專利名稱：一種生物轉化生產琥珀酸的方法
技術領域：
本發明涉及微生物法生產琥珀酸，其以菊粉植物為原料，通過預處理等 手段加工成微生物可以利用的發酵原料，再利用微生物法生產琥珀酸的技 術。
背景技術：
琥珀酸是三羧酸循環的中間產物之一，同時也是許多厭氧微生物的代謝 終產物之一。同時，琥珀酸又是一種用途廣泛的重要基礎化工原料。在食品領域，琥珀酸可以應用于食品添加劑和調味劑；在醫藥領域，它可以作 為醫藥制品的輔料；在化工領域，它可以作為發泡劑、清潔劑及離子螯合 劑等；在石化工業中，被用作前體化合物生產丁二醇、四氫呋喃、g-丁內酯 等重要的化工產品。目前，琥珀酸產品主要由石化產品通過化學法生產， 由于生產原料為不可再生的石油資源，導致生產成本直接受國際油價的影 響，而且容易造成環境污染問題。因此利用微生物，轉化植物中豐富的碳 水化合物資源生產琥珀酸成為關注的熱點。自然界中有許多微生物可在厭氧條件下利用葡萄糖、果糖、甘露糖等 糖源發酵產生少量的琥珀酸。Guettler等人從厭氧菌株A^"o6"cz7/wwcr/"oge"中篩選出抗8g/L氟代乙酸的高產琥珀酸的突變株，以葡萄糖為 底物發酵，琥珀酸的產量在發酵罐中的濃度達到110g/L。美國應用碳化學 公司于2002年，通過對大腸桿菌的丙酮酸甲酸裂解酶基因(;^)，乳酸脫 氫酶基因(/"/0及葡萄糖磷酸轉移酶基因(/^G)三個基因的失活構造出 一株工程菌AFPlll，該工程菌通過利用玉米浸漬水為營養源在有氧階段快 速生長，然后進入無氧階段轉化葡萄糖生產琥珀酸。然而，廉價的初級生物質原料是降低發酵成本的有效途徑之一。纖維 素原料成本低廉，地球上纖維素資源十分豐富，然而目前經濟有效的利用 纖維素生物質原料是國際性難題之一，普遍采取的方法是采用稀酸處理纖 維素原料，然后再通過能表達纖維素酶，并能利用葡萄糖和木糖的微生物 催化劑，實現生物煉制。這種方法雖然有效，但由于纖維素處理過程中酸 的使用又不可避免的帶來了環境問題。玉米淀粉是最簡單易得的葡萄糖基 原料，微生物利用起來也十分的容易。但是，如果以玉米淀粉作為生物煉 制工藝的原料卻不符合我國的國情。由于我國耕地面積有限，我國年產玉 米1.2億噸，產量還不足美國的--半，人均占有不到100公斤，并且養殖消 耗占70-80%,用于工業的玉米占玉米總產量的10%左右，每年僅1000多 萬噸，因此國內的— 玉米淀粉遠遠滿足不了大規投的生物基產業的發展。發明內容本發明的目的是提供一種生物轉化生產琥珀酸的方法；其生產成本低， 原料來源廣泛，工藝簡單，技術路線成熟，可產業化實施。 為實現上述目的，本發明采用的技術方案為
一種生物轉化生產琥珀酸的方法，以菊粉植物為原料，將菊粉植物富含 菊粉的器官預處理后經滅菌接入微生物，進行生物轉化反應，生產琥珀酸；
產生的琥珀酸可以是有機酸的形式存在，也可以是以有機酸鹽的形式存在
菊粉是指一系列果糖多聚物，末端帶有一個葡萄糖殘基；菊粉植物是指 在塊根、塊莖等器官中富含菊粉的一類植物，如菊芋、菊苣和/或大麗花等 富含菊粉的植物；所述富含菊粉的器官是指菊粉植物的塊根或塊莖；
所述預處理是指將菊粉植物富含菊粉的器官其通過物理，化學或生物的 方法加工成菊芋片、菊芋粉、菊粉等便于后續加工的原料；或進一步將上 述原料通過化學法如稀酸水解法，或生物法如利用菊粉酶將其降解成 為微生物可以利用的富含糖的原料。
生物轉化反應包括微生物的厭氧發酵生產琥珀酸，同時也包括微生物 有氧生物轉化生產琥珀酸；所述微生物是指一類可利用葡萄糖、果糖、木 糖、甘露糖等單糖，或蔗糖、麥芽糖、果寡糖等寡糖，或菊粉等多糖碳源， 生產琥珀酸的常用微生物。如野生型微生物J"flera6/w; zW〃wm
wcc/"/")^o^cmy，或通過遺傳工程與基因工程改造的微生物五.co//， 5Wcc/zarawyces ce"Wc/ae, jW"o6a"7/ws wcc/"oge"es， Mww/ze/w/a swcc/m'"jwc^wcera， J加era6/o，W〃w/w swcc/m'cz) ra^cms,々mo/wowos mo6/to或乳酸菌菌株。 具體過程可為，
1) 將菊粉植物的塊莖按常規方法加工成菊芋粉和/或菊粉后，制成質量 濃度2~20%的溶液。
2) 在每升質量濃度為2 20%的菊芋粉或菊粉溶液中，加入 1000U 100000U單位的菊粉酶的比例配制菊粉或菊芋粉酶解反應液，菊粉 酶酶活定義為每分鐘水解底物產生1微摩爾果糖所需要的酶量，調pH-4 6， 50 65。C反應2 60h，酶反應進行完全，成為微生物可以利用的富含單糖的 原料，將反應液調至中性，滅菌；
3) 將可利用菊粉的微生物接入滅菌的以菊芋粉或菊粉為主要碳源的培 養基中，菊芋粉或菊粉質量濃度為2 20%，培養溫度20~60°C ，培養40 300h， 得琥珀酸。
4) 將可利用單糖碳源生產琥珀酸的常用微生物接入滅菌的菊粉酶解液 中，使培養基中糖濃度達到2%~20%，培養溫度為20 6(TC，培養40 300h，
得琥珀酸。
本發明可避免出現工業生物技術產業與人畜爭糧爭地的局面，利用菊 芋、菊苣、人麗花等富含菊粉的植物，特別是那些可在鹽堿、荒涂地生長的菊粉植物，如菊芋，通過將其預處理成菊芋片、菊芋粉、菊粉或這些 原料經進一歩加工，通過稀酸處理或菊粉酶處理，形成可供微生物利用的
發酉孝底物，通過y4"aeraZ)/o5/^W〃w;w 5^cc/w/一rofi wcera，爿"/"o6ac/〃MS swccz7wge腦，Ma朋/ze/m/a swcdm'一ra(i"cera ，co/z'， (Sacc/zara，cM ce v/5/ae， /，&他，乳酸菌等微生物，生物轉化法生產琥珀酸的技術。
自然界中存在一大類富含菊粉的植物，而菊粉不僅可供某些微生物直 接利用，還可以通過水解成果糖、葡萄糖等易于微生物利用的糖。同時， 這一類植物中的菊芋等，還具有能在鹽堿地、荒漠地生長，抗蟲抗病的特 點。因此，利用這一類的菊粉植物對我國發展工業生物技術具有重要意義。
具體實施例方式
實施例1菊芋粉的制作
將菊芋塊莖曬干，經粉碎機粉碎成粉，制成菊芋粉。 實施例2菊粉的制作
將菊芋塊莖洗凈，浸入90。C的5^NaOH溶液中lmin，撈出脫皮洗凈， 將脫皮菊芋塊莖，經4000W微波爐加熱，每加熱2kg需8min，將加熱的菊 芋塊莖放入榨汁機中榨汁，搾出的汁液經板框過濾，再經過陽離子交換樹 脂柱陰、離子交換樹脂柱，形成富含菊粉的澄清液體(pH5.0~8.0)，經濃縮 噴霧干燥，制成菊粉。
實施例3菊粉酶酶解菊粉或菊芋粉
在每升質量濃度為2%的菊芋粉溶液中，加入1000U單位的菊粉酶的比 例配制菊粉或菊芋粉酶解反應液，菊粉酶酶活定義為每分鐘水解底物產生1 微摩爾果糖所需要的酶量，調pH-4.5， 6(TC反應26h，酶反應進行完全， 溶液中葡萄糖質量濃度為0.18%，果糖質量濃度為1.60%,將反應液調至中 性，滅菌；
實施例4菊粉酶酶解菊粉或菊芋粉
在每升質量濃度為2%的菊芋粉溶液中，加入20000U單位的菊粉酶的 比例配制菊粉或菊芋粉酶解反應液，菊粉酶酶活定義為每分鐘水解底物產 生1微摩爾果糖所需要的酶量，調pH-5.0， 55t:反應5h，酶反應進行完全， 溶液中葡萄糖質量濃度為0.08%，果糖質量濃度為1.58%，將反應液調至中 性，滅菌；
實施例5菊粉酶酶解菊粉或菊芋粉
在每升質量濃度為5%的菊芋粉溶液中，加入20000U單位的菊粉酶的 比例配制菊粉或菊芋粉酶解反應液，菊粉酶酶活定義為每分鐘水解底物產 生1微摩爾果糖所需要的酶量，調pH-4.8， 65t:反應8h，酶反應進行完全， 溶液中葡萄糖質量濃度為0.29%，果糖質量濃度為4.38%，將反應液調至中 性，滅菌；
實施例6菊粉酶酶解菊粉或菊芋粉在每升質量濃度為10%的菊芋粉溶液中，加入IOOOOOU單位的菊粉酶
的比例配制菊粉或菊芋粉酶解反應液，菊粉酶酶活定義為每分鐘水解底物
產生1微摩爾果糖所需要的酶量，調pH:5.5， 5(TC反應5h，酶反應進行完 全，溶液中葡萄糖質量濃度為0.24%，果糖質量濃度為9.12%，將反應液調 至中性，滅菌；
實施例7菊粉酶酶解菊粉或菊芋粉
在每升質量濃度為20%的菊芋粉或菊粉溶液中，加入100000U單位的 菊粉酶的比例配制菊粉或菊芋粉酶解反應液，菊粉酶酶活定義為每分鐘水 解底物產生1微摩爾果糖所需要的酶量，調pH二4.0， 6CTC反應llh，酶反 應進行完全，溶液中葡萄糖質量濃度為1.41%，果糖質量濃度為17.06%， 將反應液調至中性，滅菌；
應用例1利用大腸桿菌以菊粉為原料生產琥珀酸
取10ml粗酶液,活力單位380U/ml，加入1L質量濃度15%的菊粉溶液 (pH=4)， 65。C反應30h，經HPLC檢觀U，酶反應進行完全，產物中葡萄糖質 量濃度1.6%，果糖質量濃度13.2%。將反應液調至中性，12rC滅菌20min。
將基因工程改造過的大腸桿菌(保藏號KCTC0506BP)在LB培養 基中3(TC培養14h,離心獲得菌體，接入100mlLB中(500ml錐形瓶》中培 養，培養溫度為3(TC，培養至OD60()吸光度值達到0.6時，接入含1升LB 培養基的5L發酵罐中培養，培養溫度為3(TC，培養液pH控制在6.0 (通 過lMNaOH， 1MHC1調節)，并通無菌空氣攪拌培養，至OD咖值為8.5。
然后，通過發酵罐補料系統，加入滅菌的菊粉酶解液0.5L,使培養基 中糖質量濃度達到5%，同時停止供氧并通入無菌C02,培養溫度為3(TC， 培養80h，得42g琥珀酸。
使用HPLC-UV系統和Hypersil BDS C18反相色譜柱檢測琥珀酸的含 量，使用HPLC-脈沖安培檢測器和陰離子交換柱(HAMILTONRCX-10) 檢測葡萄糖，果糖濃度。
應用例2利用大腸桿菌以菊粉為原料生產琥珀酸
取10ml粗酶液,活力單位5000U/ml,加入0.5L質量濃度10%的菊粉溶 液(pH=6)， 55。C反應5h，經HPLC檢測，酶反應進行完全，產物中葡萄糖 質量濃度1.1%,果糖質量濃度8.4%。將反應液調至中性，12rC滅菌20min。
將基因工程改造過的大腸桿菌(保藏號KCTC0506BP)在LB培養 基中3(TC培養14h,離心獲得菌體，接入100mlLB中(500ml錐形瓶)中培 養，培養溫度為3(TC，培養至OD6(K)吸光度值達到0.8時，接入含1升LB 培養基的5L發酵罐中培養，培養溫度為3(TC，培養液pH控制在6.0 (通 過lMNaOH， 1MHC1調節)，并通無菌空氣攪拌培養，至OD,值為6.8。
然后，通過發酵罐補料系統，加入滅菌的菊粉酶解液2L，使培養基中 糖質量濃度達到10%，同時停止供^并通入無菌CCb，培養溫度為4(TC， 培養60h，得56g琥珀酸。使用HPLC-UV系統和Hypersil BDS C18反相色譜柱檢測琥珀酸的含 量，使用HPLC-脈沖安培檢測器和陰離子交換柱(HAMILTONRCX-10) 檢測葡萄糖，果糖濃度。
應用例3利用大腸桿菌以菊芋粉為原料生產琥珀酸
取10ml粗酶液,活力單位4900U/ml，加入2L質量濃度5%的菊芋粉溶 液(pH=5)， 60'C反應3.5h,經HPLC檢測，酶反應進行完全，產物中葡萄 糖質量濃度0.3%，果糖質量濃度4.6%。將反應液調至中性，12rC滅菌 20min。
將基因工程改造過的大腸桿菌(保藏號KCTC0506BP)在LB培養 基中40。C培養12h，離心獲得菌體，接入100mlLB中(500ml錐形瓶)中培 養，培養溫度為4(TC，培養至OD6。。吸光度值達到0，3時，接入含1升LB 培養基的5L發酵罐中培養，培養溫度為40°C ，培養液pH控制在7.0 (通 過lMNaOH， 1MHC1調節)，并通無菌空氣攪拌培養，至OD,值為IO。
然后，通過發酵罐補料系統，加入滅菌的菊芋粉酶解液1L，使培養基 中糖質量濃度達到6%，同時停止供氧并通入無菌C02,培養溫度為32'C， 培養40h，得36g琥珀酸。
使用HPLC-UV系統和Hypersil BDS C18反相色譜柱檢測琥珀酸的含 量，使用HPLC-脈沖安培檢測器和陰離子交換柱(HAMILTONRCX-10) 檢測葡萄糖，果糖濃度。
應用例3利用大腸桿菌以菊芋粉為原料生產琥珀酸
取10ml粗酶液，活力單位8000U/ml,加入1.5L質量濃度20%的菊芋粉 溶液(pH=4)， 5(TC反應7h,經HPLC檢測，酶反應進行完全，產物中葡萄 糖質量濃度1.2%,果糖質量濃度17.7%。將反應液調至中性，121'C滅菌 20min。
將基因工程改造過的大腸桿菌(保藏號KCTC0506BP)在LB培養 基中40。C培養12h，離心獲得菌體，接入100mlLB中(500ml錐形瓶)中培 養，培養溫度為40°C，培養至OD,吸光度值達到0.53時，接入含1升LB 培養基的5L發酵罐中培養，培養溫度為40°C ，培養液pH控制在6.5 (通 過lMNaOH， 1MHC1調節)，并通無菌空氣攪拌培養，至OD鋼值為12.5。
然后，通過發酵罐補料系統，加入滅菌的菊芋粉酶解液1.5L，使培養 基中糖質量濃度達到8%，同時停止供氧并通入無菌C02,培養溫度為36°C， 培養50h，得38g琥珀酸。
使用HPLC-UV系統和Hypersil BDS C18反相色譜柱檢測琥珀酸的含 量，使用HPLC-脈沖安培檢測器和陰離子交換柱(HAMILTONRCX-10) 檢測葡萄糖，果糖濃度。
權利要求
1. 一種生物轉化生產琥珀酸的方法，其特征在于以菊粉植物為原料，將菊粉植物富含菊粉的器官預處理后經滅菌接入微生物，進行生物轉化反應，生產琥珀酸。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于菊粉是指一系列果糖多 聚物，末端帶有一個葡萄糖殘基；所述菊粉植物是指菊芋、菊苣和/或大麗 花富含菊粉的植物；所述富含菊粉的器官是指菊粉植物的塊根或塊莖。
3. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述預處理是指將菊粉 植物富含菊粉的器官其通過物理，化學或生物的方法加工成片、粉、菊粉 便于后續加工的原料，或進一步將上述原料通過化學法或生物法將其降解成為微生物可以利 用的富含糖的原料。
4. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述微生物是指一類可利用單糖、寡糖或多糖碳源生產琥珀酸的常用微生物。
5. 根據權利要求4所述的方法，其特征在于所述微生物是指野生型 微生物J"aera6/o，W〃wm swcc/M/一ra血cms， swcc/"ogewas或 Maw"/ze/m/a wcc/ra'c^radwcem，歳通過遺傳工程與基因工程改造^微生物 ￡.co//， &cc/7ara，ces cerev/c/"e， yic"'wo6ac/〃ws swcc/"ogewas， Maww/ze/m/a swcc/"/一;-oc/wcms1， 爿Maera6/o，W〃ww si/cc/w'"^ ra^cem1， 々附owowas 附o&to或乳酸菌菌株。
6. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于具體過程可為，1) 將菊粉植物的塊莖按常規方法加工成菊芋粉和/或菊粉后，制成質量濃度2~20%的溶液。2) 在每升質量濃度為2~20%的菊芋粉或菊粉溶液中，加入 1000U-100000U單位的菊粉酶的比例配制菊粉或菊芋粉酶解反應液，菊粉 酶酶活定義為每分鐘水解底物產生1微摩爾果糖所需要的酶量，調pt^4 6， 50 65"C反應2 60h，酶反應進行完全，成為微生物可以利用的富含單糖的 原料，將反應液調至中性，滅菌；3) 將可利用菊粉的微生物接入滅菌的以菊芋粉或菊粉為主要碳源的培 養基中，菊芋粉或菊粉質量濃度為2 20%，培養溫度20~60°C ，培養40 300h, 得琥珀酸。4) 將可利用單糖碳源生產琥珀酸的常用微生物接入滅菌的菊粉酶解液 中，使培養基中糖濃度達到2% 20%，培養溫度為20 60°C，培養40 300h，得琥珀酸。
全文摘要
本發明涉及微生物法生產琥珀酸，一種生物轉化生產琥珀酸的方法，以菊粉植物為原料，將菊粉植物富含菊粉的器官預處理后經滅菌接入微生物，進行生物轉化反應，生產琥珀酸。其生產成本低，原料來源廣泛，工藝簡單，技術路線成熟，可產業化實施。
文檔編號C12R1/225GK101245358SQ20071001044
公開日2008年8月20日 申請日期2007年2月15日 優先權日2007年2月15日
發明者曲天明, 曹海龍, 李曙光, 杜昱光 申請人:中國科學院大連化學物理研究所