織塊于保存液中，確保組織能夠完全浸泡在保存液中；

16、s3、將裝有組織和保存液的離心管插在冰盒上，或豎直放于低溫運(yùn)輸箱中，確保在運(yùn)輸過程中組織不會(huì)暴露于空氣中，同時(shí)運(yùn)輸溫度嚴(yán)格控制在4~8℃。

17、進(jìn)一步地，所述的s3中將組織運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室的運(yùn)輸時(shí)間需小于4天。

18、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果主要在于：

19、本發(fā)明針對(duì)運(yùn)輸腫瘤組織過程中對(duì)腫瘤組織保存液進(jìn)行優(yōu)化：通過在保存液中加入適當(dāng)濃度的glutamax-1，維持腫瘤組織在運(yùn)輸過程中細(xì)胞生命所必需的物質(zhì)；加入終濃度為10um的y-27632，抑制腫瘤組織在運(yùn)輸過程中細(xì)胞的死亡和凋亡；加入適當(dāng)濃度的hepes，維持保存液的穩(wěn)定性，避免運(yùn)輸過程中過酸過堿的環(huán)境出現(xiàn)對(duì)細(xì)胞造成損傷；加入抗生素，抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)；通過以上組合，72h后，用本發(fā)明保存液保存的組織消化出來的原代細(xì)胞存活率搞到85%以上，且污染率低。在這些試劑一定濃度的共同作用下，在運(yùn)輸過程中使組織中的細(xì)胞活率提高，細(xì)胞損傷降低，增加原代細(xì)胞貼壁培養(yǎng)和類器官構(gòu)建的成功率。

技術(shù)特征：

1.類器官構(gòu)建中組織保存液，其特征在于：包括advanced?dmem?/f12培養(yǎng)基、青鏈霉素/兩性霉素b三抗母液、glutamax-1、hepes緩沖液、y-27632母液；

2.類器官構(gòu)建中組織保存液的制備方法，其特征在于，所述方法具體包括以下步驟：

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的類器官構(gòu)建中組織保存液的制備方法，其特征在于：所述s3中收集于離心管中的保存液可放于4℃冰箱保存，2周內(nèi)用完，-20℃可保存6個(gè)月。

4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任意一項(xiàng)所述的組織保存液在類器官構(gòu)建中的應(yīng)用，包括使用本發(fā)明所述的組織保存液，其特征在于，所述應(yīng)用具體包括以下步驟：

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的組織保存液在類器官構(gòu)建中的應(yīng)用，其特征在于：所述s2中的組織樣本需先用剪刀剪成1cm3的組織塊，放3~5組織塊于保存液中，確保組織能夠完全浸泡在保存液中。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的組織保存液在類器官構(gòu)建中的應(yīng)用，其特征在于：所述的s3中將組織運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室的運(yùn)輸時(shí)間需小于4天。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了類器官構(gòu)建中組織保存液及制備方法、應(yīng)用，組織保存液的成分包括Advanced?DMEM/F12培養(yǎng)基、青鏈霉素/兩性霉素B三抗母液、Glutamax?1、HEPES緩沖液、Y?27632母液；組織保存液制備方法包括：在超凈臺(tái)上的離心管中，加入Advanced?DMEM/F12培養(yǎng)基；之后依次加入青鏈霉素/兩性霉素B三抗母液、Glutamax?1、HEPES緩沖液、Y?27632混勻，此即為組織保存液；混勻后，用一次性針式濾器過濾除菌，收集保存液于離心管中即可；組織保存液在類器官構(gòu)建中的應(yīng)用。本發(fā)明得到的組織保存液在運(yùn)輸過程中使組織中的細(xì)胞活率提高，細(xì)胞損傷降低，增加原代細(xì)胞貼壁培養(yǎng)和類器官構(gòu)建的成功率。

技術(shù)研發(fā)人員：戴永琴,黃雁林,李章倩,趙樹凡,張濟(jì)斌,姜江,陳曉芳,高秀娟
受保護(hù)的技術(shù)使用者：云南醫(yī)大精準(zhǔn)生命科技有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/3/20