本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)，具體涉及一種針對(duì)白及(bletilla?striata)種苗無菌育苗的專用培養(yǎng)基配方及其制備方法，尤其適用于提高種子或原球莖的萌發(fā)率、抑制褐化并優(yōu)化成苗率。
背景技術(shù)：
1、白及是一種重要的中藥植物，其根莖富含多糖類化合物，具有顯著的藥用價(jià)值。然而，由于其種子無胚乳、天然萌發(fā)率低，傳統(tǒng)的種子繁殖方法難以滿足規(guī)模化育苗需求。因此，利用無菌組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行白及的快速繁殖成為一種重要的育苗手段。
2、現(xiàn)有的白及組織培養(yǎng)方法主要基于ms(murashige&skoog)培養(yǎng)基，但在實(shí)際應(yīng)用中，種苗成活率較低，原因包括培養(yǎng)基配方不合理、褐化現(xiàn)象嚴(yán)重、根系生長不良等。因此，優(yōu)化培養(yǎng)基配方，提高白及種苗的成活率，對(duì)提高白及的生產(chǎn)效率具有重要意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、(一)解決的技術(shù)問題
2、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種提高白及種苗成活率的無菌育苗培養(yǎng)基及其制備方法，該培養(yǎng)基通過調(diào)整基礎(chǔ)營養(yǎng)成分、添加抗褐化劑、優(yōu)化生長調(diào)節(jié)劑比例以及補(bǔ)充有機(jī)添加物，從而提高白及種苗的成活率、生長質(zhì)量和抗逆性。
3、(二)技術(shù)方案
4、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：一種提高白及種苗成活率的無菌育苗培養(yǎng)基，包括以下成分及其質(zhì)量體積配比：
5、基礎(chǔ)培養(yǎng)基：ms培養(yǎng)基母液，濃度為0.8-1.2×原液濃度，所述ms母液包含硝酸銨(nh4no3)1650mg/l、硝酸鉀(kno3)1900mg/l、磷酸二氫鉀(kh2po4)170mg/l、硫酸鎂(mgso4·7h2o)370mg/l、氯化鈣(cacl2·2h2o)440mg/l、鐵鹽(fe-edta)27.8mg/l，且不添加肌醇；
6、植物生長調(diào)節(jié)劑：萘乙酸(naa)0.1-0.5mg/l、6-芐氨基嘌呤(6-ba)0.2-1.0mg/l，其中naa與6-ba的摩爾濃度比為1:2至1:5；
7、有機(jī)添加物：椰子水50-100ml/l(取自成熟椰子，經(jīng)5000rpm離心10分鐘去除懸浮物后過濾)、土豆汁20-50ml/l(由去皮馬鈴薯切片后煮沸30分鐘，壓榨汁液經(jīng)雙層紗布過濾)；
8、抗褐化劑：活性炭0.5-2.0g/l與維生素c?0.05-0.2g/l的復(fù)合物；
9、碳源：蔗糖20-40g/l(純度≥99％)；
10、固化劑：瓊脂6-10g/l(凝膠強(qiáng)度≥900g/cm2)；
11、ph調(diào)節(jié)劑：采用0.1mol/l?naoh或hcl將培養(yǎng)基ph值調(diào)整為5.8-6.2；
12、輔助成分：維生素b1?0.1mg/l、煙酸0.5mg/l。
13、所述ms培養(yǎng)基母液濃度為1.0×原液濃度，且調(diào)整硫酸鎂(mgso4·7h2o)至400mg/l、氯化鈣(cacl2·2h2o)至460mg/l，以增強(qiáng)離子平衡。
14、其特征在于，所述植物生長調(diào)節(jié)劑的配比為naa?0.3mg/l與6-ba?0.5mg/l，且兩者在25℃下通過40khz超聲處理10分鐘溶解于無菌水中，形成均質(zhì)溶液后加入培養(yǎng)基。
15、所述椰子水需經(jīng)高壓滅菌(121℃,15分鐘)后冷卻至25℃使用，土豆汁中添加0.05％(w/v)木瓜蛋白酶并于45℃酶解1小時(shí)，以釋放可溶性多糖。
16、所述抗褐化劑為活性炭1.0g/l、維生素c?0.1g/l與半胱氨酸鹽酸鹽0.05g/l的三元復(fù)合物，且三者需預(yù)先混合研磨至粒徑≤50μm。
17、優(yōu)選的，所述無菌育苗培養(yǎng)基的制備方法，包括以下步驟：
18、(1)按配比稱取ms母液、蔗糖及瓊脂，加入去離子水定容至總體積的70％，加熱至80℃攪拌至瓊脂完全溶解；
19、(2)依次加入植物生長調(diào)節(jié)劑、有機(jī)添加物及抗褐化劑，在磁力攪拌器(轉(zhuǎn)速500rpm)下混合20分鐘；
20、(3)采用ph計(jì)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，用0.1mol/l?naoh或hcl調(diào)節(jié)ph至5.8-6.2，補(bǔ)加去離子水至目標(biāo)體積；
21、(4)分裝至透明玻璃培養(yǎng)瓶(容量100ml，裝液量40ml/瓶)，封口后于121℃高壓滅菌20分鐘，冷卻至45℃時(shí)搖動(dòng)瓶體使成分均勻分布；
22、(5)滅菌后的培養(yǎng)基在無菌操作臺(tái)中靜置24小時(shí)，待溫度降至25℃后使用。
23、所述步驟(2)中有機(jī)添加物需依次經(jīng)0.45μm和0.22μm濾膜兩級(jí)過濾除菌，且在培養(yǎng)基冷卻至50℃時(shí)于超凈工作臺(tái)內(nèi)無菌注入。
24、所述步驟(5)中靜置環(huán)境為避光條件，溫度控制在20-25℃，靜置后培養(yǎng)基表面形成均勻凝膠層，厚度為2-3mm。
25、優(yōu)選的，該無菌育苗培養(yǎng)基用于白及種子或原球莖的無菌播種，播種前需將種子或原球莖用0.1％?hgcl2溶液浸泡8-10分鐘，無菌水沖洗3-5次；培養(yǎng)條件為：光照強(qiáng)度1000-2000lux，每日光照12-16小時(shí)，培養(yǎng)溫度22±2℃，濕度60-80％，培養(yǎng)周期為30-40天。
26、(三)有益的技術(shù)效果
27、(1)提高成活率：本發(fā)明的培養(yǎng)基優(yōu)化了營養(yǎng)成分和植物生長調(diào)節(jié)劑比例，能夠顯著提高白及種苗的成活率。
28、(2)抑制褐化：通過活性炭、維生素c等抗褐化劑的組合，顯著減少培養(yǎng)過程中由于氧化造成的組織褐變，提高組織培養(yǎng)的成功率。
29、(3)促進(jìn)根系發(fā)育：naa與6-ba的優(yōu)化配比能夠有效促進(jìn)根系生長，提高種苗的移栽成活率。
30、(4)增強(qiáng)營養(yǎng)供應(yīng)：添加椰子水和土豆汁提供天然生長素、多糖和維生素，增強(qiáng)種苗的抗逆性和生長勢(shì)。
31、(5)優(yōu)化制備方法：通過精確的ph調(diào)節(jié)、滅菌處理和無菌操作，保證培養(yǎng)基的穩(wěn)定性和無污染，提高實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性和可操作性。
1.一種提高白及種苗成活率的無菌育苗培養(yǎng)基，其特征在于，包括以下成分及其質(zhì)量體積配比：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高白及種苗成活率的無菌育苗培養(yǎng)基，其特征在于，所述ms培養(yǎng)基母液濃度為1.0×原液濃度，且調(diào)整硫酸鎂(mgso4·7h2o)至400mg/l、氯化鈣(cacl2·2h2o)至460mg/l，以增強(qiáng)離子平衡。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高白及種苗成活率的無菌育苗培養(yǎng)基，其特征在于，所述植物生長調(diào)節(jié)劑的配比為naa?0.3mg/l與6-ba?0.5mg/l，且兩者在25℃下通過40khz超聲處理10分鐘溶解于無菌水中，形成均質(zhì)溶液后加入培養(yǎng)基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高白及種苗成活率的無菌育苗培養(yǎng)基，其特征在于，所述椰子水需經(jīng)高壓滅菌(121℃,15分鐘)后冷卻至25℃使用，土豆汁中添加0.05％(w/v)木瓜蛋白酶并于45℃酶解1小時(shí)，以釋放可溶性多糖。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高白及種苗成活率的無菌育苗培養(yǎng)基，其特征在于，所述抗褐化劑為活性炭1.0g/l、維生素c?0.1g/l與半胱氨酸鹽酸鹽0.05g/l的三元復(fù)合物，且三者需預(yù)先混合研磨至粒徑≤50μm。
6.一種如權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述無菌育苗培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的無菌育苗培養(yǎng)基及其制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中有機(jī)添加物需依次經(jīng)0.45μm和0.22μm濾膜兩級(jí)過濾除菌，且在培養(yǎng)基冷卻至50℃時(shí)于超凈工作臺(tái)內(nèi)無菌注入。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的無菌育苗培養(yǎng)基及其制備方法，其特征在于，所述步驟(5)中靜置環(huán)境為避光條件，溫度控制在20-25℃，靜置后培養(yǎng)基表面形成均勻凝膠層，厚度為2-3mm。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高白及種苗成活率的無菌育苗培養(yǎng)基，其特征在于，該無菌育苗培養(yǎng)基用于白及種子或原球莖的無菌播種，播種前需將種子或原球莖用0.1％hgcl2溶液浸泡8-10分鐘，無菌水沖洗3-5次；培養(yǎng)條件為：光照強(qiáng)度1000-2000lux，每日光照12-16小時(shí)，培養(yǎng)溫度22±2℃，濕度60-80％，培養(yǎng)周期為30-40天。