一種細菌cd-126發酵液及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種細菌CD-126發酵液及其應用，屬于應用微生物學領域。本發明的細菌CD-126發酵液，其生產菌株為變形桿菌（Proteus?sp.）CD-126,菌株CD-126已于2012年7月12日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏單位地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所；保藏號：CGMCC?No.6357。發明的細菌CD-126發酵液應用于真菌寡孢節叢孢（Arthrobotrys?oligospora）捕食器官的誘導中。本發明的優點在于：利用細菌快速誘導捕食線蟲真菌產生捕食器官，明顯提高了捕食線蟲真菌捕食線蟲的能力。
【專利說明】—種細菌CD-126發酵液及其應用
【技術領域】:
[0001]本發明涉及一種細菌⑶-126發酵液及其應用，屬于應用微生物學領域。
【背景技術】:
[0002]植物寄生線蟲是植物的重要病害之一，據估計全球每年由植物寄生線蟲所造成的作物損失達1570億美元(Abad et al.2008)，線蟲病害成為農業生產中重要的限制因子之一。目前對線蟲病害的防治仍然以化學防治為主，但由于化學農藥對生態環境的影響以及寄生線蟲抗藥性的增加，利用線蟲天敵進行生物防治備受關注。捕食線蟲真菌(Nematode-trapping fungi)是自然界中控制線蟲種群數量的一類重要的真菌生物因子，它們利用營養菌絲特化形成的捕食器官，如收縮環、非收縮環、粘性菌絲、粘性分枝、及三維菌網完成對線蟲的捕捉和侵染。捕食線蟲真菌的捕食器官是其侵染植物寄生線蟲的必要條件之一，捕食器官在營養貧瘠的培養基上能夠自發產生，也能夠通過環境因子(氨基酸和多肽等)的誘導產生。
[0003]經文獻檢索，未發現與本
【發明內容】
相同文獻的公開報道。
【發明內容】
:
[0004]本發明的目的在于提供一種細菌⑶-126發酵液及其應用。
[0005]本發明是這樣實現的:
[0006]本發明使用的細菌菌株是變形桿菌(Proteus sp.)CD_126，菌株CD-126已于2012年7月12日保藏在中國微生物菌 種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏單位地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所；保藏號=CGMCC N0.6357。
[0007]1.細菌CD-126的保存
[0008]培養基:LB培養基為常規培養基。培養基的組成和配制方法如下:
[0009]LB培養基:稱取胰蛋白胨IOg,酵母粉5g和NaCl IOg用去離子水溶解并定容至1L,調節PH到7.0，加入20g瓊脂，121°C滅菌20分鐘。
[0010]細菌⑶-126保存在LB固體培養基上。
[0011]2.捕食線蟲真菌寡孢節叢孢(Arthrobotrys oligospora)的培養
[0012]a.培養基:
[0013]CMA培養基:稱取20g玉米顆粒，加入1000mL自來水，煮沸20分鐘，用四層紗布過濾收集液體，加入20g瓊脂，再定容到1L，121°C滅菌20分鐘。
[0014]b.寡孢節叢孢的活化和孢子培養:在CMA固體培養基上接種寡孢節叢孢，26°C恒溫培養箱內培養10天，以得到大量的孢子。用無菌水沖洗CMA平板上的寡孢節叢孢菌絲；用移液器將平板上的液體轉移至裝有無菌擦鏡紙的漏斗內過濾，收集孢子，制備孢子懸液；用血球計數板計數孢子液內的孢子濃度。
[0015]3.細菌⑶-126發酵液的制備
[0016]在裝有5-10ml LB液體培養基的試管中接種細菌CD-126，25°C~38°C恒溫搖床內培養24-72小時。發酵液用高速離心機在1000Orpm下離心5min分離菌液和菌體，吸取上清液放在-4°C的冰箱中備用，得到本發明使用的活性發酵液
[0017]4.捕食線蟲真菌寡孢節叢孢(Arthrobotrys oligospora)捕食器官的誘導
[0018]收集得到寡孢節叢孢的孢子，實驗組(三維菌網誘導組)在水瓊脂平板上加入⑶-126上清液，將上清液和孢子懸液(1:1，v/v)混勻涂在平板上；對照組(培養基)平板上加入LB液體培養基和孢子懸液(1:1，v/v)混勻涂布；將兩組平板靜置于26°C恒溫培養箱內培養。用光學顯微鏡(Olympus, Japan)觀察誘導產生的捕食器官(三維菌網)的形態。
[0019]5.細菌⑶-126發酵液中揮發性物質對寡抱節叢抱(Arthrobotrys oligospora)捕食器官的誘導
[0020]用酒精和紫外殺菌處理過的兩格平板作為實驗平臺，在其中一個格里面倒入滅菌水瓊脂。將寡孢節叢孢的孢子鋪在水瓊脂平板上，在另一個空格中加入細菌發酵液，同時做培養基對照。用光學顯微鏡(Olympus，Japan)觀察誘導產生的捕食器官(三維菌網)的形態。
[0021]本發明的優點在于:利用細菌快速誘導捕食線蟲真菌產生捕食器官，明顯提高了捕食線蟲真菌捕食線蟲的能力。
【專利附圖】
【附圖說明】:
[0022]附圖1:捕食線蟲真菌(寡孢節叢孢)的捕食器官誘導(光學顯微鏡照片)
【具體實施方式】:
[0023]以下是本發明的實施例，但本發明的內容并不局限于此。
[0024]實施例的細菌CD-126發酵液的制備過程同
【發明內容】
部分的描述。
[0025]實施例1:細菌⑶-126發酵液對寡孢節叢孢(Arthrobotrys oligospora)捕食器官的誘導。
[0026]按照上述寡孢節叢孢的活化和孢子培養的方法，將寡孢節叢孢接種CMA固體培養基，26°C恒溫培養箱中培養5-6天。用無菌水沖洗CMA平板上的寡孢節叢孢菌絲；用移液器將平板上的液體轉移至裝有無菌擦鏡紙的漏斗內過濾，收集孢子，制備成孢子懸液，用于三維菌網的誘導。
[0027]實驗組(三維菌網誘導組)在水瓊脂平板上加入⑶-126上清液，將上清液和孢子懸液(1: 1，v/v)混勻涂在平板上；對照組(培養基)平板上加入LB液體培養基和孢子懸液(1: 1，v/v)混勻涂布；將兩組平板靜置于26°C恒溫培養箱內培養，在36-48h時，寡孢節叢孢產生大量的捕食器官(三維菌網)(附圖1)。
[0028]實施例2:細菌03-126發酵液中揮發性物質對寡孢節叢孢(Arthrobotrysoligospora)捕食器官的誘導。
[0029]按照上文寡孢節叢孢的活化和孢子培養的方法，寡孢節叢孢接種CMA固體培養基，26°C恒溫培養箱內培養10天，以得到大量的孢子。用無菌水沖洗CMA平板上的寡孢節叢孢菌絲，用移液器將平板上的液體轉移至裝有無菌擦鏡紙的漏斗內過濾，收集孢子，制備成孢子懸液。
[0030]將收集得到的寡孢節叢孢的孢子置于倒有水瓊脂的兩格平板的一個空格上，250μ?ν格，涂布；實驗組(三維菌網誘導組)在兩格平板空格中的另一個空格加入細菌發酵液500 μ L ;同時在另一個兩格平板上做培養基對照。將它們分別靜置于26°C恒溫培養箱內培養。在36-48h時，寡孢節叢孢產生大量的捕食器官(三維菌網)。
【權利要求】
1.一種細菌⑶-126發酵液，其特征在于生產菌株為變形桿菌(Proteus sp.)⑶-126，菌株⑶-126已于2012年7月12日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏號:CGMCC N0.6357。
2.權利要求1所述細菌CD-126發酵液的應用，其特征在于細菌CD-126發酵液應用于真菌寡孢節叢孢(Arthrobotrys oligospor a)捕食器官的誘導中。
【文檔編號】C12R1/645GK103484500SQ201310382605
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年8月29日 優先權日:2013年8月29日
【發明者】李國紅, 徐優耀, 張克勤, 王芯 申請人:云南大學