專利名稱：一種以玉米秸稈為原料制備微生物油脂的方法
技術領域：
本發明是關于微生物油脂的制備方法，更具體地講，是關于以玉米秸 稈為原料制備微生物油脂的方法。玉米秸稈經粉碎和常規水解，獲得水解
液，經濃縮，使總還原糖濃度在20 g/L以上。按體積比為5-20%將產油微 生物種子液接種到秸稈水解液中，通氣培養至發酵液中總還原糖濃度降至1 %以下時停止，離心收集菌體，經常規的有機溶劑提取獲得微生物油脂。 本發明技術生產油脂幾乎不依賴油料植物種植，且原材料資源豐富、可連 續生產。
背景技術：
長鏈脂肪酸甘油酯(油脂)是重要的食用品和化工原料。近年來，油 脂還廣泛應用于生產可再生能源產品生物柴油。因此，油脂資源的需求量 日益顯著增加。通常油脂來源于油料植物的種子和果實以及動物脂肪組織， 其中油料植物是提取油脂的主要原料。種植油料植物和油料作物需要占用 耕地，生產受到季節和自然條件的制約，不利于油脂原料穩定和連續供應。
許多微生物，如酵母、霉菌和藻類等在一定條件下，可以碳水化合物、 碳氫化合物等為碳源，在體內合成并貯存大量脂肪酸甘油酯，這種油脂稱 為微生物油脂。據報道，部分微生物能在菌體內積累含量超過細胞干重60 %以上的油脂，微生物油脂和一般植物油具有相似的脂肪酸組成，仍以Cw
和ds系脂肪酸為主。因此，微生物油脂是潛在的動植物油脂替代資源。
微生物發酵底物范圍較廣，包括可直接利用的葡萄糖、果糖、蔗糖、 糖蜜等，以及需要經過預處理的淀粉、纖維素等。當前微生物油脂的研究 主要是以淀粉質原料為發酵底物，利用產油霉菌生產富含多不飽和脂肪酸 的油脂。利用廉價碳源，如木質纖維素水解產物，直接發酵生產微生物油 脂的方法尚未見公開報道。
玉米秸稈資源高值化利用技術前景廣闊，常見的有秸稈直接發酵生產 沼氣，秸稈水解液發酵生產燃料乙醇、乳酸等。以秸稈為原料，經高溫、
高壓處理，獲取"生物油(Bio-oil)"也有文獻報道，但"生物油"含有 醇、醛、酸、醚和水份等，組成非常復雜，性質不穩定，難以直接應用。
本發明涉及以廉價的玉米秸稈水解液為原料，利用產油微生物發酵制 備微生物油脂，可為生物柴油及油脂化工產業提供新的油脂來源，這對于 保障我國生物質能源產業和油脂化工行業健康發展都具有重要的意義。

發明內容
本發明提供一種以玉米秸稈為原料制備微生物油脂的方法。利用廉價
的玉米秸稈木質纖維素為原料，經水解得到水溶性碳水化合物，經產油微 生物轉化獲取油脂，將顯著降低微生物油脂生產成本，形成節約耕地、可 連續生產的油脂獲取路線，并且還有利于環境保護和社會經濟可持續發展。
為實現上述目的，本發明采用的技術方案為
一種以玉米秸稈為原料制備微生物油脂的方法，按常規方法將玉米秸 稈進行水解處理，獲得水解液，將產油微生物種子液接種到秸稈水解液中， 通氣培養至發酵液中總還原糖濃度降至1%以下時停止，離心收集菌體，經 常規的有機溶劑提取方法獲得微生物油脂。
具體為
(1) 以玉米秸稈為原料，粉碎至20-100目，水解得到水解液，并濃縮 到總還原糖濃度在20-100 g/L，獲得玉米秸稈水解液；
所述玉米秸稈的水解過程為將玉米秸稈粉碎至20-100目，采用無機 酸水溶液或纖維素酶對玉米秸稈原料進行水解處理，獲得水解液。
(2) 玉米秸稈水解液添加0-0. 4 g/L磷酸二氫鉀和0-1.5 g/L七水硫酸 鎂，調節pH至5.0-6.0，經滅菌后用作發酵培養基；
(3) 按體積比為5-20%于發酵培養基中接入產油微生物種子液，于25-37 。C通氣培養52-120小時，離心收集含油菌體；含油干菌體對玉米秸稈原料 得率16%-28% (w/w)，干菌體含油率15%-66% (w/w)。
所述有機溶劑提取方法為將發酵液離心，收集菌體并洗滌；按每克 干菌體加入2-4 mol/L鹽酸5-10mL，于78 ℃水浴處理0. 5-1小時，冷卻 后加入甲醇和氯仿萃取，收集氯仿層，用O. 1%的氯化鈉水溶液洗滌，以無 水硫酸鈉干燥，過濾，濾液經濃縮除去低沸點有機溶劑，并在105 ℃干燥 得到微生物油脂。
(4) 所述產油微生物包括紅冬孢酵母<sequence>see original document page 4</sequence>、斯 達氏油月旨酵母<sequence>see original document page 4</sequence>、粘紅酵母<sequence>see original document page 4</sequence>、 亞羅解脂酵母<sequence>see original document page 4</sequence>、皮狀絲孢酵母<sequence>see original document page 4</sequence>歷、深黃被抱毒<sequence>see original document page 4</sequence>或少根根毒<sequence>see original document page 4</sequence>
本發明具有如下優點
1、 原料成本低。玉米秸稈是農業生產副產物，據統計我國年產量達億 噸，目前尚未得到充分利用，部分地區還造成了環境污染。玉米秸稈易于 收集，加工粉碎和水解相對容易，水解液主要是纖維素和半纖維素降解的 糖及其它副產物，可用于培養產油微生物。本發明提供了一種由廉價原料 制備微生物油脂的方法，拓展了制備微生物油脂的原料來源，可降低微生 物油脂制備成本。
2、 產油微生物將油脂儲存在細胞內，易于進行產物的分離和提取。本 發明中每100 g玉米秸稈可獲得含油率為15%-66% (w/w)的含油微生物 干菌體16-28 g，經提取可獲得微生物油脂2. 4-18. 5 g。
3、本發明可用于大量獲取油脂，具有不額外占用耕地、可連續生產、 不受場地、季節和氣候等變化的影響，是對傳統植物油脂生產技術的重要 補充，而且有利于資源綜合利用和環境保護，可獲得顯著的綜合效益。
綜上所述，本發明原料成本低、工藝簡便、方法易行，是一種利用可 再生資源、幾乎不額外占用耕地、可連續生產的微生物油脂制備新途徑， 為微生物油脂的制備提供了一種新的原料來源。
具體實施例方式
首先參考文獻方法(中國資源綜合利用，2003， (11)， 9-11;華南理工 大學學報，1997， 25 (8)， 10-15;中國資源綜合利用，2004， (8)， 25-27) 制備玉米秸稈水解液。將玉米秸稈粉碎至20-100目，采用硫酸和磷酸等無 機酸水溶液或纖維素酶對玉米秸稈原料進行水解處理，獲得水解液，經濃 縮至總還原糖濃度在20 g/L以上，添加0-0.4 g/L磷酸二氫鉀和0-l. 5 g/L 七水硫酸鎂，調節pH至5.0-6.0，高溫滅菌，以5-20% (v/v)的接種量接入 產油微生物種子液(活菌數2X 106-3X 106個/毫升)，于25-37 。C通氣培養 52-120小時，離心收集含油菌體，經常規的有機溶劑提取方法獲得微生物 油脂。利用該技術含油干菌體對玉米秸稈原料得率16%-28% (w/w)，菌體 含油率15%-66% (w/w)。
本發明使用的產油微生物包括紅冬孢酵母Rhodosporidium toruloides、斯達氏油月旨酵母Lipomyces starkeyi,粘紅酵母Rhodotorula glutinis、亞羅解脂酵母Yarrowia lipolytica、皮狀絲孢酵母Trichosporon ctaneum、深黃被孢毒Mortierella isabellina或少根根霉Rhizopus arrhizus。產油微生物在液體種子培養基(葡萄糖20 g/L， 酵母粉10 g/L，蛋白胨10 g/L，余量為水，pH 5.8 6.0)中，于30℃， 180-200轉/分鐘振蕩培養24小時，制得發酵種子液。
本發明使用常規的有機溶劑提取方法獲得微生物油脂，具體是按每克 干菌體加入2-4 mol/L鹽酸5-10mL，于78℃水浴處理0. 5-1小時，冷卻 后加入有機溶劑提取，濃縮除去低沸點有機溶劑，于105℃干燥得到微生 物油脂。
本發明產油微生物干菌體是指經離心分離和洗滌得到的菌體，并在105 'C干燥至恒重。菌體油脂含量是通過有機溶劑提取方法提取的油脂質量除 以提取時所使用產油微生物干菌體的質量而得到。
實施例l
1)玉米秸稈水解液制備參考文獻方法(中國資源綜合利用，2003， (11)， 9-11)制備玉米秸稈酸水解液。將玉米秸稈粉碎至40目，稱取50 克，采用稀硫酸水溶液進行水解處理，獲得水解液，經濃縮至總還原糖濃 度為21 g/L，添加0. 4 g/L磷酸二氫鉀和1. 5 g/L七水硫酸鎂，用1 mol/L 氫氧化鈉調節pH至5.0，于121 t:滅菌15分鐘；
2 )油脂發酵以10 %(v/v)接種量接入產油紅冬孢酵母Rhodosporidium toruloides AS 2.1389 (購自中國普通微生物菌種保藏管 理中心)種子液(活菌數2X106個/毫升)，于30 ('C通氣培養60小時，停 止發酵；將發酵液于6000轉/分鐘離心10分鐘，收集菌體、洗滌，并在105 X:干燥至恒重，得到干菌體8.0 g/L;
3)微生物油脂提取按每克干菌體加入2. 0 mol/L鹽酸10mL，于78 。C水浴處理l小時，冷卻后加入甲醇和氯仿萃取，收集氯仿層，用0. 1%的 氯化鈉水溶液洗滌，以無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液經濃縮除去低沸點有 機溶劑，并在105 。C干燥得到微生物油脂，菌體油脂含量15%。
1) 玉米秸稈水解液制備參考文獻方法(中國資源綜合利用，2003， (11)， 9-11)制備玉米秸稈酸水解液。將玉米秸稈粉碎至100目，稱取50
克，采用稀硫酸水溶液進行水解處理，獲得水解液，經濃縮至總還原糖濃 度為24 g/L，添加1. 5 g/L七水硫酸鎂，用1 mol/L氫氧化鈉調節pH至 5.8，于121 。C滅菌15分鐘；
2) 油脂發酵以10% (v/v)接種量接入產油紅冬孢酵母 Rhodosporidium toruloides AS 2.1389的種子液(活菌數3乂106個/毫 升)，于25"C通氣培養52小時，停止發酵，將發酵液于6000轉/分鐘離心 10分鐘，收集菌體，在105 。C干燥至恒重，得到干菌體5.6 g/L;
3) 微生物油脂提取按每克干菌體加入4. 0 mol/L鹽酸5mL，于78 。C 水浴處理0.5小時，冷卻后加入甲醇和氯仿萃取，收集氯仿層，用0. 1%的 氯化鈉水溶液洗滌，以無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液經濃縮除去低沸點有 機溶劑，并在105 t:干燥得到微生物油脂，菌體油脂含量62%。
實施例3
1) 玉米秸稈水解液制備參考文獻方法(華南理工大學學報，1997， 25 (8)， 10-15)制備玉米秸稈酸水解液。將玉米秸稈粉碎至40目，稱取 50克，采用濃硫酸進行水解處理，獲得水解液，經濃縮至總還原糖濃度為 30 g/L，添加0. 2 g/L磷酸二氫鉀和1. 0 g/L七水硫酸鎂，用1 mol/L氫 氧化鈉調節pH至5.5，于121 'C滅菌15分鐘；
2) 油脂發酵以10% (v/v)接種量接入產油紅冬孢酵母Rhodosporidium toruloides AS 2.1389種子液(活菌數2. 5Xl(f個/毫 升)，于37。C通氣培養84小時，停止發酵，將發酵液于6000轉/分鐘離心 10分鐘，收集菌體，在105 。C干燥至恒重，得到干菌體12.0 g/L;
3) 微生物油脂提取按每克干菌體加入3.0mol/L鹽酸5mL，于78 。C 水浴處理l小時，冷卻后加入甲醇和氯仿萃取，收集氯仿層，用0. 1%的氯 化鈉水溶液洗滌，以無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液經濃縮除去低沸點有機 溶劑，并在105 。C干燥得到微生物油脂，菌體油脂含量30%。
實施例4
1)玉米秸稈水解液制備參考文獻方法(中國資源綜合利用，2003，
(11)， 9-11)制備玉米秸稈酸水解液。將玉米秸稈粉碎至40目，稱取50 克，采用稀硫酸水溶液進行水解處理，獲得水解液，經濃縮至總還原糖濃 度為45 g/L，添加0. 4 g/L磷酸二氫鉀和1. 5 g/L七水硫酸鎂，用1 mol/L 氫氧化鈉調節pH至5.8，于121 ℃滅菌15分鐘；
2 )油脂發酵以10 % (v/v)接種量接入產油紅冬孢酵母 Rhodosporidium toruloides AS 2.1389種子液(活菌數3. 0X10 to the power of 6 個/毫升)，于30℃通氣培養90小時，停止發酵，將發酵液于6000轉/分鐘離心 10分鐘，收集菌體，在105 ℃干燥至恒重，得到干菌體9.4 g/L;
3)微生物油脂提取按實施例3步驟3)操作，菌體油脂含量66%。
實施例5
1) 玉米秸稈水解液制備參考文獻方法(中國資源綜合利用，2004， (8)， 25-27)制備玉米秸稈酶水解液。將玉米秸稈粉碎至20目，稱取50
克，采用纖維素酶進行水解處理，獲得水解液，經濃縮至總還原糖濃度為 55 g/L，添加0. 4 g/L磷酸二氫鉀和1. 5 g/L七水硫酸鎂，用1 mol/L氫 氧化鈉調節pH至6.0，于121 ℃滅菌15分鐘；
2) 油脂發酵以10% (v/v)接種量接入產油紅冬孢酵母 Rhodosporidium toruloides AS 2.1389種子液(活菌數3. 0X10 to the power of 6 個/毫升)，于30℃通氣培養96小時，停止發酵，將發酵液于6000轉/分鐘離心 10分鐘，收集菌體，在105 。C干燥至恒重，得到干菌體14.0 g/L;
3) 微生物油脂提取按實施例3步驟3)操作，菌體油脂含量63%。
實施例6
與實施例1不同之處在于，步驟1)中玉米秸稈水解液的總還原糖濃度 為100 g/L;步驟2)中使用產油斯達氏油脂酵母Lipomyces starkeyi AS 2.1560(購自中國普通微生物菌種保藏管理中心)，接種量為20% (v/v) (活菌數4.0X106個/毫升)，培養時間為120小時。實施結果得到干菌體 21.0 g/L，菌體油脂含量23%。
實施例7
與實施例1不同之處在于，歩驟1)中玉米秸稈水解液的總還原糖濃度 為48 g/L;步驟2)中使用產油斯達氏油脂酵母Lipomyces starkeyi AS 2.1560(購自中國普通微生物菌種保藏管理中心)，接種量為10% (v/v) (活菌數3. 0X 106個/毫升)，培養時間為96小時。實施結果得到干菌體8. 0 g/L，菌體油脂含量15%。
實施例8
與實施例4不同之處在于，步驟1)中玉米秸稈水解液的總還原糖濃度 為27 g/L;步驟2)中使用產油粘紅酵母Rhodotorula glutinis AS 2. 499 (購自中國普通微生物菌種保藏管理中心)，培養時間為86小時。實施結 果得到干菌體ll.O g/L，菌體油脂含量32%。
實施例9
與實施例1不同之處在于，步驟2)中使用產油微生物亞羅解脂酵母
Yarrowia LipolyticaAS2. 1398(購自中國普通微生物菌種保藏管理中心)。 實施結果得到干菌體8.5 g/L，菌體油脂含量27%。
實施例10
與實施例1不同之處在于，步驟2)中使用產油微生物皮狀絲孢酵母 Trichosporon cutaneumAS 2.571 (購自中國普通微生物菌種保藏管理中 心)。實施結果得到千菌體7. 1 g/L，菌體油脂含量55%。
實施例11
與實施例1不同之處在于，歩驟2)中使用產油微生物深黃被孢霉 Moriterella isabellina AS 3.3410 (購自中國普通微生物菌種保藏管理
中心)，接種量為5% (v/v)(活菌數3.0X106個/毫升)。實施結果得到 干菌體6.8 g/L，菌體油脂含量33%。
實施例12
與實施例1不同之處在于，步驟2)中使用產油微生物少根根霉 Rhizopus arrhizus AS 3. 2896 (購自中國普通微生物菌種保藏管理中心)， 接種量為5% (v/v)(活菌數3. 0X 106個/毫升)。實施結果得到干菌體7. 7 g/L，菌體油脂含量25%。
權利要求
1、一種以玉米秸稈為原料制備微生物油脂的方法，其特征在于首先按常規方法將玉米秸稈進行水解處理，將其中的木質纖維素水解成水溶性碳水化合物，獲得水解液，將產油微生物種子液接種到秸稈水解液中，通氣培養至發酵液中總還原糖濃度降至1％以下時停止，離心收集菌體，經常規的有機溶劑提取方法獲得微生物油脂。
2、 按照權利要求1所述微生物油脂的制備方法，其特征在于(1) 以玉米秸稈為原料，粉碎至20-100目，水解得到水解液，并濃縮到總還原糖濃度在20-100 g/L;(2) 玉米秸稈水解液添加0-0. 4 g/L磷酸二氫鉀和0-1.5 g/L七水硫酸鎂，經滅菌后用作發酵培養基；(3) 按體積比為5-20%于發酵培養基中接入產油微生物種子液，于25-37 。C通氣培養52-120小時，離心收集含油菌體，經常規的有機溶劑提取方法 獲得微生物油脂。
3、 按照權利要求1所述微生物油脂的制備方法，其特征還在于所述產油微生物包括紅冬孢酵母7 力OGb邵OrjVj'W/Z7 ^2T^"Gfes、斯達氏油脂酵母"p。，es sz^rMr六粘紅酵母做ot/。toJY;7s -"/^、亞羅解脂酵母 i"krjwia h'/ 。""ca、皮狀絲孢酵母Wc力。s/ or。/7 c〃te/ e證、深黃被孢 毒yJ/artiereWs is"aZ eJh'/ a或少根根毒^/P力j'zopiAS a^rr/ J'zws。
全文摘要
本發明涉及一種以玉米秸稈為原料制備微生物油脂的方法，將玉米秸稈水解，水解液濃縮至總還原糖濃度在20g/L以上，在其中添加0-0.4g/L磷酸二氫鉀和0-1.5g/L七水硫酸鎂，滅菌后按體積比為5-20％接入產油微生物種子液，通氣培養52-120小時，至發酵液中總還原糖濃度降至1％以下時停止，離心收集菌體，經常規的有機溶劑提取方法獲得微生物油脂。每100g玉米秸稈可獲得含油率為15％-66％的含油微生物干菌體16-28g，經提取可獲得微生物油脂2.4-18.5g。本發明原料廉價、工藝簡便、方法易行，是一種利用可再生資源、幾乎不額外占用耕地、可連續生產的微生物油脂制備新途徑。
文檔編號C12R1/645GK101343644SQ20071001210
公開日2009年1月14日 申請日期2007年7月13日 優先權日2007年7月13日
發明者波 劉, 華艷艷, 趙宗保 申請人:中國科學院大連化學物理研究所