一種菘藍-甘藍遠緣雜交四倍體育種方法
【專利摘要】本發明公開了一種菘藍?甘藍遠緣雜交四倍體育種方法，包括以下步驟：對種子低溫萌芽；將幼芽在微重力條件光照培養，長成幼苗，將兩種幼苗移栽到大田，直至開花；以菘藍為母本，甘藍為父本，進行遠緣雜交，得到菘藍?甘藍雜交體植株，收獲種子；將種子萌發生芽，使用秋水仙堿和α射線輻照協同誘導染色體加倍；篩選出四倍體幼芽，繼續生長，將得到的四倍體植株移至大田中栽培，自花授粉，得到菘藍?甘藍遠緣雜交四倍體種子，連續播種5代～8代，得到性狀穩定的菘藍?甘藍遠緣雜交四倍體種子，即得。本發明通過以菘藍為母本甘藍為父本進行遠緣雜交方法育種，形成各種性狀優良的后代雜種，使物種性狀更加豐富多樣。
【專利說明】
一種菘藍-甘藍遠緣雜交四倍體育種方法
技術領域
[0001] 本發明涉及菘藍的育種領域，具體涉及一種菘藍-甘藍遠緣雜交四倍體育種方法。
【背景技術】
[0002] 菘藍是一種十字花科菘藍屬二年生草本植物，物種起源于中國，具有很強的耐寒 耐旱適應能力，廣泛生長分布于我國各地。菘藍根部曬干處理后可以作為中藥板藍根，其葉 子經處理后則為中藥大青葉。這兩味藥材具有清熱解毒、涼血止痛的功用。菘藍種子可以作 為榨油，作為工業油的原料來源，而且菘藍葉子部位還可以提取靛青染料，供人們使用。可 見菘藍具有優秀的使用價值和經濟價值。
[0003] 甘藍是一種十字花科蕓薹屬二年生草本植物，物種起源于地中海沿線，具有較好 的耐寒性能，適應力強，早在4000年前人們就已經開始種植。在我國廣泛種植于北方及華南 等地，是一種重要蔬菜作物。甘藍還具有一定的養胃健腎的藥理功用，能夠保護并修復胃黏 膜，是鉀元素的良好來源。此外，甘藍還表現出一定的觀賞價值。
[0004] 遠緣雜交指的是不同種屬的物種之間進行的雜交，可以把不同種屬間物種性狀進 行結合重建，產生新的變異性狀，從而構造出新的物種。一般而言，遠緣雜交育種易出現后 代早夭及不育的問題，而遠緣雜交的兩個物種之間的親緣關系越近，雜交成功率越高，雜交 后代生存繁育能力越強。并且通過染色體加倍技術，產生的多倍體使不能正常減數分裂的 異源染色體能恢復正常繁育。
[0005] 中國專利CN200810301666.5公開了一種遠源百合雜交植株的培育方法，將子房和 花藥進行離體培養，然后采用以將子房切斷的非常規授粉方式進行離體授粉，此后進行胚 培養即可得雜交植株。但是該專利的雜交種存在父本母本雜交過程中染色體不匹配，無法 成對的現象，致使雜交得到的種子高度不育，不能持續穩定獲得同一性狀的種子，社會價值 和經濟價值低。
[0006] 中國專利CN201410175221.2公開了一種通過離體挽救培養獲得草莓遠緣雜種的 方法及培養基，該發明以栽培草莓品種久香、甜查理、豐香為母本或父本，野生黃毛草莓為 父本或母本進行雜交，正交與反交同時進行，通過對雜交授粉后的未成熟胚進行離體培養， 在胚敗育前將其取出進行挽救培養，獲得遠緣雜交后代。但是該專利所需親本數量極大，需 要耗費大量人力物力，且僅進行胚挽救手段難以克服遠緣雜交成功率低的問題，同時存在 雜交后代高度不育的問題。
[0007]通過分析可以看出，蕓薹屬植物與菘藍屬菘藍之間可能形成性狀較好的遠緣雜交 品種，而關于蕓薹屬甘藍與菘藍屬菘藍雜交育種則報道很少，因此本發明旨在通過遠緣雜 交、四倍體育種技術提供菘藍與甘藍的雜交育種方法。

【發明內容】

[0008] 本發明針對上述問題，提供一種菘藍-甘藍遠緣雜交四倍體育種方法。
[0009] 本發明解決上述問題所采用的技術方案是：
[0010] -種菘藍-甘藍遠緣雜交四倍體育種方法，包括以下步驟：
[0011] 步驟一，低溫萌芽:選擇種粒飽滿的菘藍種子和甘藍種子，在福爾馬林溶液中浸泡 30min~50min，揉搓去除種子表皮，然后將處理后的種子用濕布包裹，在3°C~8°C的溫度條 件下進行催芽處理48h~72h，直至長出3mm~8mm的務藍幼芽和甘藍幼芽；
[0012] 步驟二，光照培養:將菘藍幼芽和甘藍幼芽分別移種到液體培養基中，使培養基在 微重力條件下勾速旋轉，使用氣燈模擬光照培養2天~3天，直至長成株長為10cm~15cm的 菘藍幼苗和甘藍幼苗，分別將兩種幼苗移栽到大田中，給予正常的光照、水分及肥料條件， 進行必要的田間作業維護，直至兩種植物開花；
[0013] 步驟三，遠緣雜交：以步驟二中得到的菘藍為母本，甘藍為父本，使用細毛刷小心 收集甘藍雄花花粉，加水制成花粉懸浮液，使用小軟毛刷將花粉懸浮液涂抹在菘藍雌花花 柱柱頭上，之后再在菘藍雌花花柱柱頭上涂抹丙酮-乙醇溶液，促進異花授粉過程，授粉完 成后進行套袋處理，扎緊袋口，防止外源花粉干擾，然后繼續培育，得到菘藍-甘藍雜交體植 株，收獲種子，備用；
[0014] 步驟四，四倍體育種:將步驟三得到的種子進行萌發培養，生出幼芽，使用濃度為 2%~20%的秋水仙堿每4h均勻涂抹在幼芽上，持續100h~160h;之后使用α射線輻照20h~ 40h，將處理過的幼芽使用流式細胞儀進行倍性分析，篩選出四倍體幼芽，將篩選出的四倍 體幼芽移栽至B5培養基中繼續生長，直至長成株長為5cm~8cm的四倍體植株；
[0015] 步驟五，制種:將步驟四得到的四倍體植株移至大田中栽培，自花授粉，植株成熟 后收集得到菘藍-甘藍遠緣雜交四倍體種子，連續播種5代~8代，得到性狀穩定的菘藍-甘 藍遠緣雜交四倍體種子，即得。
[0016] 進一步地，步驟一中，福爾馬林溶液的濃度為2%~10%。
[0017] 進一步地，步驟二中，液體培養基的成分及其重量份為：硝酸銨100份~300份，氯 化鉀150份~250份，碳酸氫銨80份~150份，磷酸二氫鉀150份~280份，碘化鉀30份~80份， 碘化鈉30份~60份，氯化鈣20份~50份，偏硼酸鎂50份~100份，硫酸亞鐵30份~80份，氯化 亞鐵30份~80份，硫酸錳20份~50份，葡萄糖酸鋅20份~60份，葡萄糖酸鈣20份~50份，酒 石酸鉀鈉20份~40份，天冬氨酸20份~50份，甘氨酸20份~60份，苯丙氨酸20份~40份，煙 酰胺20份~60份，L-抗壞血酸20份~50份，半乳糖3000份~5000份，葡萄糖3000份~5000 份，瓊脂2000份~4000份，水5000份~10000份。
[0018]進一步地，步驟二中，微重力的場強為〇.〇lg~〇.15g。
[0019] 進一步地，步驟二中，勾速旋轉的轉速為35r/min~70r/min。
[0020] 進一步地，步驟三中，丙酮-乙醇溶液中丙酮與乙醇的體積比為1:20~30。
[0021] 進一步地，步驟四中，α射線源的劑量率為3500倫琴/小時~9000倫琴/小時。
[0022]本發明的優點是：
[0023] 1.通過以菘藍為母本甘藍為父本進行遠緣雜交方法育種，通過引入外源性基因的 方法使原有基因組型進行重新構建，容易形成各種性狀優良的后代雜種，使物種性狀更加 豐富多樣；
[0024] 2.使用四倍體育種方法使雜交種染色體加倍的技術改良和恢復了后代雜種植株 的生存能力及繁育水平，使突變的優秀性狀得以繼續遺傳，并且通過加倍形成的多倍染色 體，其植株具有枝葉巨大、根莖茁壯等良好特征，使各種有效藥用成分含量得到了提高；
[0025] 3.使用甘藍作為雜交父本，具有原料來源廣泛，廉價易得等成本優勢，且甘藍種植 范圍大、物種性狀多，容易給后代雜交品種帶來豐富的變化潛力。
【具體實施方式】
[0026] 實施例1
[0027] -種菘藍-甘藍遠緣雜交四倍體育種方法 [0028] 包括以下步驟：
[0029]步驟一，低溫萌芽:選擇種粒飽滿的菘藍種子和甘藍種子，在濃度為2%的福爾馬 林溶液中浸泡30min，揉搓去除種子表皮，然后將處理后的種子用濕布包裹，在:TC的溫度條 件下進行催芽處理48h，直至長出3mm的菘藍幼芽和甘藍幼芽。
[0030]步驟二，光照培養:將菘藍幼芽和甘藍幼芽分別移種到液體培養基中，使培養基在 微重力場強為0. 〇lg，轉速為35r/min的條件下勾速旋轉，使用氣燈模擬光照培養2天，直至 長成株長為l〇cm的菘藍幼苗和甘藍幼苗，分別將兩種幼苗移栽到大田中，給予正常的光照、 水分及肥料條件，進行必要的田間作業維護，直至兩種植物開花。其中液體培養基的成分及 其重量份為:硝酸銨100份，氯化鉀150份，碳酸氫銨80份，磷酸二氫鉀150份，碘化鉀30份，碘 化鈉30份，氯化鈣20份，偏硼酸鎂50份，硫酸亞鐵30份，氯化亞鐵30份，硫酸錳20份，葡萄糖 酸鋅20份，葡萄糖酸鈣20份，酒石酸鉀鈉20份，天冬氨酸20份，甘氨酸20份，苯丙氨酸20份， 煙酰胺20份，L-抗壞血酸20份，半乳糖3000份，葡萄糖3000份，瓊脂2000份，水5000份。
[0031]步驟三，遠緣雜交：以步驟二中得到的菘藍為母本，甘藍為父本，使用細毛刷小心 收集甘藍雄花花粉，加水制成花粉懸浮液，使用小軟毛刷將花粉懸浮液涂抹在菘藍雌花花 柱柱頭上，之后再在菘藍雌花花柱柱頭上涂抹丙酮-乙醇溶液，促進異花授粉過程，授粉完 成后進行套袋處理，扎緊袋口，防止外源花粉干擾，然后繼續培育，得到菘藍-甘藍雜交體植 株，收獲種子，備用。其中丙酮-乙醇溶液中丙酮與乙醇的體積比為1:20。
[0032] 步驟四，四倍體育種:將步驟三得到的種子進行萌發培養，生出幼芽，使用濃度為 2%的秋水仙堿每4h均勻涂抹在幼芽上，持續100h;之后使用劑量率為3500倫琴/小時的α射 線輻照20h，將處理過的幼芽使用流式細胞儀進行倍性分析，篩選出四倍體幼芽，將篩選出 的四倍體幼芽移栽至B5培養基中繼續生長，直至長成株長為5cm的四倍體植株。
[0033] 步驟五，制種:將步驟四得到的四倍體植株移至大田中栽培，自花授粉，植株成熟 后收集得到菘藍-甘藍遠緣雜交四倍體種子，連續播種5代，得到性狀穩定的菘藍-甘藍遠緣 雜交四倍體種子，即得。
[0034] 實施例2
[0035] -種菘藍-甘藍遠緣雜交四倍體育種方法 [0036] 包括以下步驟：
[0037] 步驟一，低溫萌芽:選擇種粒飽滿的菘藍種子和甘藍種子，在濃度為10%的福爾馬 林溶液中浸泡50min，揉搓去除種子表皮，然后將處理后的種子用濕布包裹，在8°C的溫度條 件下進行催芽處理72h，直至長出8_的菘藍幼芽和甘藍幼芽。
[0038] 步驟二，光照培養:將菘藍幼芽和甘藍幼芽分別移種到液體培養基中，使培養基在 微重力場強為0.15g，轉速為70r/min的條件下勾速旋轉，使用氣燈模擬光照培養3天，直至 長成株長為15cm的菘藍幼苗和甘藍幼苗，分別將兩種幼苗移栽到大田中，給予正常的光照、 水分及肥料條件，進行必要的田間作業維護，直至兩種植物開花。其中液體培養基的成分及 其重量份為:硝酸銨300份，氯化鉀250份，碳酸氫銨150份，磷酸二氫鉀280份，碘化鉀80份， 碘化鈉60份，氯化鈣50份，偏硼酸鎂100份，硫酸亞鐵80份，氯化亞鐵80份，硫酸錳50份，葡萄 糖酸鋅60份，葡萄糖酸鈣50份，酒石酸鉀鈉40份，天冬氨酸50份，甘氨酸60份，苯丙氨酸40 份，煙酰胺60份，L-抗壞血酸50份，半乳糖5000份，葡萄糖5000份，瓊脂4000份，水10000份。 [0039]步驟三，遠緣雜交：以步驟二中得到的菘藍為母本，甘藍為父本，使用細毛刷小心 收集甘藍雄花花粉，加水制成花粉懸浮液，使用小軟毛刷將花粉懸浮液涂抹在菘藍雌花花 柱柱頭上，之后再在菘藍雌花花柱柱頭上涂抹丙酮-乙醇溶液，促進異花授粉過程，授粉完 成后進行套袋處理，扎緊袋口，防止外源花粉干擾，然后繼續培育，得到菘藍-甘藍雜交體植 株，收獲種子，備用。其中丙酮-乙醇溶液中丙酮與乙醇的體積比為1:30。
[0040]步驟四，四倍體育種:將步驟三得到的種子進行萌發培養，生出幼芽，使用濃度為 20%的秋水仙堿每4h均勻涂抹在幼芽上，持續160h;之后使用劑量率為9000倫琴/小時的α 射線輻照40h，將處理過的幼芽使用流式細胞儀進行倍性分析，篩選出四倍體幼芽，將篩選 出的四倍體幼芽移栽至B5培養基中繼續生長，直至長成株長為8cm的四倍體植株。
[0041]步驟五，制種:將步驟四得到的四倍體植株移至大田中栽培，自花授粉，植株成熟 后收集得到菘藍-甘藍遠緣雜交四倍體種子，連續播種8代，得到性狀穩定的菘藍-甘藍遠緣 雜交四倍體種子，即得。
[0042] 實施例3
[0043] -種菘藍-甘藍遠緣雜交四倍體育種方法
[0044] 包括以下步驟：
[0045] 步驟一，低溫萌芽:選擇種粒飽滿的菘藍種子和甘藍種子，在濃度為6%的福爾馬 林溶液中浸泡40min，揉搓去除種子表皮，然后將處理后的種子用濕布包裹，在6°C的溫度條 件下進行催芽處理60h，直至長出6_的菘藍幼芽和甘藍幼芽。
[0046] 步驟二，光照培養:將菘藍幼芽和甘藍幼芽分別移種到液體培養基中，使培養基在 微重力場強為0.08g，轉速為57r/min的條件下勾速旋轉，使用氣燈模擬光照培養3天，直至 長成株長為13cm的菘藍幼苗和甘藍幼苗，分別將兩種幼苗移栽到大田中，給予正常的光照、 水分及肥料條件，進行必要的田間作業維護，直至兩種植物開花。其中液體培養基的成分及 其重量份為:硝酸銨200份，氯化鉀200份，碳酸氫銨115份，磷酸二氫鉀215份，碘化鉀55份， 碘化鈉45份，氯化鈣35份，偏硼酸鎂75份，硫酸亞鐵55份，氯化亞鐵55份，硫酸錳35份，葡萄 糖酸鋅40份，葡萄糖酸鈣35份，酒石酸鉀鈉30份，天冬氨酸35份，甘氨酸40份，苯丙氨酸30 份，煙酰胺40份，L-抗壞血酸35份，半乳糖4000份，葡萄糖4000份，瓊脂3000份，水7500份。 [0047]步驟三，遠緣雜交：以步驟二中得到的菘藍為母本，甘藍為父本，使用細毛刷小心 收集甘藍雄花花粉，加水制成花粉懸浮液，使用小軟毛刷將花粉懸浮液涂抹在菘藍雌花花 柱柱頭上，之后再在菘藍雌花花柱柱頭上涂抹丙酮-乙醇溶液，促進異花授粉過程，授粉完 成后進行套袋處理，扎緊袋口，防止外源花粉干擾，然后繼續培育，得到菘藍-甘藍雜交體植 株，收獲種子，備用。其中丙酮-乙醇溶液中丙酮與乙醇的體積比為1:25。
[0048]步驟四，四倍體育種:將步驟三得到的種子進行萌發培養，生出幼芽，使用濃度為 11 %的秋水仙堿每4h均勻涂抹在幼芽上，持續130h;之后使用劑量率為6300倫琴/小時的α 射線輻照30h，將處理過的幼芽使用流式細胞儀進行倍性分析，篩選出四倍體幼芽，將篩選 出的四倍體幼芽移栽至B5培養基中繼續生長，直至長成株長為7cm的四倍體植株。
[0049] 步驟五，制種:將步驟四得到的四倍體植株移至大田中栽培，自花授粉，植株成熟 后收集得到菘藍-甘藍遠緣雜交四倍體種子，連續播種7代，得到性狀穩定的菘藍-甘藍遠緣 雜交四倍體種子，即得。
[0050] 實驗例
[0051] 對分別根據實施例1~3的育種方法制備的雜交型菘藍，標號為Y1、Y2、Y3，作為實 驗組;對普通生長的菘藍，標記為Υ0,作為對照組。通過實驗對實驗組和對照組的育種效果 進行測試，測試結果見表1所示。
[0052]表1育種效果測試結果 [0053]
[0054] 注：7"表示未雜交。
[0055]結論：由對比結果可知，實施例1~3所得的遠緣雜交四倍體菘藍的育種成功率較 高，并且通過菘藍-甘藍遠緣雜交四倍體育種方法獲得的雜種植株，大幅提升了菘藍的藥效 成分，具有很高的藥用價值和經濟價值。
[0056]以上僅為本發明的優選實施例而已，并不用于限制本發明，對于本領域的技術人 員來說，本發明可以有各種更改和變化。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、 等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種菘藍-甘藍遠緣雜交四倍體育種方法，其特征在于，包括以下步驟： 步驟一，低溫萌芽：選擇種粒飽滿的菘藍種子和甘藍種子，在福爾馬林溶液中浸泡 30min~50min，揉搓去除種子表皮，然后將處理后的種子用濕布包裹，在3°C~8°C的溫度條 件下進行催芽處理48h~72h，直至長出3mm~8mm的務藍幼芽和甘藍幼芽； 步驟二，光照培養:將菘藍幼芽和甘藍幼芽分別移種到液體培養基中，使培養基在微重 力條件下勾速旋轉，使用氣燈模擬光照培養2天~3天，直至長成株長為IOcm~15cm的務藍 幼苗和甘藍幼苗，分別將兩種幼苗移栽到大田中，給予正常的光照、水分及肥料條件，進行 必要的田間作業維護，直至兩種植物開花； 步驟三，遠緣雜交：以步驟二中得到的菘藍為母本，甘藍為父本，使用細毛刷小心收集 甘藍雄花花粉，加水制成花粉懸浮液，使用小軟毛刷將花粉懸浮液涂抹在菘藍雌花花柱柱 頭上，之后再在菘藍雌花花柱柱頭上涂抹丙酮-乙醇溶液，促進異花授粉過程，授粉完成后 進行套袋處理，扎緊袋口，防止外源花粉干擾，然后繼續培育，得到菘藍-甘藍雜交體植株， 收獲種子，備用； 步驟四，四倍體育種:將步驟三得到的種子進行萌發培養，生出幼芽，使用濃度為2%~ 20%的秋水仙堿每4h均勻涂抹在幼芽上，持續IOOh~160h;之后使用α射線輻照20h~40h， 將處理過的幼芽使用流式細胞儀進行倍性分析，篩選出四倍體幼芽，將篩選出的四倍體幼 芽移栽至B5培養基中繼續生長，直至長成株長為5cm~8cm的四倍體植株； 步驟五，制種:將步驟四得到的四倍體植株移至大田中栽培，自花授粉，植株成熟后收 集得到菘藍-甘藍遠緣雜交四倍體種子，連續播種5代~8代，得到性狀穩定的菘藍-甘藍遠 緣雜交四倍體種子，即得。2. 根據權利要求1所述的育種方法，其特征在于，步驟一中，所述福爾馬林溶液的濃度 為2%~10%〇3. 根據權利要求1所述的育種方法，其特征在于，步驟二中，所述液體培養基的成分及 其重量份為:硝酸銨100份~300份，氯化鉀150份~250份，碳酸氫銨80份~150份，磷酸二氫 鉀150份~280份，碘化鉀30份~80份，碘化鈉30份~60份，氯化鈣20份~50份，偏硼酸鎂50 份~100份，硫酸亞鐵30份~80份，氯化亞鐵30份~80份，硫酸錳20份~50份，葡萄糖酸鋅20 份~60份，葡萄糖酸鈣20份~50份，酒石酸鉀鈉20份~40份，天冬氨酸20份~50份，甘氨酸 20份~60份，苯丙氨酸20份~40份，煙酰胺20份~60份，L-抗壞血酸20份~50份，半乳糖 3000份~5000份，葡萄糖3000份~5000份，瓊脂2000份~4000份，水5000份~10000份。4. 根據權利要求1所述的育種方法，其特征在于，步驟二中，所述微重力的場強為0.Olg ~0·15g〇5. 根據權利要求1所述的育種方法，其特征在于，步驟二中，所述勻速旋轉的轉速為 35r/min~70r/min〇6. 根據權利要求1所述的育種方法，其特征在于，步驟三中，所述丙酮-乙醇溶液中丙酮 與乙醇的體積比為1:20~30。7. 根據權利要求1所述的育種方法，其特征在于，步驟四中，所述α射線源的劑量率為 3500倫琴/小時~9000倫琴/小時。
【文檔編號】A01H1/08GK105900828SQ201610236279
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年4月14日
【發明人】周常
【申請人】周常