專利名稱：一種使用菊粉為原料發酵生產微生物油脂的方法
技術領域：
本發明涉及到微生物發酵生產生物油脂的技術，具體的說是一種使用菊粉為原料發酵生產微生物油脂的方法。
背景技術：
化石燃料是當前人類使用的主要能源，但其日益消耗殆盡，同時造成了嚴重的溫室效應和環境污染問題。開發可再生、環保的替代燃料已成為經濟可持續發展最重要課題之一，利用生物質資源生產燃料技術應運而生。生物柴油，是指以油料作物、野生油料植物和工程微藻等水生植物油脂，以及動物油脂、廢餐飲油等為原料油通過酯交換工藝制成的甲酯或乙酯燃料。生物柴油具有良好的環境特性和可生物降解性，被公認為化石燃料的綠色替代品。微生物油脂發酵技術是生物柴油生產的一個重要發展方向。微生物油脂的脂肪酸組成與植物油相近，以C16和C18系脂肪酸為主。微生物發酵產油具有發酵周期短，可連續生產等優點；而且產油微生物菌種資源豐富，能利用和轉化各種農林廢棄木質纖維素原料，對中國這樣一個農業占較大比重的國家具有特殊意義，因此，利用微生物轉化法生產油脂具有非常大的發展潛力。目前我國生物柴油的生產主要以菜籽油、大豆和餐飲廢油為主。以植物油為原料生產生物柴油，原料成本偏高，經濟可行性差，且我國是油脂資源短缺國家，近年來植物油進口量逐年增加，同時，我國耕地資源匱乏，糧食供應形勢不容樂觀，擴大油料作物種植的潛力非常有限，而地溝油資源的總量有限，原料組成及性能變化大，這將影響生物柴油原料的供應，不能滿足我國生產生活的大量需求。微生物油脂具有不受季節的影響、發酵周期較短，易分離提純、可連續生產、不占用耕地，也不會對環境造成污染的優點，而菊芋作為生物柴油生產的原料也具有其獨特的優勢一是菊芋產量高，其塊莖干物質畝產可達1. 2噸，莖葉干重1. 3噸以上，超過玉米和小麥的生物量單產水平；二是菊芋塊莖的菊粉含量很高，可占濕重的20%左右、干重的80%左右；三是菊粉是多聚果糖，易于轉化為可發酵的果糖；四是菊芋適應性強，耐貧瘠，耐寒，耐旱；特別適合在沙漠、灘涂、鹽堿荒地等非農業耕地種植。因此，發展菊芋生物柴油，即可以不與糧征地，又符合我國生物柴油發展的產業政策。

發明內容
為解決菊芋塊莖的價值開發不完全和能源緊缺問題，本發明提供了一種使用菊粉為原料發酵生產微生物油脂的方法。本發明為解決上述技術問題采用的技術方案為一種使用菊粉為原料發酵生產微生物油脂的方法，包含以下步驟
1)菊粉原料的水解
按重量比，取7份純度為90%的菊粉溶解到93份的蒸餾水中，加入過濾除菌的菊粉酶，加酶量為每克菊粉加入60 100U菊粉酶，在60°C條件下恒溫水解8 12 h，獲得菊粉水解液，備用；
2)油脂微生物的發酵培養
①種子液的培養在無菌條件下從活化后的新鮮的皮狀絲孢酵母菌斜面上挑取兩環菌種接種到已滅菌的豆芽汁種子液培養基中，在30°C恒溫、搖瓶轉速150r/min的條件下，搖瓶培養時間72h，得到發酵種子液，備用；
所述的豆芽汁培養基，其制作方法為稱新鮮豆芽100g，放入燒杯中，加水IOOOmL,煮沸30min，用紗布過濾除去豆芽，用蒸餾水將剩余液體補充至IOOOmL,再加入蔗糖50g，加熱溶化即可制得，所述的豆芽汁培養基在使用前需在121°C條件下滅菌20min ；
②發酵培養在步驟1)制得的菊粉水解液中，按每升菊粉水解液加入酵母膏5g、蛋白胨2g、磷酸二氫鉀1. Og和MgSO4 · 7H20 0. 5g的比例將上述添加物作為氮源和無機鹽加入到菊粉水解液中，攪拌溶解，再用濃度為0. 2mol/L的氫氧化鈉溶液調節pH值為5. 5，制得菊粉水解液發酵培養基，菊粉水解液發酵培養基在115°C條件下滅菌30min，備用；
在滅菌后的菊粉水解液發酵培養基中接入步驟①中得到的發酵種子液，接入的發酵種子液的體積為菊粉水解液加入上述氮源及無機鹽后總體積的10%，在恒溫搖床培養箱中進行培養，培養溫度為30°C，搖床轉速為180r/min，發酵72h，發酵結束后在4500r/min的轉速下離心IOmin獲得微生物油脂菌體，備用； 3)微生物油脂的提取
將步驟②中得到的油脂微生物菌體干燥，再用有機溶劑氯仿-甲醇法，對干燥的油脂微生物菌體細胞內的油脂進行提取，具體操作為按每克菌體加入濃度為4mol/L鹽酸IOmL 的比例加入鹽酸，振蕩混勻，25°C恒溫條件下放置30 60min，然后在100°C的沸水浴中加熱3min，立即置于-20°C環境中冷凍30min ；取出后，在其中加入2倍體積的氯仿-甲醇提取液，充分振蕩2min，再按照每克菌體加入ImL氯仿的比例加入氯仿，振蕩混勻，再按照每克菌體加入1.5mL蒸餾水的比例加入蒸餾水，振蕩混勻后在4000r/min的離心速度下離心15 25min，分離出的氯仿層中加入等體積的質量濃度為0. 1%的NaCl溶液，在4000 5000r/min的離心速度下離心15 25min，收集氯仿層，于25°C靜止36h，揮發法除去氯仿， 得到微生物油脂。本發明中所述的氯仿-甲醇提取液中氯仿和甲醇的體積比為1:2，所述的pH自然是指配制完成后不需用酸或堿來調節其PH值。本發明中，所述的菊粉為市售的菊粉，購自于北京威德生物技術有限公司；菊粉酶為常規的水解酶，可由產菊粉酶的微生物發酵制得；皮狀絲孢酵母菌購于廣東省微生物菌種保藏中心。經檢測，本發明所得微生物油脂的組成及相對含量如下表所示，從表中可以看出， 微生物油脂的組成成分為16碳系和18碳系脂肪酸，其中棕櫚酸、油酸、亞油酸、棕櫚油酸的含量較多，其組成與含量與植物油類相似，可作為油脂資源用于生物柴油的制備。
權利要求
1. 一種使用菊粉為原料發酵生產微生物油脂的方法，其特征在于，包含以下步驟1)菊粉原料的水解按重量比，取7份純度為90%的菊粉溶解到93份的蒸餾水中，加入過濾除菌的菊粉酶， 加酶量為每克菊粉加入60 100U菊粉酶，在60°C條件下恒溫水解8 12 h，獲得菊粉水解液，備用；2)油脂微生物的發酵培養①種子液的培養在無菌條件下從活化后的新鮮的皮狀絲孢酵母菌斜面上挑取兩環菌種接種到已滅菌的豆芽汁種子液培養基中，在30°C恒溫、搖瓶轉速150r/min的條件下，搖瓶培養時間72h，得到發酵種子液，備用；所述的豆芽汁培養基，其制作方法為稱新鮮豆芽100g，放入燒杯中，加水IOOOmL,煮沸30min，用紗布過濾除去豆芽，用蒸餾水將剩余液體補充至IOOOmL,再加入蔗糖50g，加熱溶化即可制得，所述的豆芽汁培養基在使用前在121°C條件下滅菌20min ；②發酵培養在步驟1)制得的菊粉水解液中，按每升菊粉水解液加入酵母膏5g、蛋白胨2g、磷酸二氫鉀1. Og和MgSO4 · 7H20 0. 5g的比例將上述添加物作為氮源和無機鹽加入到菊粉水解液中，攪拌溶解，再用濃度為0. 2mol/L的氫氧化鈉溶液調節pH值為5. 5，制得菊粉水解液發酵培養基，菊粉水解液發酵培養基在115°C條件下滅菌30min，備用；在滅菌后的菊粉水解液發酵培養基中接入步驟①中得到的發酵種子液，接入的發酵種子液的體積為菊粉水解液加入上述氮源及無機鹽后總體積的10%，在恒溫搖床培養箱中進行培養，培養溫度為30°C，搖床轉速為180r/min，發酵72h，發酵結束后在4500r/min的轉速下離心IOmin獲得微生物油脂菌體，備用；3)微生物油脂的提取將步驟②中得到的油脂微生物菌體干燥，再用有機溶劑氯仿-甲醇法，對干燥的油脂微生物菌體細胞內的油脂進行提取，具體操作為按每克菌體加入濃度為4mol/L鹽酸IOmL 的比例加入鹽酸，振蕩混勻，25°C恒溫條件下放置30 60min，然后在100°C的沸水浴中加熱3min，立即置于-20°C環境中冷凍30min ；取出后，在其中加入2倍體積的氯仿-甲醇提取液，充分振蕩2min，再按照每克菌體加入ImL氯仿的比例加入氯仿，振蕩混勻，再按照每克菌體加入1. 5mL蒸餾水的比例加入蒸餾水，振蕩混勻后在4000r/min的離心速度下離心15 25min，分離出的氯仿層中加入等體積的質量濃度為0. 1%的NaCl溶液，在4000 5000r/min的離心速度下離心15 25min，收集氯仿層，于25°C靜止36h，揮發法除去氯仿， 得到微生物油脂；所述的氯仿-甲醇提取液中氯仿和甲醇的體積比為1:2。
全文摘要
一種使用菊粉為原料發酵生產微生物油脂的方法，菊粉原料經菊粉酶水解后制得菊粉水解液，再加入酵母膏、蛋白胨、磷酸二氫鉀和MgSO4·7H2O制得菊粉水解液發酵培養基，在其中接種皮狀絲孢酵母菌種子液發酵培養，培養結束后離心獲得微生物油脂菌體，將油脂微生物菌體干燥，再用有機溶劑氯仿-甲醇法，對干燥的油脂微生物菌體細胞內的油脂進行提取，得到微生物油脂。本發明提供了一種利用菊粉生產微生物油脂的方法，極大地擴展了生物柴油的油脂原料來源，并顯著降低了生物柴油原料油脂的成本，同時也解決了現有技術中菊芋塊莖價值利用不充分的問題。
文檔編號C12R1/645GK102417915SQ201110403350
公開日2012年4月18日 申請日期2011年12月7日 優先權日2011年12月7日
發明者張紅梅, 汪倫記, 糾敏, 賈閃閃, 邱智軍 申請人:河南科技大學