專利名稱：一種生產(chǎn)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的方法及其專用菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中一種生產(chǎn)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的方法及其專用菌株。
背景技術(shù)：
利用環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(cyclodextrin glucanotransferase，CGTase)可將來(lái)源豐富、價(jià)格低廉的淀粉類物質(zhì)轉(zhuǎn)化成β-環(huán)糊精(β-CD)。β-CD及其衍生物做為添加劑或包埋材料在食品、醫(yī)藥、農(nóng)藥及環(huán)保領(lǐng)域用途廣泛且具有無(wú)毒副作用、包埋用量大的特點(diǎn)。我國(guó)β-CD的生產(chǎn)雖有20多年的歷史，但由于生產(chǎn)菌種酶產(chǎn)量不高及β-CD生產(chǎn)成本過(guò)高而導(dǎo)致其應(yīng)用受到限制，因此，選育CGTase高產(chǎn)菌是我國(guó)酶制劑研究的一項(xiàng)重要任務(wù)。優(yōu)良的菌種是提高CGTase活力的關(guān)鍵，而適宜的生產(chǎn)方法和培養(yǎng)條件是發(fā)揮優(yōu)良菌種性能、獲得高產(chǎn)酶量的保證。環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶可由嗜堿芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)，但目前微生物發(fā)酵生產(chǎn)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的產(chǎn)量不高，且發(fā)酵時(shí)間較長(zhǎng)。
離子注入誘變育種是近年來(lái)興起的一種新型誘變育種方法，已在農(nóng)作物及工業(yè)微生物菌種的誘變育種領(lǐng)域取得豐碩成果(汪秀峰，吳敬德。離子注入改良水稻廣親和系02428[J]。安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，26(4)423-426；桑金隆，竺莉紅，李孝輝。離子注入誘變選育之江菌素產(chǎn)生菌[J]。科技通報(bào)，2002，18(1)63-66)。注入離子對(duì)生物體的作用是集能量沉積、動(dòng)量傳遞、質(zhì)量沉積和電荷的中和與交換于一體的聯(lián)合作用(余增亮，霍裕平。離子注入生物學(xué)研究述評(píng)[J]。安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1994，21(3)221-225)。離子注入對(duì)生物細(xì)胞既存在著直接作用又存在著間接作用，注入離子的動(dòng)量傳遞產(chǎn)生了對(duì)細(xì)胞的直接作用，其能量沉積顯示著對(duì)細(xì)胞的間接作用。已有研究表明質(zhì)量沉積作用能誘導(dǎo)注入的生物分子或細(xì)胞內(nèi)生成新產(chǎn)物(邵春林，余增亮。低能離子輻照的刺激效應(yīng)模型[J]。核技術(shù)，1996，19(6)321-325)。生物大分子中不乏氮元素，因此氮離子注入對(duì)生物體的誘變作用是多重性的，它與γ-射線或紫外線誘變有所不同，是損傷及修復(fù)同時(shí)進(jìn)行的一種復(fù)合誘變。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種生產(chǎn)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的方法及其專用菌株。
本發(fā)明所提供的生產(chǎn)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的菌株是嗜堿芽孢桿菌(Bacillusalcalophilus)HA-1，已于2004年12月27日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC)，保藏號(hào)為CGMCC № 1278。
該菌株的細(xì)胞呈桿狀，直徑小于1μM，孢囊膨大，中生或次端生芽孢，革蘭氏染色陽(yáng)性，菌落圓滑呈黃橙色，好氧，在pH值8.5-9.5條件下生長(zhǎng)良好。
本發(fā)明所提供的生產(chǎn)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的方法，是由嗜堿芽孢桿菌(Bacillus alcalophilus)HA-1 CGMCC № 1278發(fā)酵得到的。
其中，所述嗜堿芽孢桿菌(Bacillus alcalophilus)HA-1 CGMCC № 1278的發(fā)酵培養(yǎng)基包括玉米粉或玉米淀粉1.5％-2.5％，蛋白質(zhì)含量≥40％的玉米漿5.0％-6.5％；所述百分含量除玉米漿為體積百分含量外，其余均為質(zhì)量百分含量。所述玉米粉或玉米淀粉的質(zhì)量百分含量?jī)?yōu)選為1.5％-2.0％，蛋白質(zhì)含量≥40％的玉米漿的體積百分含量?jī)?yōu)選為5.0％-5.5％。
為了提高環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的產(chǎn)量，所述發(fā)酵培養(yǎng)基還包括質(zhì)量百分含量為0.2％的K2HPO4，質(zhì)量百分含量為0.02％的MgSO4·7H2O。
所述發(fā)酵的起始pH為8.5-9.5，優(yōu)選為8.6-9.2，可用Na2CO3調(diào)節(jié)。
所述嗜堿芽孢桿菌HA-1 CGMCC № 1278的培養(yǎng)溫度可為27℃-29℃。
所述發(fā)酵的通氣量可為0.8-1.2m3/m3/min，優(yōu)選為1m3/m3/min。
本發(fā)明的嗜堿芽孢桿菌(Bacillus alcalophilus)HA-1 CGMCC № 1278產(chǎn)酶水平高、發(fā)酵時(shí)間短，且產(chǎn)酶具有傳代穩(wěn)定性，10L發(fā)酵罐中發(fā)酵24h產(chǎn)酶活力(酶產(chǎn)量)可達(dá)到6100U/ml(是原始出發(fā)菌株的2倍以上)；5000L發(fā)酵罐中發(fā)酵20.5h產(chǎn)酶活力可達(dá)到6875U/mL。本發(fā)明的方法及其專用菌株將在環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的生產(chǎn)中發(fā)揮重要作用，具有廣闊的工業(yè)應(yīng)用前景。
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法；所提到的百分含量如無(wú)特別說(shuō)明均為質(zhì)量百分含量。
實(shí)施例1、嗜堿芽孢桿菌(Bacillus alcalophilus)HA-1 CGMCC № 1278的獲得培養(yǎng)基平板分離及斜面培養(yǎng)基(％)可溶性淀粉2％；聚蛋白胨0.5％；酵母浸膏0.5％；K2HPO40.1％；MgSO4·7H2O0.02％；瓊脂3％；滅菌后加入無(wú)菌Na2CO3調(diào)pH至8.5-9.5。
發(fā)酵培養(yǎng)基2.5％玉米粉；5％(V/V)玉米漿(蛋白質(zhì)的質(zhì)量百分含量≥40％，購(gòu)自新鄉(xiāng)淀粉廠)；0.1％K2HPO4；0.02％MgSO4·7H2O；滅菌后加入無(wú)菌Na2CO3調(diào)pH至8.5-9.5。
將固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)36h的嗜堿芽孢桿菌C(購(gòu)自鄭州市醫(yī)藥科技開(kāi)發(fā)中心)制成菌懸液，取0.1ml均勻涂布于滅菌的平皿，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。挑單菌落于平面固體培養(yǎng)基上，待菌長(zhǎng)出后，挑選相對(duì)菌小圈(淀粉水解圈)大的菌落制成菌懸液，取0.1ml均勻涂布于滅菌的平皿中心一薄層，無(wú)菌風(fēng)干后立即進(jìn)行誘變處理先進(jìn)行γ-誘變(0.5Gy)，然后依次進(jìn)行能量30kev劑量如下的氮離子注入誘變2×1015個(gè)氮離子/cm2、1×1015個(gè)氮離子/cm2、兩輪5×1015個(gè)氮離子/cm2、2×1015個(gè)氮離子/cm2、1×1016個(gè)氮離子/cm2及5×1015個(gè)氮離子/cm2的氮離子注入誘變。注入后立即用無(wú)菌水洗脫菌斑，稀釋(10-1-10-2)后涂皿，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。挑單菌落于固體平板培養(yǎng)基上，待菌落長(zhǎng)出后，視菌落周圍透明圈(淀粉水解圈)的大小進(jìn)行初篩，挑選相對(duì)菌小圈大的菌落接種于斜面，28℃培養(yǎng)1d后挖塊接種于裝有30ml發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，在200rpm搖床上發(fā)酵1-2d，測(cè)定發(fā)酵液酶活力，進(jìn)行復(fù)篩。參照文獻(xiàn)(張樹(shù)政.酶制劑工業(yè)[M].北京科學(xué)出版社，1984.549)的方法測(cè)定酶活力，具體方法如下取10μl樣品(對(duì)照不加樣品)，加入0.2ml pH9.0的0.2M甘氨酸-氫氧化鈉緩沖溶液，0.2ml 0.2％馬鈴薯淀粉溶液(空白不加馬鈴薯淀粉溶液)，40℃反應(yīng)10min后加入0.5ml 0.5M醋酸終止反應(yīng)，加入3ml 0.005％碘液顯色，在700nm處測(cè)定吸光值(A)，以吸光值下降10％的酶量為1個(gè)單位。
計(jì)算公式 結(jié)果表明嗜堿芽孢桿菌C經(jīng)自然分離得到的產(chǎn)酶活性(酶產(chǎn)量)較高的0-4菌株38h的產(chǎn)酶活性為2500U/mL，然后對(duì)該菌株進(jìn)行γ-誘變，得到的產(chǎn)酶活性較高的02-1-29菌株40h的產(chǎn)酶活性為3633U/mL；再對(duì)02-1-29菌株進(jìn)行能量為30kev，劑量2×1015個(gè)氮離子/cm2的離子誘變，得到的產(chǎn)酶活性較高的02-2-500菌株41h的產(chǎn)酶活性為7129U/mL；再對(duì)02-2-500菌株進(jìn)行能量為30kev，劑量1×1015個(gè)氮離子/cm2的離子誘變，得到的產(chǎn)酶活性較高的02-3-209菌株46h的產(chǎn)酶活性為4067U/mL；再對(duì)02-3-209菌株進(jìn)行能量為30kev，劑量5×1015個(gè)氮離子/cm2的離子誘變，得到的產(chǎn)酶活性較高的02-4-417菌株40h的產(chǎn)酶活性為6371U/mL；再對(duì)02-4-417菌株進(jìn)行能量為30kev，劑量5×1015個(gè)氮離子/cm2的離子誘變，得到的產(chǎn)酶活性較高的02-5-71菌株(24h的酶活性為2012U/mL，41h的產(chǎn)酶活性為5805U/mL)；再對(duì)02-5-71菌株進(jìn)行能量為30kev，劑量2×1015個(gè)氮離子/cm2的離子誘變，對(duì)篩選得到的產(chǎn)酶活性較高的菌株再進(jìn)行能量為30kev，劑量1×1016個(gè)氮離子/cm2的離子誘變，再對(duì)由該劑量篩選得到的產(chǎn)酶活性較高的菌株進(jìn)行能量為30kev，劑量5×1015個(gè)氮離子/cm2的離子誘變，得到一株酶活性較高的菌株-HA-1菌株，其24h的酶活性為4185U/mL，其41h的酶活性為6500U/mL。以上均為搖瓶發(fā)酵結(jié)果。
對(duì)以上篩選得到的菌株結(jié)合遺傳穩(wěn)定性確定最佳菌株，02-2-500雖產(chǎn)酶活力較高，但此菌株傳代不穩(wěn)定，F(xiàn)2代產(chǎn)酶又下降至02-1-29水平。對(duì)此菌株繼續(xù)進(jìn)行氮離子注入誘變，得到02-3-209，此菌株產(chǎn)酶活力雖然不是同期最高者，但其29hr產(chǎn)酶2487U/ml，為同期復(fù)篩中最高者，故以此菌株作為出發(fā)株又進(jìn)行一輪氮離子注入誘變，得到02-4-417，此菌株來(lái)自于5×1015個(gè)氮離子/cm2劑量誘變，40hr產(chǎn)酶活性6371U/ml為同期最高，但同樣具有傳代不穩(wěn)定的特點(diǎn)，再次以此菌株作為出發(fā)株進(jìn)行新一輪氮離子注入誘變，得到02-5-71，該菌株也來(lái)自于5×1015個(gè)氮離子/cm2劑量誘變，41hr產(chǎn)酶活性5805U/ml為同期最高。02-5-71菌株具有較好的傳代穩(wěn)定性，與F1代相比較，F(xiàn)2、F3、F4、F5代的產(chǎn)酶活性分別是F1代的96.66％、103.02％、99.11％、101.46％。為了得到發(fā)酵時(shí)間較短，且產(chǎn)酶活性較高的菌株，再對(duì)02-5-71菌株進(jìn)行能量為30kev，劑量2×1015個(gè)氮離子/cm2的離子誘變、篩選，能量為30kev，劑量1×1016個(gè)氮離子/cm2的離子誘變、篩選，及能量為30kev，劑量5×1015個(gè)氮離子/cm2的離子誘變、篩選，得到一株產(chǎn)酶活性較高且發(fā)酵時(shí)間較短的菌株-HA-1菌株，其24h的產(chǎn)酶活性為4185U/mL，其41h的酶活性為6500U/mL。HA-1菌株具有較好的傳代穩(wěn)定性，與親代相比較，F(xiàn)1、F2、F3、F4、F5代的產(chǎn)酶活性分別是親代的108％、110％、98％、111％、107％。
實(shí)施例2、發(fā)酵條件的篩選應(yīng)用正交實(shí)驗(yàn)法制成四因素三水平正交表L9(34)進(jìn)行HA-1菌株和02-5-71菌株發(fā)酵條件的篩選表1 02-5-71菌株實(shí)驗(yàn)因素水平表 表2 02-5-71菌株一級(jí)發(fā)酵39h正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

表3 應(yīng)用營(yíng)養(yǎng)物不同比例搭配配方HA-1菌株發(fā)酵結(jié)果

以含有K2HPO40.2％和MgSO4·7H2O 0.02％的培養(yǎng)基中玉米粉、玉米漿百分含量及發(fā)酵的pH、溫度為考察因素，各取3個(gè)水平(表1)，確定02-5-71菌株的適宜發(fā)酵條件。由斜面菌種直接接種于含30ml發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，02-5-71菌株200rpm一級(jí)發(fā)酵39h，以發(fā)酵液酶活力為考察指標(biāo)，結(jié)果如表2所示，表明4個(gè)考察因素中發(fā)酵溫度及培養(yǎng)基中玉米漿含量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶影響較大。發(fā)酵液的酸堿度對(duì)菌種產(chǎn)酶影響較大，pH小于8或大于10產(chǎn)酶量均較低，為了進(jìn)一步確定最佳pH，實(shí)驗(yàn)選擇pH8.5-9.5作為正交實(shí)驗(yàn)的其中一因素三水平，結(jié)果表明，pH在8.5、9、9.5三個(gè)水平雖然極差最小，但發(fā)現(xiàn)02-5-71菌株pH為9時(shí)產(chǎn)酶較高，經(jīng)正交法篩選的02-5-71菌株的適宜發(fā)酵條件為玉米粉2％，玉米漿(蛋白質(zhì)的質(zhì)量百分含量≥40％，購(gòu)自新鄉(xiāng)淀粉廠)5％，K2HPO40.2％和MgSO4·7H2O 0.02％，初始pH9，培養(yǎng)溫度28℃；在此發(fā)酵液配方的基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化HA-1菌株的適宜發(fā)酵配方，搖瓶發(fā)酵結(jié)果如表3所示，表明HA-1菌株的適宜發(fā)酵配方為玉米粉1.5％-2.5％，玉米漿(蛋白質(zhì)的質(zhì)量百分含量≥40，購(gòu)自新鄉(xiāng)淀粉廠)5.0％-6.5％，K2HPO40.2％和MgSO4·7H2O 0.02％，滅菌后用無(wú)菌的Na2CO3調(diào)初始pH為8.6-9.0。以上除玉米漿為體積百分含量外，其余均為質(zhì)量百分含量。培養(yǎng)溫度27℃-29℃。
應(yīng)用HA-1菌株的適宜發(fā)酵培養(yǎng)基配方玉米粉2.0％，玉米漿(蛋白質(zhì)的質(zhì)量百分含量≥40％，購(gòu)自新鄉(xiāng)淀粉廠)5.0％，K2HPO40.2％和MgSO4·7H2O 0.02％)在種齡為23-26h、接種量8％、初始pH8.9-9.0、培養(yǎng)溫度27-29℃、裝罐量75％、通氣量(每分鐘通入發(fā)酵罐的空氣體積與發(fā)酵罐中發(fā)酵液體積的比值)為1m3/m3/min的發(fā)酵條件下，于10L發(fā)酵罐中發(fā)酵24小時(shí)，0-4菌株、02-5-71菌株與HA-1菌株產(chǎn)酶活力分別為2600U/ml發(fā)酵液、3573U/ml發(fā)酵液和6100U/ml發(fā)酵液。
在培養(yǎng)基中添加無(wú)機(jī)鹽的研究表明添加K2HPO4(0.2％)和MgSO4·7H2O(0.02％)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶有利，不加此兩種無(wú)機(jī)鹽或添加其它無(wú)機(jī)鹽將導(dǎo)致酶大幅度減產(chǎn)或不產(chǎn)酶。因此這兩種無(wú)機(jī)鹽在菌種發(fā)酵產(chǎn)酶中非常關(guān)鍵。
實(shí)施例3、利用嗜堿芽孢桿菌(Bacillus alcalophilus)HA-1 CGMCC № 1278生產(chǎn)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶將嗜堿芽孢桿菌(Bacillus alcalophilus)HA-1 CGMCC № 1278菌種接入300L種子罐(培養(yǎng)基為玉米粉2％，玉米漿(蛋白質(zhì)的質(zhì)量百分含量≥40％，購(gòu)自孟州金玉米有限公司)5％，K2HPO40.2％和MgSO4·7H2O 0.02％，滅菌后加入無(wú)菌的Na2CO3溶液將培養(yǎng)基的pH調(diào)到8.6))，27-29℃培養(yǎng)24h后以5％的接種量接入5000L發(fā)酵罐(培養(yǎng)基玉米粉2.3％，玉米漿(蛋白質(zhì)的質(zhì)量百分含量≥40％，購(gòu)自孟州金玉米有限公司)5.6％，K2HPO40.2％和MgSO4·7H2O 0.02％，滅菌后加入無(wú)菌的Na2CO3溶液將培養(yǎng)基的pH調(diào)到8.8)中，通氣量(每分鐘通入發(fā)酵罐的空氣體積與發(fā)酵罐中發(fā)酵液體積的比值)為1m3/m3/min，27-29℃培養(yǎng)，結(jié)果表明在5000L發(fā)酵罐中發(fā)酵20.5h產(chǎn)酶活力就可達(dá)到6875U/mL。
權(quán)利要求
1.嗜堿芽孢桿菌(Bacillus alcalophilus)HA-1 CGMCC № 1278。
2.一種生產(chǎn)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的方法，是由嗜堿芽孢桿菌(Bacillusalcalophilus)HA-1 CGMCC № 1278發(fā)酵得到的。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述嗜堿芽孢桿菌(Bacillusalcalophilus)HA-1 CGMCC № 1278的發(fā)酵培養(yǎng)基包括玉米粉或淀粉1.5％-2.5％，蛋白質(zhì)含量≥40％的玉米漿5.0％-6.5％；所述百分含量除玉米漿為體積百分含量外，其余均為質(zhì)量百分含量。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基中玉米粉或玉米淀粉的質(zhì)量百分含量為1.5％-2.0％，蛋白質(zhì)含量≥40％的玉米漿的體積百分含量為5.0％-5.5％。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基還包括質(zhì)量百分含量為0.2％的K2HPO4，質(zhì)量百分含量為0.02％的MgSO4·7H2O。
6.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基起始pH為8.5-9.5。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基起始pH為8.6-9.2。
8.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于嗜堿芽孢桿菌(Bacillusalcalophilus)HA-1 CGMCC № 1278的培養(yǎng)溫度為27℃-29℃。
9.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵的通氣量為0.8-1.2m3/m3/min。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵的通氣量為1m3/m3/min。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種生產(chǎn)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的方法及其專用菌株。本發(fā)明所提供的嗜堿芽孢桿菌(Bacillus alcalophilus)HA－1 CGMCC № 1278可用于發(fā)酵生產(chǎn)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶。嗜堿芽孢桿菌(Bacillus alcalophilus)HA－1 CGMCC №1278產(chǎn)酶水平高、發(fā)酵時(shí)間短，且產(chǎn)酶具有傳代穩(wěn)定性，10L發(fā)酵罐中發(fā)酵24h產(chǎn)酶活力(酶產(chǎn)量)可達(dá)到6100U/ml；5000L發(fā)酵罐中發(fā)酵20.5h產(chǎn)酶活力就可達(dá)到6875U/ml。本發(fā)明的方法及其專用菌株將在環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的生產(chǎn)中發(fā)揮重要作用，具有廣闊的工業(yè)應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12P21/02GK1796541SQ200410102569
公開(kāi)日2006年7月5日 申請(qǐng)日期2004年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月27日
發(fā)明者王雁萍, 秦廣雍, 段宇珩, 許平輝, 陳林海, 李宗偉, 蘇明杰, 談重芳, 李宗義, 霍裕平 申請(qǐng)人:鄭州大學(xué)