專利名稱：用于由可發(fā)酵糖及其混合物生產(chǎn)l(+)-乳酸鹽的嗜熱微生物凝結(jié)芽孢桿菌菌株sim-7dsm14043的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及利用微生物合成生產(chǎn)光學(xué)純的L(+)-乳酸鹽。
背景技術(shù)：
L(+)-乳酸鹽的微生物合成基于同型乳酸發(fā)酵，由一個發(fā)酵的己糖(例如葡萄糖或半乳糖)分子形成兩個乳酸鹽分子。
目前尚未實現(xiàn)純L(+)-乳酸鹽的工業(yè)化學(xué)合成，因此對于該化合物的微生物合成還沒有替代方式。
在L(+)-乳酸鹽微生物合成中，從能耗效率的角度考慮，在可使設(shè)備和發(fā)酵培養(yǎng)基不經(jīng)高溫滅菌步驟的發(fā)酵過程順利進(jìn)行的條件下，所用微生物菌株的最高可能培養(yǎng)溫度是決定性的因素。
在目前基于乳酸桿菌的發(fā)酵過程中，培養(yǎng)溫度不超過45℃，這就不能避免在非無菌條件、營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中進(jìn)行的發(fā)酵過程會受到嗜熱微生物的污染(J.H.Litchfield；In Advances in Applied Microbiology，Neidleman S.L.ed，Vol.42，pp 45-95，1996)。基于凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)TB/04的過程的最佳培養(yǎng)溫度為52℃(T.Payot，Z.Chemaly，F(xiàn).Fick Enzyme and Microbial Technology，24，191-199頁)。這種情況的缺陷在于，高糖濃度(高于7，5％)下該過程的抑制使這一菌株以工業(yè)規(guī)模應(yīng)用復(fù)雜化。
本發(fā)明以微生物菌株凝結(jié)芽孢桿菌DSM 51％為原型(美國專利5079164；C12P7/56，C12R 1/07；Jungbunzlauer Aktiengesellschaft，1992)。在基于這種微生物的發(fā)酵過程中，最佳培養(yǎng)溫度是52℃。培養(yǎng)該微生物的起始糖濃度可達(dá)20％。但這種微生物只能將生長培養(yǎng)基中70％的葡萄糖或蔗糖轉(zhuǎn)化成乳酸鹽，低于目前工業(yè)應(yīng)用水平(85-90％)。
另外，凝結(jié)芽孢桿菌DSM 51％不能水解淀粉，這意味著需要在單獨的工藝工程中先將作為廉價原料的淀粉進(jìn)行預(yù)處理(液化和糖化)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供嗜熱微生物菌株，該菌株能在比目前已知的發(fā)酵過程更高的溫度下生長并產(chǎn)生乳酸鹽、對高起始糖濃度具有更高的耐受性、能水解淀粉并適于利用可發(fā)酵單糖和淀粉生產(chǎn)L(+)-乳酸鹽。
本發(fā)明的目的在于提供由過熱谷物(overheated cereal)(小麥)中分離的、具有微生物降解特性的嗜熱微生物菌株凝結(jié)芽孢桿菌SIM-7 DSM14043。碾磨小麥?zhǔn)沟矸垡夯?。所得的具?8-20％糖含量的水解產(chǎn)物在60℃下用作富集培養(yǎng)物。用標(biāo)準(zhǔn)的微生物方法進(jìn)一步篩選所述的微生物菌株。
培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)特征凝結(jié)芽孢桿菌SIM-7 DSM 14043的菌落為圓形、凸起、有光澤、透明、表面平滑、組分干燥、直徑2...3mm。長革蘭氏陽性桿狀細(xì)胞、成鏈。細(xì)胞能運動，形成近端卵形內(nèi)生孢子。
生理生化特性該微生物菌株可利用單糖葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖，和二糖蔗糖、麥芽糖和纖維二糖生長。可利用多糖-淀粉生長。不能發(fā)酵乳糖。不能降解酪蛋白和明膠。
其可進(jìn)行發(fā)酵代謝，可發(fā)酵葡萄糖和淀粉成L(+)-乳酸鹽而不形成CO2。不形成D(-)-乳酸、耐氧。過氧化氫酶陽性、細(xì)胞色素c陰性。無吲哚形成能力。
生長溫度該菌株可在高達(dá)65℃下生長，其孢子的活力在85℃下至少可以保持40分鐘。其最佳培養(yǎng)溫度是57℃，可將包括淀粉在內(nèi)的可發(fā)酵糖轉(zhuǎn)化為高純度的L(+)-乳酸鹽，自代謝糖的轉(zhuǎn)化率達(dá)95％。其可在高達(dá)65℃的條件下生長并生產(chǎn)L(+)-乳酸鹽，該溫度比先前已報道的其它菌株的相應(yīng)溫度高出5-10℃。
對本發(fā)明目的微生物的菌株的鑒定應(yīng)用Biolog公司基于代謝活性方式(GP2 Microplate)的革蘭氏陽性微生物鑒定系統(tǒng)，GP數(shù)據(jù)庫(版本4.01A)，鑒定出菌株SIM-7最可能(99％)為熱葡糖苷酶芽孢桿菌(Bacillus thermoglucosidasius)物種。但這些數(shù)據(jù)與菌株SIM-7的16S rRNA基因序列數(shù)據(jù)(Gene Bank acc.nr.AF346895)相矛盾。Gene bank的數(shù)據(jù)表明與SIM-7菌株親緣關(guān)系最近的菌株中，它與Bacillus sp HC15(AC252329)相比，總共1464個核苷酸的序列中有2個核苷酸不同；與凝結(jié)芽孢桿菌NCDO 1761(X60614)有6個核苷酸不同；與凝結(jié)芽孢桿菌IAM 12463(D16267)有7個核苷酸不同；與凝結(jié)芽孢桿菌JCM2257 (D8313)有8個核苷酸不同。而與熱葡糖苷酶芽孢桿菌(ABO21197)有131個核苷酸不同。Dr Watanabe等[Watanabe，K.，Kitamura，K.，Suzuki，Y(1996)Appl.Environ.Microbiol.622066-2073]比較了菌株熱葡糖苷酶芽孢桿菌KP1006和凝結(jié)芽孢桿菌ATCC 7050中的一個分解代謝基因(寡-1，6葡萄糖苷酶)的核苷酸序列。這些蛋白的總體序列相似似性為59％(Watanabe等)。菌株SIM-7的16S rRNA基因序列和寡-1，6葡萄糖苷酶的部分核苷酸序列均表現(xiàn)出與凝結(jié)芽孢桿菌物種具有明顯的相關(guān)性。在菌株凝結(jié)芽孢桿菌ATCC 7050和凝結(jié)芽孢桿菌SIM-7 DSM14043中，該基因第643到1287位核苷酸中僅有2個核苷酸的差異，均導(dǎo)致Met399/Ile和Gln402/His的改變(分別在GeneBank D78342的核苷酸序列中，a替代了1244位的g，t替代了1253位的a)。所以，菌株SIM-7是凝結(jié)芽孢桿菌的非典型嗜熱變體，盡管總體上其與物種熱葡糖苷酶芽孢桿菌代謝類似。菌株凝結(jié)芽孢桿菌SIM-7 DSM14043也沒有β-半乳糖苷酶活性，與凝結(jié)芽孢桿菌DSM 5196(Kirkovits等)不同，其不能利用乳糖生長但可利用半乳糖生長。具有上述特性的微生物在2001年2月8日保藏于德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen undZellkulturen GmbH)，保藏號為DSM 14043。
該微生物菌株能在高溫下生長并可利用糊精的能力簡化了由淀粉生產(chǎn)乳酸鹽的工藝，免去了單獨進(jìn)行淀粉糖化的工藝步驟，節(jié)省了淀粉糖化作用所需的葡糖淀粉酶，使該工藝過程更為廉價。
在57℃的溫度下進(jìn)行部分液化淀粉發(fā)酵過程中，由于培養(yǎng)基的粘度降低而減少了攪拌所需能量。可發(fā)酵幾種單糖和二糖的能力使該菌株可用于由復(fù)合糖底物或其混合物生產(chǎn)L(+)-乳酸鹽。如果將谷物作為淀粉的來源，菌株對礦物質(zhì)和含氮化合物的需要即可大部分由所述谷物衍生的化合物提供。所述微生物可耐受生長培養(yǎng)基中的高起始糖濃度(17-20％)，除在培養(yǎng)基中積累13-14％的乳酸鈣外，還在生長培養(yǎng)基中積累葡萄糖。所幸乳酸鈣在高發(fā)酵溫度下具有良好的溶解性，如果該過程涉及Ca2+中和作用，可將乳酸鈣的濃度提高到160-170gl-1。
由可發(fā)酵糖及其混合物生產(chǎn)L(+)-乳酸鹽的方法基于在53-65℃的溫度培養(yǎng)所述微生物菌株，最佳培養(yǎng)溫度為57℃，培養(yǎng)基中含部分可發(fā)酵糖，包括糊精、淀粉和其它營養(yǎng)物。發(fā)酵所得的L(+)-乳酸鹽濃度達(dá)12％、收率達(dá)95％?？稍诓粚υO(shè)備和培養(yǎng)基進(jìn)行高溫滅菌的情況下培養(yǎng)所述微生物。利用谷物粉作為發(fā)酵糖源，微生物菌株對生長培養(yǎng)基中礦物質(zhì)和含氮化合物的需要可由所述谷物衍生的化合物提供。
實施例1.嗜熱微生物菌株凝結(jié)芽孢桿菌SIM-7 DSM 14043的分離利用微生物的谷物降解特性由過熱谷物(小麥)中分離出所述菌株。小麥顆粒(vheat mass)已經(jīng)過粉碎并液化。所得糖含量為18-20％的淀粉水解物，在60℃下用作富集培養(yǎng)物。將所述培養(yǎng)物鋪展為單菌落，挑選出可使培養(yǎng)基酸化的菌落，接下來通過不產(chǎn)生CO2而篩選具有同型乳酸發(fā)酵能力的菌落。L(+)-乳酸鹽經(jīng)L-乳酸鹽脫氫酶酶解檢測。從嗜熱、耐氧并可產(chǎn)L(+)-乳酸鹽的菌落中分離出凝結(jié)芽孢桿菌SIM-7 DSM 14043純培養(yǎng)物。
2.L(+)-乳酸鹽的生產(chǎn)將Tritical粉(285g)懸浮于1升水中，用α-淀粉酶在85℃下液化淀粉至DE＝22.5。在60℃下用葡糖淀粉酶將液化的淀粉糖化。離心從糖化淀粉中去除不溶性的纖維物質(zhì)和蛋白質(zhì)。向葡萄糖含量為14.8g/l的糊狀上清中加入最多0.6％的酵母抽提物用作凝結(jié)芽孢桿菌SIM-7 DSM 14043的發(fā)酵培養(yǎng)基。向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入碳酸鈣中和所形成的乳酸。發(fā)酵pH為5.3-6.2之、溫度57℃、每分鐘攪拌100轉(zhuǎn)。在這些條件下發(fā)酵98小時后，L(+)-乳酸鹽的終濃度達(dá)12.3％。由代謝葡萄糖到L(+)-乳酸鹽的產(chǎn)率為95.5％。
權(quán)利要求
1.微生物菌株凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulons)SIM-7 DSM14043。
2.利用如權(quán)利要求1所述的微生物由可發(fā)酵糖及其混合物生產(chǎn)L(+)-乳酸鹽鹽的方法，其特征在于，在53-65℃的溫度下培養(yǎng)所述微生物菌株，并且發(fā)酵培養(yǎng)基含部分可發(fā)酵的糖，包括糊精、淀粉和其它營養(yǎng)物。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，在57℃的溫度下培養(yǎng)所述微生物菌株。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，在設(shè)備和培養(yǎng)基不進(jìn)行高溫滅菌的條件下培養(yǎng)所述微生物菌株。
5.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，將谷物粉用作可發(fā)酵糖的來源。
全文摘要
用于由可發(fā)酵糖，包括糊精、淀粉生產(chǎn)L(+)－乳酸鹽的微生物菌株凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)SIM－7 DSM 14043。優(yōu)選的培養(yǎng)溫度為53－65℃。發(fā)酵所得的L(+)－乳酸鹽終濃度達(dá)12％、產(chǎn)率達(dá)95％。可在不對設(shè)備和培養(yǎng)基進(jìn)行高溫滅菌的情況下培養(yǎng)所述微生物菌株。利用谷物粉作為可發(fā)酵糖源，微生物菌株對礦物質(zhì)和氮鹽的需要可由谷物中的化合物提供。
文檔編號C12P7/56GK1498265SQ02806664
公開日2004年5月19日 申請日期2002年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月16日
發(fā)明者J·西米斯克, A·努爾克, A·黑納魯, , J 西米斯克, 陜 申請人:塔圖大學(xué)