專利名稱：一種預示和鑒定雞腹脂量的微衛星分子標記方法
技術領域：
本發明屬于動物分子遺傳學領域，特別是涉及一種用微衛星分子標記檢測雞腹脂量的方法。
(二)、背景技術雞不僅在全世界廣泛飼養，具有重要經濟價值，而且在生命科學研究中極有意義，是一種重要的模式生物。家禽育種工作在過去的幾十年中依賴于表型的選擇已經取得了令人矚目的成績，肉雞的生長速度和肉產量得以明顯提高。肉雞業在世界范圍內，尤其在中國等發展中國家具有良好的發展前景。然而，伴隨著肉雞的快速生長，其生理性不適癥及相關疾病明顯增加，如腹脂沉積過多，腿部疾病，腹水綜合癥，猝死癥，雞體免疫功能下降等，這些問題給肉雞生產者造成的經濟損失是顯而易見的。腹脂被認為是一種經濟價值很低的副產品，并且過多的腹脂沉積將導致飼料轉化率下降。如何控制腹脂在肉雞體內的沉積，育種工作者做了大量的研究，目前，選育低脂肉雞品系是世界范圍內肉雞育種重要的奮斗目標之一。
國內外學者普遍認為通過遺傳選擇手段選育低脂肉雞是控制雞體脂沉積過多的一個有效的途徑。Griffin等研究了血漿極低密度脂蛋白(VLDL)濃度與腹脂的關系，發現二者存在正的遺傳相關，并對低VLDL濃度的品系選擇了4個世代，發現其腹脂和體脂含量下降，蛋白質含量和飼料效率有所提高。Whitehead和Griffin對血漿VLDL濃度進行雙向選擇，獲得了瘦雞品系和肥雞品系，兩個品系7周齡體重相近，但瘦雞系的總蛋白含量較高，體脂含量較少，而肥雞系正相反。李輝等根據血漿極低密度脂蛋白(VLDL)濃度及腹脂率等指標對來源于AA肉雞的一個父系進行雙向選擇，建成了現在的東北農業大學高低脂雙向選擇品系，到目前為止已經經過了10個世代的選擇，高、低脂系在腹脂量上已有明顯的分離，兩系腹脂率(AFP)相差近3倍(見附圖1)，是一個檢測影響雞腹脂量差異等位基因的寶貴資源群體。
然而通過遺傳選擇手段培育瘦雞品系和肥雞品系對降低肉雞腹脂雖然取得了一定的作用，但其育種進展還是比較緩慢的。過去的15年來，伴隨著人類基因組計劃的開展，畜禽基因組計劃也得到了高速發展。分子生物學和數量遺傳學的結合，使得標記輔助選擇(MAS)的可操作性大大加強。選擇與數量性狀位點(Quantitative Trait Loci，QTL)相連鎖的分子遺傳標記(基因或非基因標記)即可實現對基因型的直接選擇，這將大大加快育種進程。
微衛星標記作為繼RFLP之后的第二代分子標記，越來越受到研究者的青睞。微衛星，又稱簡單序列重復(Simple sequence repeats，SSR)，是指以少數幾個核苷酸(2～6個)為單位多次串聯重復的DNA序列。微衛星標記由核心序列和兩側保守的側翼序列構成。保守的側翼序列使微衛星特異地定位于染色體某一區域，核心序列重復數的差異則形成微衛星的高度多態性。微衛星標記具有以下的優點①分布廣泛，微衛星廣泛分布于真核生物基因組中，大約每隔10～50kb就存在一個微衛星。②高度多態，突變率低，在不同的個體中，微衛星重復單位數目的變異非常大，由此造成了高度的長度多態性，并使其具有較高的信息含量。③共顯性標記，微衛星標記遵循孟德爾遺傳法則，呈共顯性遺傳，因此能很好地區分純合子與雜合子。④微衛星引物的通用性，微衛星側翼序列的保守性以及物種間某些染色體區段的共線性，使得從一個物種獲得的引物可以應用于相關的分類群。⑤中性標記，在多數情況下，微衛星標記沒有任何表型效應，因而不存在對畜禽個體的有害或次級效應。
(三)、發明內容本發明的主要目的是提供一種分子生物學技術，即采用PCR和變性聚丙烯酰胺凝膠電泳來檢測雞腹脂含量，從而預示和鑒定雞腹脂量的微衛星分子標記方法。
本發明的目的是這樣實現的1、根據雞基因組序列在微衛星ADL328兩側設計一對引物，其中上游引物在5’端加上6-FAM熒光標記ADL328F5’-CACCCATAGCTGTGACTT-3’ADL328R5’-AAAACCGGAATGTGTAAC-3’；2、利用該引物對雞的基因組DNA進行PCR擴增；3、使用ABI377測序儀進行微衛星PCR擴增產物的檢測分析，檢測出ADL328在該群體中存在長度多態；4、根據擴增出來的片斷長度將其分成4個等位基因，從小到大依次為1、2、3和4。4個等位基因共形成10種基因型，其中等位基因1和4構成的三種基因型見附圖2。
本發明還可以包括1、其中分析標記多態性的方法是通過檢測微衛星重復片斷長度而分類的基因型。
2、其中用于分析標記多態性的部位是雞1號染色體173442693bp處。
3、其中用于分析標記多態性的部位是由ADL328F和ADL328R表示的引物擴增區。
4、其中用于分析多態性的位點選自雞基因組如下序列中第32位至第57位的13個CA重復序列。
1 CACCCATAGCTGTGACTTTGTTCGAGTGCTGCACACACACACACACACACACACACACGA61 CTGTGAAAGAGTACATTTGTCTCTGGAGTTTGCTGCAGTTACACATTCCGGTTTT。
5、其中雞腹脂量是雞的腹脂重和腹脂率。
6、其中變性聚丙烯酰胺凝膠濃度為4.5％。
實驗證明該微衛星標記的基因頻率在5個世代中兩系間的分布均達到顯著或極顯著水平，在連續5個世代中等位基因4在兩系間的分布均達到顯著或極顯著水平。
本發明巧妙地采用PCR擴增和凝膠分離的方法檢測雞1號染色體上的一個微衛星標記在群體中的多態性。由于該微衛星標記在群體中存在長度多態，因此，根據擴增片斷長度大小將4種等位基因分別命名為1、2、3和4。由于該微衛星具有多個等位基因，因此采用ABI377測序儀進行等位基因的分離。
獲得基因型后計算等位基因的頻率，比較等位基因頻率在東北農業大學高腹脂和低腹脂兩個品系問的分布差異，結果表明ADL328等位基因頻率在兩系間存在顯著或極顯著差異，并且在連續5個世代中都檢測到了這種差異。對該微衛星標記與腹脂量的相關分析表明其與腹脂重和腹脂率都存在顯著或極顯著的相關，并且在連續五個世代中都得到了一致的結果。基因型間的多重比較表明11基因型的腹脂重和腹脂率顯著高于22、33、44基因型。
本發明操作簡單、費用低、精確度高，可進行自動化檢測。利用本發明的微衛星分子標記方法對腹脂量進行選擇，不僅為雞育種工作中標記輔助選擇提供了一個更為有效、簡便易行的微衛星分子標記方法，同時為雞的腹脂量改良提供了一種有效的微衛星分子標記育種手段，可以加速雞的育種進程。


附圖1是高低脂雙向選擇系選育效果圖；附圖2-4是等位基因1和4構成的三種基因型效果圖。
具體實施方式
下面舉例對本發明做更詳細地描述一、實驗材料1.實驗動物和性狀測定東北農業大學建立的肉雞高低脂雙向選擇品系，本研究選取5個世代，將每個世代雞只按腹脂重由大到小排序，取高低兩尾各15％的個體，5個世代共計596只雞。
每世代雞群在常規下飼養，測1、3、5、7周齡體重，7周齡末屠宰，屠宰前稱活重，屠宰后稱屠體重、腹脂重，并且計算出腹脂率。
2.實驗藥品Taq DNA Polymerase購自Promega公司；dNTPs、瓊脂糖(Agrose)購自北京鼎國生物技術發展中心；Tris堿、EDTA、丙烯酰胺、N、N’-甲叉雙丙烯酰胺購自美國Life Science公司；硼酸購自北京化學試劑公司；過硫酸銨、尿素購自美國Life technologies公司；TEMED購自上海生工生物工程技術服務有限公司；去離子樹脂購自Gibico公司；Genescan-350TM分子量內標購自美國ABI公司；其他常規試劑由中國農業大學物資供應科提供。
3.主要儀器Gene Amp PCR System 9600PERKIN ELMER公司，美國；Gene Amp PCRSystem 9700PERKIN ELMER公司，美國；梯度PCR儀Eppendorf公司，德國；377測序儀ABI公司，美國；超純水儀Millipore公司，美國；制冰機SANYO公司，日本；自動滅菌鍋SANYO公司，日本；臺式高速低溫離心機Eppendorf公司，德國；DYY-III2型、DYY-III-6B型穩壓穩流電泳儀北京市六一儀器廠，中國；凝膠成像系統Alpha Innotech公司，美國；分光光度計Eppendorf公司，德國。
二、實驗方法1.緩沖液與常用試劑的配制10×PCR Buffer15mM MgCl2，50mM KCl，100mM Tris·HCl，1％TritonX-100，0.1％明膠。
1M Tris·Cl121.14g Tris堿溶于800ml雙蒸水中，用鹽酸調pH值至8.0，加水定容至1000ml，高壓滅菌。
0.5M EDTA(pH8.0)800ml水中加入186.1g乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na·2H2O)，在磁力攪拌器上攪拌，用NaOH(約20g)調節pH至8.0后，加水定容至1000ml，高壓滅菌。
TE(pH8.0)10mM Tris·Cl(pH8.0)，1mM EDTA(pH8.0)，高壓滅菌，室溫保存。
10％SDS100g SDS溶于900ml水中，加熱至68℃助溶，用HCl調pH值至7.2，加水定容至1000ml。
50×TAE緩沖液Tris堿242g，冰乙酸57.1ml，0.5M EDTA(pH8.0)100ml，加水至1000ml。
10％過硫酸銨(APS)0.1g過硫酸銨，加1ml水溶解(每次使用需新鮮配制)。
40％丙烯酰胺貯存液(29∶1)稱取丙烯酰胺58.0g，N、N’-甲叉雙丙烯酰胺2.0g，樹脂1.5g，加入適量的去離子水，攪拌使其充分溶解后，用0.02μm濾紙真空抽濾，定容至150ml，4℃可貯存一個月。
4.5％丙烯酰胺溶液尿素18.0g，樹脂0.5g，5.63ml 40％丙烯酰胺貯存液，加入適量去離子水，攪拌使其充分溶解，用0.02μm濾紙真空抽濾，加入5ml用0.02μm濾紙真空抽濾的10×TBE，定容至50.0ml，灌膠前加入250μl10％過硫酸銨(APS)，30ul四甲基乙二銨(TEMED)。
上樣緩沖液(Loading Buffer)去離子甲酰胺50μl，葡聚糖藍10μl，加入Genescan-350TM 9μl，充分混勻，4℃保存。
10×TBETris堿108g，硼酸55g，EDTA 8.3g，加水至1000ml。
溴化乙錠貯存液在100ml水中加入1g溴化乙錠，4℃棕色瓶內保存。
6×凝膠加樣緩沖液0.25％溴酚藍，0.25％二甲苯青，40％(W/V)蔗糖水溶液，4℃保存。
血液DNA提取液10mM Tris·Cl(pH8.0)，0.1M EDTA(pH8.0)，20μg/ml RNA酶，0.5％SDS。
2.引物的設計與合成以下引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成ADL328F5’-CACCCATAGCTGTGACTT-3’ADL328R5’-AAAACCGGAATGTGTAAC-3’；3.雞基因組DNA的小量提取方法一(1)取20μl抗凝血液，加入500μl禽裂解液，加入蛋白酶K至終濃度為100-200μg/ml，混勻55℃消化12hr，直至溶液中不再有粘稠的團塊。
(2)將溶液冷卻至室溫，加入5M NaCl至終濃度1.5M，混勻10min。加入等體積酚/氯仿，反復顛倒離心管混勻10min。
(3)12,000rpm，室溫離心10min。取上清，加等體積氯仿混勻10min。
(4)12,000rpm，室溫離心10min。取上清2倍體積無水乙醇沉淀DNA。
(5)將DNA挑出放到1.5ml離心管中，用70％乙醇洗1次。
(6)7,500rpm，室溫離心5min，棄上清。
(7)將DNA干燥后(注意不能太干)溶于200μl TE中。
方法二(1)將20μl全血加入裝有700μl 1×SET的1.5ml離心管中，輕輕混勻。
(2)加入蛋白酶K(10mg/ml)至終濃度100-200μg/μl和10％的SDS至終濃度0.5％，55℃消化12h。
(3)待消化完全后，加入等體積的Tris飽和酚，來回顛倒，使其混勻(4)12,000rpm離心10min，用剪去尖端的吸頭將上層水相小心移入另一個離心管中，棄去有機相。重復第三和第四步驟一次。
(5)向水相中加入等體積的酚、氯仿、異戊醇混合液(體積比為24∶23∶1)，混合10min。12,000rpm.，離心10min，移出水相到另一個離心管。
(6)向水相中加入等體積的氯仿、異戊醇混合液(23∶1)，來回顛倒混合10min，12,000rpm，離心10min，移出水相到另一個離心管。
(7)向水相中加1/10體積NaAc(3M，pH5.2)和2倍體積的無水乙醇，來回顛倒，沉淀DNA。
(8)將DNA挑出放到1.5ml離心管中，用70％乙醇洗1次。
(9)7,500rpm離心5min。小心倒掉管中乙醇，將倒置在濾紙上，讓乙醇流盡，置于空氣中干燥。
(10)加入200μl的TE，置50℃水浴中過夜溶解DNA。溶解后貯存于-20℃備用。
4.PCR反應(1)以雞DNA為模板進行PCR擴增，25ul反應體系中包含以下溶液或試劑10×PCR reaction buffer2.5μldNTP Mixture(各2.5mM) 2.0μl引物1(10μM) 0.5μl引物2(10μM) 0.5μlEX-Taq(5U/μl) 0.25μl去離子水 18.25μl基因組DNA(50ng/μl)1.0μl(2)將上述溶液混合并按以下條件進行PCR反應。
94℃變性10min；94℃30sec，61.5℃45sec，72℃30sec，32個循環；72℃延伸10min。
(3)反應結束后，取PCR反應液(2μl)進行瓊脂糖凝膠電泳，檢測PCR產物。
5.利用ABI377測序儀進行微衛星PCR擴增產物的檢測。
(1)用滅菌的去離子水將PCR擴增產物稀釋20～30倍；(2)取1μl稀釋液，加1μl上樣緩沖液，充分混勻；(3)94℃變性5min，取出后立即插置冰上驟冷；
(4)變性的PCR產物用4.5％的變性聚丙烯酰胺凝膠在ABI377序列分析儀GSRun-36A-2400模型下電泳2.5小時；(5)使用GeneScanTM3.1軟件分析Gel File，進行泳道線校正、數據轉換、內在標準分子量校正、遷移片段大小測定；(6)使用GenotyperTM2.5軟件確定基因型。
(GenescanTM3.1軟件使用見Applied Biosystems公司Genescan AnalysisSoftware Version3.1 User’s Manual；GenotyperTM2.5軟件使用見AppliedBiosystems公司ABI PRISMTM Genotyper 2.5 User’s Manual)7.統計模型建立表型數據整理表型數據收集整理采用Excel軟件，用JMP(SAS Institute，Cary，NC)計算表型均值、標準差及相關系數。
等位基因頻率等位基因頻率指一個群體中某一基因對其等位基因的相對比率。
Pi＝〔2(ii)+(ij1)+(ij2)+……(ijn)〕/2NPi第i個等位基因的頻率i純合復等位基因j1，j2……jn與i共顯的第1到第n個等位基因由于微衛星呈共顯性遺傳，所以對測得的基因型進行統計計算即可獲得等位基因頻率實施例、雞微衛星標記基因頻率在高低脂雙向選擇系間的差異分布及其多態性與腹脂量的相關。
利用本發明的引物(ADL328F和ADL328R)對東北農業大學高低脂雙向選擇系5個世代共596個個體的基因組DNA進行PCR擴增，然后利用ABI377測序儀進行微衛星PCR擴增產物的檢測分析。在高低脂5個世代中共檢測到4種等位基因，分別命名為1、2、3和4。
對微衛星標記ADL328基因頻率在兩系間的差異性采用Fisher精確性檢驗(表1)。
表1ADL328等位基因頻率在第六、七、八、九、十世代兩系間的比較(P值)
表2列出微衛星標記ADL328在5個世代中與腹脂量的相關分析結果，相關分析用JMP 6.0(SAS Institute Inc.)進行。
表2微衛星標記ADL328與腹脂重和腹脂率的相關分析結果(P值)
*代表差異顯著(P＜0.05)；**代表差異極顯著(P＜0.01)將5個世代的所有個體放在一起，把世代數作為一個固定效應進行標記與腹脂重和腹脂率的相關分析，結果表明P＜0.01，表明該微衛星多態性與腹脂量顯著相關。對10種基因型在東農高低脂系腹脂重和腹脂率的最小二乘均值進行多重比較結果表明11基因型的腹脂重和腹脂率顯著高于22、33、44基因型(見表3)。
表3ADL328不同基因型對東農高低脂系雞只腹脂重和腹脂率的影響
均值比較時同一列無相同字母者差異顯著(a-bp＜0.05)。
分析多態性的位點選自雞基因組如下序列中第32位至第57位的13個CA重復序列，序列表1 CACCCATAGCTGTGACTTTGTTCGAGTGCTGCACACACACACACACACACACACACACGA61 CTGTGAAAGAGTACATTTGTCTCTGGAGTTTGCTGCAGTTACACATTCCGGTTTT。
權利要求
1.一種預示和鑒定雞腹脂量的微衛星分子標記方法，其特征是(1)、根據雞微衛星標記ADL328附近的基因組序列設計一對引物ADL328F5’-CACCCATAGCTGTGACTT-3’ADL328R5’-AAAACCGGAATGTGTAAC-3’；(2)、利用該引物對雞的基因組DNA進行PCR擴增；(3)、使用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行標記多態性分析，檢測出ADL328在該群體中存在長度多態；(4)、等位基因及其頻率分析根據檢測到的片斷長度對各等位基因命名，片斷由短到長分別命名為1、2、3和4。
2.根據權利要求1所述的預示和鑒定雞腹脂量的微衛星分子標記方法，其特征是其中分析標記多態性的方法是通過檢測不同個體微衛星長度不同而分類的基因型。
3.根據權利要求2所述的預示和鑒定雞腹脂量的微衛星分子標記方法，其特征是其中用于分析標記多態性的部位是雞1號染色體173442693bp處。
4.根據權利要求3所述的預示和鑒定雞腹脂量的微衛星分子標記方法，其特征是其中用于分析標記多態性的部位是由ADL328F和ADL328R表示的引物擴增區。
5.根據權利要求4所述的預示和鑒定雞腹脂量的分子標記方法，其特征是其中用于分析多態性的位點選自雞基因組如下序列中第32位至第57位的13個CA重復序列，1CACCCATAGCTGTGACTTTGTTCGAGTGCTGCACACACACACACACACACACACACACGA61 CTGTGAAAGAGTACATTTGTCTCTGGAGTT TGCTGCAGTTACACATTCCGGTTTT。
6.根據權利要求1-5任何一項所述的預示和鑒定雞腹脂量的分子標記方法，其特征是其中雞腹脂量是雞的腹脂重和腹脂率。
7.根據權利要求1-6任何一項所述的預示和鑒定雞腹脂量的微衛星分子標記方法，其特征是其中用于變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的變性聚丙烯酰胺凝膠的濃度為4.5％。
全文摘要
本發明提供的是一種預示和鑒定雞腹脂量的微衛星分子標記方法。根據雞1號染色體基因組序列，查找到在173442693bp處存在CA重復序列，共有13個CA重復，將其命名為微衛星ADL328，在該微衛星標記兩側根據基因組序列設計一對引物ADL328F和ADL328R；利用該引物對雞的基因組DNA進行PCR擴增，然后利用ABI377測序儀進行微衛星PCR擴增產物的檢測分析，檢測到ADL328在所研究群體中存在4個長度多態，即4個等位基因，分別命名為等位基因1、2、3和4。利用本發明的微衛星標記方法對雞腹脂量進行選擇，不僅為雞育種工作中標記輔助選擇提供了一個更為有效、簡便易行的分子標記方法，同時為雞的腹脂量改良提供了一種有效的分子標記育種手段，可以加速雞的育種進程。
文檔編號C12N15/11GK101078030SQ20071007226
公開日2007年11月28日 申請日期2007年5月28日 優先權日2007年5月28日
發明者李輝, 張慧 申請人:東北農業大學