專利名稱：一種雙色熒光定量共擴增聚合酶鏈反應檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種雙色熒光定量共擴增聚合酶鏈反應檢測試劑盒，具體是涉及一種21 號染色體倍性檢測的雙色熒光定量聚合酶鏈反應體外共擴增PCR試劑盒，屬于分子生物學 檢測診斷領域。
技術背景唐氏綜合征(Down Syndrome, DS)，又稱為先天愚型，是活產胎兒中最常見的染色體 異常綜合征之一，其發病率約為1/600—1/800。 DS的體征非常多樣，通常涉及多種組織 器官的異常，但其最突出、最嚴重的臨床表現為精神發育遲滯。該病的主要臨床特征為 嚴重智力低下，且智力低下的表型隨年齡增長逐漸明顯，動作發育和性發育遲緩，基本 無生活自理能力。具有獨特的面部和身體畸形、先天性心臟病、消化道畸形等，白血病 的發病率也比人群平均發病率高10—30倍。患者的平均壽命在30歲左右。DS絕大多數都是偶發的，每個孕婦都有生患兒的可能，發病無明顯的種族差異和家族 聚積現象。世界各地大量群體調查的結果表明種族之間發病率幾乎相同，唐氏綜合征的每 個體細胞中21號染色體為3條，而其它常染色體為2條，淋巴母細胞或羊水脫落細胞體 外培養和染色體制備觀察是其實驗室檢測的常規方法，該方法雖然準確度高，但技'術復雜 耗時長，不能實現自動化和高通量檢測。由于唐氏綜合征患者21號染色體上的單拷貝基 因劑量是其它常染色體上的單拷貝基因劑量的1.5倍，而DSCR是唐氏綜合征發病的關鍵 單拷貝區段，因此可以選擇21號染色體上的單拷貝基因如DSCR1和常染色體上的單拷貝 基因如GAPDH基因，通過熒光定量PCR技術來檢測出它們的相對拷貝數的比值來判斷21 號染色體的倍性，從而能從微量DNA標本中檢測出唐氏綜合征。實時熒光定量PCR技術是近年來發展起來的能夠對特異DNA (基因)拷貝數進行精確 定量的最先進的基因劑量定量新技術。其基本原理是在PCR反應體系中同時加入TaqMan 探針(特異寡核苷酸探針)，該探針的5 '端標記了一條熒光報告基團(R)， 3'端標記了一
條熒光淬滅基團(Q)。當這條探針處于完整狀態或者沒有反應時，R所產生的一部分熒光 將被Q吸收或淬滅。在PCR反應過程中，該探針可與PCR目標基因特異性雜交，然后被Taq DNA聚合酶的5'外切活性降解，使R和Q分離，游離的R發出熒光信號被檢測。隨著PCR 反應的進行，游離的R與PCR產物相對應的增加。因此，根據每個循環后R產生的熒光信 號的強度，即可實時測量出PCR反應產物的數量。如果同時使用拷貝數已知的DNA標準品 做標準曲線，即可對所檢測的標本的耙DNA做精確定量。 發明內容本發明目的在于建立一種操作簡便，能夠快速準確檢測唐氏綜合征患者的雙色熒光定 量共擴增聚合酶鏈反應試劑盒。本發明的技術方案是該種雙色熒光定量共擴增聚合酶鏈反應試劑盒，含有擴增21 號染色體特異單拷貝區段DSCR和16號染色體特異單拷貝區段GAPDH體外擴增的熒光定量 PCR試劑，其特征在于，首先根據21號染色體特異DSCR區段序列和16號染色體上的GAPDH 基因序列分別合成其特異引物和雙色Taqroan熒光探針，然后將0.1-0. 5咖ol/L DSCR和 GAPDH特異的引物、雙色熒光Taqman探針加入同一個PCR擴增緩沖反應體系中，在多色實 時熒光定量PCR儀上進行96。C預變性2 min后，再94。C變性10 sec， 52—56。C復性30 sec，60-7(TC延伸40sec，共45個循環，并在延伸時檢測熒光強度，使兩對引物分別同時 引導新鏈合成，實現兩對引物的共擴增和其拷貝數的定量檢測。上述DSCR和GAPDH特異引物和雙色Taqman熒光探針，其特征在于，其序列分別為 DSCR上游引物5， -CAGAAATCCCAGTTC ATGTTGCT-3， ; DSCR下游引物5， -CAT TCC CGG GTG CCA TGA ACA GT-3, ; DSCR TaqMan探針5， -[FAM]CAA GGC CGT GTC CCC TTG TTC[TAMRA]-3， ; GAPDH上游引物5， -etc cct ctt tct ttg cag caa t-3， ; GAPDH下 游引物5， 一cag etc tea tac cat gag tec t—3， ； GAPDH TaqMan探針5， —[HE幻ctg cac cac caa ctg ctt age [TAMRA]-3，。所用擴增緩沖反應體系，其特征在于，是由引物、探針、耐熱DNA聚合酶、dNTPs、 模板DNA、 Mg++、 PCR反應緩沖液、超純水等組成的，各個成分的濃度含量分別如下DSCR 和GAPDH特異的引物、雙色熒光Taqman探針各0.1-0. 5umol/L、Taq DNA聚合酶1-3U/50ul、 dNTPs底物0. 1-0. 5腦ol/L、模板DNA若干、\^++1. 5-3. 5 mmol/L、反應緩沖液0. 5-1. 5XPCR， 其中1XPCR反應緩沖液包括50咖ol/L KC1、 10 mmol/L Tris.HCl PH8. 3、 0.01%明膠。該種雙色熒光定量共擴增聚合酶鏈反應試劑盒實現兩對引物的共擴增的同時通過檢 測擴增過程中由于降解Taqrnan探針獲得的熒光信號的強弱，獲得各自的擴增曲線圖，進 而得出各個基因的Ct值。根據樣品的Ct值和標準曲線，利用以下公式計算分別計算DSCR 區段序列和16號染色體上的GAPDH基因序列含量Nx = No * Y "° —"x;其中Nx為樣 本x的靶基因的起始拷貝數，Y為擴增效率，相當于Ct值減少1個循環對應的模板DNA的 增加的倍數，由公式Y40"" (ACt ^靶DNA每稀釋10倍，平均增加的Ct值數)計算獲得；CtX為擴增管X的靶基因的Ct值；CtO為標準曲線上靶基因拷貝數為No時的Ct值；No為起始拷貝數。根據以下公式計算二者的比值R: R= Nd/ Ng,其中Nd為DSCR拷貝數， Ng為GAPDH拷貝數；最后根據二者的比值R判斷21號染色體的倍性。該種雙色熒光定量共擴增聚合酶鏈反應試劑盒與其它檢測21號染色體倍性的方法相 比，具有以下優點1、操作簡便快速,可以在2-3小時內獲得準確的檢測結果；2、閉管 檢測，不會造成擴增產物污染；3、自動化程度高，人工成本低，還可以高通量檢測，每次可 以檢測90個以上標本；4、需要的檢測樣本材料微量,每個反應僅需要待檢DNA 50-100 ng， 便于取材。
具體實施方式
實施例l:1.引物和探針的設計根據genebank中DSCR1 [gi :7768679]的序列設計DSCR的引物如下 上游弓I物DSCRF: 5 ， -CAGAAATCCCAGTTCATGTTGCT-3 ，； 下游引物DSCRR:5， -CATTCCCGGGTGCCATGAACAGT-3，； TaqMan探針DSCRTM: 5, - [FAM] CAAGGCCGTGTCCCCTTGTTC [TAMRA] -3 ，； 擴增產物96bp,在基因中的位置如下cacgcgacga ggacgcattc caaatcatac tcacgggagg aatcttttac 34812197 tgtggaggtg gctggtcacg acttcttcgg aggtggcagc cgagatcggg 34812147 gtggc|agaa￡t tcccagttca tgttgct|cag aagagaat|ca aggccgtgtc(:(.'c"gUet aatgctgcac accagttact gttcatggca cccgggaatg34812097 34812047根據genebank中[gi: 32891804]設計內對照GAPDH [ glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,三磷酸甘油醛脫氫酶]的引物如下上游弓l物GAPDF:5， -ctccctctttctttgcagcaat-3，； 下游弓l物GAPDR:5， -cagctctcataccatgagtcct-3，； TaqMan探針GAPDTM:5， -[HEX] ctgcaccaccaactgcttagc [TAMRA]-3，； 擴增產物112bp，在基因中的位置如下gggtgtgaac catgagaagt atgacaacag cctcaagatc atcaggtgag 6516648 ga鄉caggg cccgtggaga agcggccagc ctggcaccct atggacacgc 6516698tcccctgact tgcgccccgc tccctctttc tttgcagcaa tgcctc|ctgc| 6516748buiiccaat'L gcttagcacc cctggccaag gtcatccatg acaactttgg 6516798tatcgtgga]a ggactcatgg tatgagagct g!gggaatggg actgaggctc 65168482. 雙色熒光定量PCR反應混合50 ul反應體系，內含兩引物各10 pmol，各探針10 pmol，患者或正常人DNA 50-100 ng， IX PCR緩沖液，Taq DNA聚合酶2u， Mg+十終濃度2鵬ol/L，然后在FTC2000實時熒 光定量PCR儀上96。C下預變性2 min，然后94。C變性10 sec, 52。C復性30 see, 60。C延伸 40 sec，共45個循環，并在60。C延伸時照相。每一個標本重復三次實驗。3. 熒光定量PCR的標準曲線將DNA模板10倍、100倍、1000倍、10000倍等比稀釋做DSCR1和GAPDH基因的標準 曲線，以比較和得出兩個基因的擴增效率。4. 結果實驗表明唐氏綜合征患者的GAPDH與DSCR1的差值為1. 85±0. 27，而正常人的GAPDH 與DSCR1的差值為1. 06±0.176，用2—M"方法計算換成拷貝數的差異約為1/1. 58 1. 43，兩者間的差異有統計學意義。 實施例2:1. 引物和探針的設計根據genebank中DSCR1 [gi :7768679]的序列設計DSCR的引物如下 上游引物DSCRF:5， -CAGAAATCCCAGTTCATGTTGCT-3'; 下游引物DSCRR:5， -CATTCCCGGGTGCCATGAACAGT-3，； TaqMan探針DSCRTM: 5 ， - [FAM] CAAGGCCGTGTCCCCTTGTTC [TAMRA] -3 ，； 根據genebank中[gi: 32891804]設計內對照GAPDH [ glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,三磷酸甘油醛脫氫酶]的引物如下:上游弓l物GAPDF:5， _ctccctctttctttgcagcaat_3，； 下游弓I物GAPDR:5， -cagctctc由ccatgagtcct-3，； TaqMan探針GAPDTM:5， -[HE幻ctgcaccaccaactgcttagc [TAMRA]-3，； 引物探針和擴增產物在基因中的位置同實施例1。2. 雙色熒光定量PCR反應混合50 ul反應體系，內含兩引物各15 pmol，各探針15 pmol,患者或正常人DNA 50-100 ng， IX PCR緩沖液，Taq DNA聚合酶2 u， Mg++終濃度3 mmol/L，然后在FTC2000實時熒 光定量PCR儀上96。C下預變性2 min,然后94。C變性10 sec, 56。C復性30 sec， 6(TC延伸 40.sec，共45個循環，并在60。C延伸時照相。每一個標本重復三次實驗。3. 熒光定量PCR的標準曲線將DNA模板10倍、100倍、1000倍、10000倍等比稀釋做DSCR1和GAPDH基因的標準 曲線，以比較和得出兩個基因的擴增效率。4. 結果實驗表明唐氏綜合征患者的GAPDH與DSCR1的差值為1. 88±0. 29，而正常人的GAPDH 與DSCR1的差值為1. 16±0. 17，用2-AA"方法計算換成拷貝數的差異約為1/1. 61 1. 53， 兩者間的差異有統計學意義。 實施例31.引物和探針的設計 根據genebank中DSCR1 [gi :7768679]的序列設計DSCR的引物如下
上游引物DSCRF:5， -CAGAAATCCCAGTTCATGTTGCT-3，； 下游引物DSCRR: 5 ， -CATTCCCGGGTGCCATGAACAGT-3 ，； TaqMan探針DSCRTM: 5 ， - [FAM] CAAGGCCGTGTCCCCTTGTTC [TAMRA] -3 ，； 根據genebank中[gi: 32891804]設計內對照GAPDH [ glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,三磷酸甘油醛脫氫酶]的引物如下上游弓l物GAPDF:5， -ctccctctttctttgcagcaat-3，； 下游弓(物GAPDR:5' -cagctctcataccatgagtcct-3，； TaqMan探針GAPDTM:5， -[HE幻ctgcaccaccaactgcttagc [TAMRA]-3,; 引物探針和擴增產物在基因中的位置同實施例1。2. 雙色熒光定量PCR反應混合50 ul反應體系，內含兩引物各15 pmol，各探針15 pmol，患者或正常人DNA 50-100 ng， 1 X PCR緩沖液，Taq DNA聚合酶2 u'， Mg+十終濃度3 mmol/L,然后在FTC2000實時 熒光定量PCR儀上96'C下預變性2 min，然后94。C變性10 sec， 53。C復性30 sec， 60。C延 伸40 sec，共45個循環，并在60'C延伸時照相。每一個標本重復三次實驗。3. 熒光定量PCR的標準曲線將DNA模板10倍、100倍、1000倍、10000倍等比稀釋做DSCR1和GAPDH基因的標準 曲線，以比較和得出兩個基因的擴增效率。4. 結果實驗表明唐氏綜合征患者的GATOH與DSCR1的差值為1. 78±0. 27,而正常人的GAPDH 與DSCR1的差值為1. 05±0. 25，用2—^"方法計算換成拷貝數的差異約為1/1. 51 1. 43, 兩者間的差異有統計學意義。 實施例41.引物和探針的設計根據genebank中DSCR1 [gi:7768679]的序列設計DSCR的引物如下上游引物DSCRF:5' -CAGAAATCCCAGTTCATGTTGCT-3，；下游引物DSCRR:5， -CATTCCCGGGTGCCATGAACAGT-3，；TaqMan探針DSCRTM: 5 ， - [FAM] CMGGCCGTGTCCCCTTGTTC [TAMRA] -3 ，； 根據genebank中[gi: 32891804]設計內對照GAPDH [ glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,三磷酸甘油醛脫氫酶]的弓l物如下上游弓i物GAPDF:5' -ctccctctttctttgcagcaat-3'; 下游弓l物GAPDR:5， -cagctctcataccatgagtcct-3，； TaqMan探針GAPDTM:5， -[HE幻ctgcaccaccaactgcttagc [TAMRA]-3，； 引物探針和擴增產物在基因中的位置同實施例1。2. 雙色熒光定量PCR反應混合50 ul反應體系，內含兩引物各15 pmol，各探針15 pmol，患者或正常人DNA 50-100 ng， 1.5 X PCR緩沖液，Taq DNA聚合酶2 u， Mg+十終濃度3 mmol/L,然后在FTC2000實 時熒光定量PCR儀上96。C下預變性2 min，然后94。C變性10 sec， 53。C復性30 sec, 60。C 延伸40 sec,共45個循環，并在6(TC延伸時照相。每一個標本重復三次實驗。3. 熒光定量PCR的標準曲線將DNA模板10倍、100倍、1000倍、10000倍等比稀釋做DSCR1和GAPDH基因的標準 曲線，以比較和得出兩個基因的擴增效率。4. 結果實驗表明唐氏綜合征患者的GAPDH與DSCR1的差值為1. 69±0.15，而正常人的GAPDH 與DSCR1的差值為1.02±0. 12，用2—A^方法計算換成拷貝數的差異約為l/1.53: 1.46， 兩者間的差異有統計學意義。 實施例51.引物和探針的設計根據genebank中DSCR1 [gi: 7768679]的序列設計DSCR的引物如下上游引物DSCRF: 5 ， -CAGAAATCCCAGTTCATGTTGCT-3 ，；下游引物DSCRR:5， -CATTCCCGGGTGCCATGAACAGT-3，；TaqMan探針DSCRTM: 5 ， - [FAM] CAAGGCCGTGTCCCCTTGTTC [TAMRA] -3 ，；根據genebank中[gi: 32891804]設計內對照GAPDH [ glyceraldehyde 3-phosphatedehydrogenase,三磷酸甘油醛脫氫酶]的引物如下上游弓l物GAPDF:5， -ctccctctttctttgcagcaat-3'; 下游弓l物GAPDR:5， -cagctctcataccatgagtcct-3，； TaqMan探針GAPDTM:5， -[HE幻ctgcaccaccaactgcttagc [TAMRA]-3'; 引物探針和擴增產物在基因中的位置同實施例1。2. 雙色熒光定量PCR反應混合50 ul反應體系，內含兩引物各25 pmol，各探針25 pmol,患者或正常人DNA 50-100 ng, 1 X PCR緩沖液，Taq DNA聚合酶2 u， Mg十+終濃度2. 5咖ol/L,然后在FTC2000實 時熒光定量PCR儀上96'C下預變性2 min，然后94。C變性10 sec, 53。C復性30 see, 60。C 延伸40 sec，共45個循環，并在6(TC延伸時照相。每一個標本重復三次實驗。3. 熒光定量PCR的標準曲線將DNA模板10倍、100倍、1000倍、10000倍等比稀釋做DSCR1和GAPDH基因的標準 曲線，以比較和得出兩個基因的擴增效率。4. 結果實驗表明唐氏綜合征患者的GAPDH與DSCR1的差值為1. 85±0. 22,而正常人的GAPDH 與DSCR1的差值為1. 24±0. 32，用2_^"方法計算換成拷貝數的差異約為1/1. 55: 1. 48，兩者間的差異有統計學意義。 實施例61.引物和探針的設計根據genebank中DSCR1 [gi :7768679]的序列設計DSCR的引物如下-上游引物DSCRF:5， -CAGMATCCCAGTTCATGTTGCT-3，；下游引物DSCRR: 5 ， -CATTCCCGGGTGCCATGAACAGT-3 ，；TaqMan探針DSCRTM: 5 ， - [FAM] CAAGGCCGTGTCCCCTTGTTC [TAMRA] -3 ，；根據genebank中[gi: 32891804]設計內對照GAPDH [ glyceraldehyde 3-phosphatedehydrogenase,三磷酸甘油醛脫氫酶]的引物如下上游引物GAPDF:5， -ctccctctttctttgcagcaat-3，；
下游弓l物GAPDR:5' -cagctctcataccatgagtcct-3'; TaqMan探針GAPDTM:5， -[HE幻ctgcaccaccaactgcttagc [TAMRA]-3，；引物探針和擴增產物在基因中的位置同實施例1。2. 雙色熒光定量PCR反應混合50 ul反應體系，內含兩引物各20 pmol,各探針20 pmol，患者或正常人DNA 50-100 ng， 1 X PCR緩沖液，Taq DNA聚合酶1. 5 u， Mg十+終濃度2. 5 mmol/L，然后在FTC2000 實時熒光定量PCR儀上96。C下預變性2 min，然后94。C變性10 sec， 56。C復性30 sec, 60 。C延伸40 sec，共45個循環，并在60'C延伸時照相。每一個標本重復三次實驗。3. 熒光定量PCR的標準曲線將DNA模板10倍、100倍、1000倍、10000倍等比稀釋做DSCR1和GAPDH基因的標準 曲線，以比較和得出兩個基因的擴增效率。4. 結果實驗表明唐氏綜合征患者的GAPDH與DSCR1的差值為1. 75±0. 28，而正常人的GAPDH 與DSCR1的差值為1, 15±0. 12，用2—A^方法計算換成拷貝數的差異約為l/1.65: 1.55, 兩者間的差異有統計學意義。
權利要求
1、一種雙色熒光定量共擴增聚合酶鏈反應試劑盒，含有擴增21號染色體特異單拷貝區段DSCR和16號染色體特異單拷貝區段GAPDH體外擴增的熒光定量PCR試劑，其特征在于，首先根據21號染色體特異的DSCR區段序列和16號染色體上的GAPDH基因序列分別合成其特異引物和雙色Taqman熒光探針，然后將0.1-0.5umol/L DSCR和GAPDH特異的引物、雙色熒光Taqman探針加入同一個PCR擴增緩沖反應體系中，在多色實時熒光定量PCR儀上進行96℃預變性2min后，再94℃變性10sec，52-56℃復性30sec，60-70℃延伸40sec，共45個循環，并在延伸時檢測熒光強度，使兩對引物分別同時引導新鏈合成，實現兩對引物的共擴增和其拷貝數的定量檢測。
2、 根據權利要求1所述的一種雙色熒光定量共擴增聚合酶鏈反應試劑盒，其特征在 于，所述DSCR和GAPDH特異引物和雙色Taqman熒光探針的序列分別為DSCR上游引物 5， -CAG AAA TCC CAG TTC ATG TTG CT-3， ; DSCR下游引物5， -CAT TCC CGG GTG CCA TGA ACA GT-3， ; DSCR TaqMan探針5， -[FAM]CAA GGC CGT GTC CCC TTG TTC[TAMRA]-3，; GAPDH上游引物5， -etc cct ctt tct ttg cag caa t-3， ; GAPDH下游引物5' -cag etc tea tac cat gag tec t-3， ； GAPDH TaqMan探針5， -[HEX] ctg cac cac caa ctg ctt age [TAMRA]-3，。
3、 根據權利要求3所述的一種雙色熒光定量共擴增聚合酶鏈反應試劑盒，其特征在 于，擴增緩沖反應體系中，各個成分及其濃度含量分別如下DSCR和GAPDH特異的引物、 雙色熒光Taqman探針各0.1-0. 5咖ol/L、 Taq DNA聚合酶1-3U/50ul、 dNTPs底物0.1-0. 5 ,1/L、模板DNA若干、Mg++1.5-3.5 ,1/L、反應緩沖液0. 5-1. 5XPCR，其中1XPCR反 應緩沖液包括50 mmol/L KCl、 10咖ol/L Tris.HCl PH8. 3、 0. 01%明膠。
全文摘要
本發明公開了一種雙色熒光定量共擴增聚合酶鏈反應試劑盒，首先根據21號染色體特異DSCR區段序列和16號染色體上的GAPDH基因序列分別合成其特異引物和雙色Taqman探針，然后在同一擴增緩沖反應體系中，經過45個PCR循環，使兩對引物分別同時引導新鏈合成，實現兩對引物的共擴增。在PCR擴增的同時檢測擴增過程中由于降解Taqman探針獲得的熒光信號的強弱變化情況，獲得各自的擴增曲線圖，進而得出各個基因的Ct值。從而計算它們的拷貝數比值，再根據兩個基因拷貝數的比值進一步判斷21號染色體的倍性。
文檔編號C12Q1/68GK101105454SQ200710014390
公開日2008年1月16日 申請日期2007年4月29日 優先權日2007年4月29日
發明者夏慶杰, 林 楊 申請人:山東亞大藥業有限公司