專利名稱：假交替單胞菌及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種假交替單胞菌(Pseudoalteromonas tetraodonis)及其用途。
背景技術(shù)：
褐藻膠，又稱褐藻酸多糖，是一種來源于褐藻細胞壁的水溶性酸性多糖，主要從海帶、巨藻、馬尾藻等褐藻中提取得到。我國人工養(yǎng)殖海帶數(shù)量居世界第一位，占世界產(chǎn)量的95％。同時也是僅次于美國的褐藻膠生產(chǎn)大國，但是生產(chǎn)的多為低值的初級產(chǎn)品，產(chǎn)量的80％左右供出口，大約在7000至8000噸左右，其余的20％主要用作紡織工業(yè)原料。因此，如何以資源豐富的低值產(chǎn)品褐藻膠為原料，研究褐藻膠降解產(chǎn)物生物學(xué)價值及其分子作用機理，對于開發(fā)具有重要應(yīng)用價值的褐藻膠相關(guān)系列產(chǎn)品具有及其重要的指導(dǎo)作用，必將對褐藻膠產(chǎn)業(yè)發(fā)展產(chǎn)生深遠的影響。
高分子量的褐藻膠凝膠性強，不容易被吸收，在應(yīng)用方面受到很大的限制。經(jīng)不同程度降解的褐藻膠，水溶性好，有利于人體吸收。研究表明，不同分子量范圍、不同組分(M/G比例)和不同衍生方法得到的褐藻膠降解物及其衍生物，表現(xiàn)出不同的生理活性，可被開發(fā)成多種醫(yī)藥材料和功能食品，如抗凝血、免疫促進效應(yīng)、抗腫瘤活性以及防輻射作用；褐藻膠衍生物還具有比較好的抗愛滋病毒(HIV)活性[1，2，3]。進一步降解得到的褐藻膠低聚糖平均分子量在3KDa以下，還具有促進雙歧桿菌生長、廣譜殺菌活性、提高種子萌發(fā)、促進萌芽及根系生長、增強魚肌原纖維蛋白質(zhì)的持水性和耐熱性等作用[4，5，6]。這些都顯示了褐藻膠降解物作為生理性功能食品、藥物、飼料添加劑、植物生長促進劑的應(yīng)用前景。
但是，現(xiàn)階段對于褐藻膠降解物的研究工作大部分還局限在實驗室內(nèi)，原因就在于褐藻膠不易自動降解，需要適當(dāng)?shù)臈l件和方法，才能將其降解為具有多種生理功能的低聚糖。目前，普遍采用稀酸水解法來獲得褐藻膠降解物，這種方法的降解速度慢，產(chǎn)率低，質(zhì)量難以控制，產(chǎn)物的生化特性不能很好的滿足要求，且需高溫、高壓，操作較復(fù)雜，成本高，并對環(huán)境造成污染。與之相比，褐藻膠裂解酶對褐藻膠的降解反應(yīng)具有條件溫和、效率高、無污染、底物專一性明確、產(chǎn)物的生物學(xué)活性強等優(yōu)點，因而酶法制備褐藻膠低聚糖的技術(shù)備受青睞，顯示出其誘人的發(fā)展前景。
本發(fā)明采用的菌種為實驗室自行篩選分離得到，經(jīng)鑒定為假交替單胞菌(Pseudoalteromonas tetraodonis)，在英國國際微生物研究所保藏，保藏號為SD227。
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假交替單胞菌(Pseudoalteromonas tetraodonis)在英國國際微生物研究所保藏，保藏號為SD 227，假交替單胞菌(Pseudoalteromonas tetraodonis)為革蘭氏陰性菌，短桿狀1.0～2.4μm，兼性菌，通過單極鞭毛運動，無芽孢，耐鹽。
假交替單胞菌(Pseudoalteromonas tetraodonis)用于生產(chǎn)褐藻膠裂解酶。
用于生產(chǎn)褐藻膠裂解酶的方法包括如下步驟1)將假交替單胞菌(Pseudoalteromonas tetraodonis)劃線接種至含有0.3％～0.5％海藻酸鈉的2216E海洋細菌固體培養(yǎng)基中，在25～28℃條件下，培養(yǎng)12～16小時，得到斜面菌種；
2)將上述斜面菌種轉(zhuǎn)接至含有0.3％～0.5％海藻酸鈉的2216E海洋細菌液體培養(yǎng)基中，25～28℃搖瓶培養(yǎng)12～16小時，得到液體菌種；3)將上述1％～3％液體菌種轉(zhuǎn)接至30～50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，25～28℃搖瓶培養(yǎng)16～18小時，得到發(fā)酵液；4)將上述發(fā)酵液在4℃下、3000rpm離心10～15分鐘去除菌體，濃縮至5～10倍，得到褐藻膠裂解酶濃縮液制劑。
所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成以g/L為單位計磷酸氫二銨11.6、氯化鈉32.9、硫酸亞鐵0.08、硫酸鎂0.3和磷酸氫二鉀0.4，pH7.4～7.6。
所述的濃縮方法為中空纖維膜超濾方法。
本發(fā)明的優(yōu)點是，菌種易培養(yǎng)、代時短，發(fā)酵液雜蛋白種類少、含量低，可直接用中空纖維膜超濾的方法濃縮脫鹽，得到褐藻膠裂解酶濃縮液制劑。產(chǎn)品的活性高，穩(wěn)定性好，成本低，能夠?qū)崿F(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實施例方式
假交替單胞菌(Pseudoalteromonas tetraodonis)為革蘭氏陰性菌，短桿狀1.0～2.4μm，兼性菌，通過單極鞭毛運動，無芽孢，耐鹽。未有對人致病性報道。其培養(yǎng)方法已知，可用2216E海洋細菌培養(yǎng)基。最適生長溫度為25～28℃。假交替單胞菌ZQ-4能分泌胞外褐藻膠裂解酶，該酶的工作溫度范圍為30～40℃，最適反應(yīng)溫度為40℃，反應(yīng)pH6～8，最適pH7.6；酶活力在搖瓶條件下達到256.47U/mL。
實施例11)將假交替單胞菌(Pseudoalteromonas tetraodonis)劃線接種至含有0.3％海藻酸鈉的2216E海洋細菌固體培養(yǎng)基中，在25℃條件下，培養(yǎng)12小時，得到斜面菌種，2216E海洋細菌固體培養(yǎng)基組成以g/L為單位計NaCl 30，蛋白胨5，酵母浸膏1，磷酸高鐵0.01，瓊脂20，pH7.4～7.6[7]；2)將上述斜面菌種轉(zhuǎn)接至含有0.3％海藻酸鈉的2216E海洋細菌液體培養(yǎng)基中，25℃搖瓶培養(yǎng)12小時，得到液體菌種，2216E海洋細菌液體培養(yǎng)基組成以g/L為單位計NaCl 30，蛋白胨5，酵母浸膏1，磷酸高鐵0.01，pH7.4～7.6[7]；3)將上述1％液體菌種轉(zhuǎn)接至30mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，25℃搖瓶培養(yǎng)16小時，得到發(fā)酵液，發(fā)酵培養(yǎng)基的組成以g/L為單位計磷酸氫二銨11.6、氯化鈉32.9、硫酸亞鐵0.08、硫酸鎂0.3和磷酸氫二鉀0.4，pH7.4～7.6；4)將上述發(fā)酵液在4℃下、3000rpm離心15分鐘去除菌體，中空纖維膜超慮濃縮至5倍，得到褐藻膠裂解酶濃縮液制劑。
實施例21)將假交替單胞菌(Pseudoalteromonas tetraodonis)劃線接種至含有0.5％海藻酸鈉的2216E海洋細菌固體培養(yǎng)基中，在28℃條件下，培養(yǎng)16小時，得到斜面菌種，2216E海洋細菌固體培養(yǎng)基組成以g/L為單位計NaCl 30，蛋白胨5，酵母浸膏1，磷酸高鐵0.01，瓊脂20，pH7.4～7.6；2)將上述斜面菌種轉(zhuǎn)接至含有0.5％海藻酸鈉的2216E海洋細菌液體培養(yǎng)基中，28℃搖瓶培養(yǎng)16小時，得到液體菌種，2216E海洋細菌液體培養(yǎng)基組成以g/L為單位計NaCl 30，蛋白胨5，酵母浸膏1，磷酸高鐵0.01，pH7.4～7.6；3)將上述3％液體菌種轉(zhuǎn)接至50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，28℃搖瓶培養(yǎng)18小時，得到發(fā)酵液，發(fā)酵培養(yǎng)基的組成以g/L為單位計磷酸氫二銨11.6、氯化鈉32.9、硫酸亞鐵0.08、硫酸鎂0.3和磷酸氫二鉀0.4，pH7.4～7.6；4)將上述發(fā)酵液在4℃下、3000rpm離心15分鐘去除菌體，中空纖維膜超慮濃縮至10倍，得到褐藻膠裂解酶濃縮液制劑。
實施例31)將假交替單胞菌(Pseudoalteromonas tetraodonis)劃線接種至含有0.4％海藻酸鈉的2216E海洋細菌固體培養(yǎng)基中，在27℃條件下，培養(yǎng)14小時，得到斜面菌種，2216E海洋細菌固體培養(yǎng)基組成以g/L為單位計NaCl 30，蛋白胨5，酵母浸膏1，磷酸高鐵0.01，瓊脂20，pH7.4～7.6；2)將上述斜面菌種轉(zhuǎn)接至含有0.4％海藻酸鈉的2216E海洋細菌液體培養(yǎng)基中，27℃搖瓶培養(yǎng)14小時，得到液體菌種，2216E海洋細菌液體培養(yǎng)基組成以g/L為單位計NaCl 30，蛋白胨5，酵母浸膏1，磷酸高鐵0.01，pH7.4～7.6；3)將上述2％液體菌種轉(zhuǎn)接至40mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，27℃搖瓶培養(yǎng)17小時，得到發(fā)酵液，發(fā)酵培養(yǎng)基的組成以g/L為單位計磷酸氫二銨11.6、氯化鈉32.9、硫酸亞鐵0.08、硫酸鎂0.3和磷酸氫二鉀0.4，pH7.4～7.6；4)將上述發(fā)酵液在4℃下、3000rpm離心15分鐘去除菌體，中空纖維膜超慮濃縮至8倍，得到褐藻膠裂解酶濃縮液制劑。
權(quán)利要求
1.一種假交替單胞菌(Pseudoalteromonas tetraodonis)，其特征在于，在英國國際微生物研究所保藏，保藏號為SD 227，假交替單胞菌(Pseudoalteromonas tetraodonis)為革蘭氏陰性菌，短桿狀1.0～2.4μm，兼性菌，通過單極鞭毛運動，無芽孢，耐鹽。
2.一種如權(quán)利要求1所述假交替單胞菌(Pseudoalteromonas tetraodonis)的用途，其特征在于它用于生產(chǎn)褐藻膠裂解酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種假交替單胞菌(Pseudoalteromonastetraodonis)的用途，其特征在于所述的用于生產(chǎn)褐藻膠裂解酶的方法，包括如下步驟1)將假交替單胞菌(Pseudoalteromonas tetraodonis)劃線接種至含有0.3％～0.5％海藻酸鈉的2216E海洋細菌固體培養(yǎng)基中，在25～28℃條件下，培養(yǎng)12～16小時，得到斜面菌種；2)將上述斜面菌種轉(zhuǎn)接至含有0.3％～0.5％海藻酸鈉的2216E海洋細菌液體培養(yǎng)基中，25～28℃搖瓶培養(yǎng)12～16小時，得到液體菌種；3)將上述1％～3％液體菌種轉(zhuǎn)接至30～50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，25～28℃搖瓶培養(yǎng)16～18小時，得到發(fā)酵液；4)將上述發(fā)酵液在4℃下、3000rpm離心10～15分鐘去除菌體，濃縮至5～10倍，得到褐藻膠裂解酶濃縮液制劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種假交替單胞菌(Pseudoalteromonastetraodonis)的用途，其特征在于所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成以g/L為單位計磷酸氫二銨11.6、氯化鈉32.9、硫酸亞鐵0.08、硫酸鎂0.3和磷酸氫二鉀0.4，pH7.4～7.6。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種假交替單胞菌(Pseudoalteromonastetraodonis)的用途，其特征在于所述的濃縮方法為中空纖維膜方法。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種假交替單胞菌及其用途。假交替單胞菌，在英國國際微生物研究所保藏，保藏號為SD 227。假交替單胞菌用于生產(chǎn)褐藻膠裂解酶。方法包括如下步驟1)將假交替單胞菌劃線接種至含有海藻酸鈉的2216E海洋細菌固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)得到斜面菌種；2)將上述斜面菌種轉(zhuǎn)接至含有海藻酸鈉的2216E海洋細菌液體培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)，得到液體菌種；3)將液體菌種轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，搖瓶培養(yǎng)，得到發(fā)酵液；4)將發(fā)酵液離心去除菌體，濃縮，得到褐藻膠裂解酶濃縮液制劑。本發(fā)明的菌種易培養(yǎng)、代時短，發(fā)酵液雜蛋白種類少、含量低，用中空纖維膜超濾的方法濃縮脫鹽，得到褐藻膠裂解酶濃縮液制劑。產(chǎn)品的活性高，穩(wěn)定性好，成本低，能夠?qū)崿F(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C12N9/24GK101037661SQ20071006731
公開日2007年9月19日 申請日期2007年2月12日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月12日
發(fā)明者鄭曉冬, 湯海青, 王一非, 張嘉, 鄒慧熙 申請人:浙江大學(xué)