專利名稱：：快速定量檢測活的雙歧桿菌的方法
技術領域：
：本發明涉及一種用于含雙歧桿菌制品中活的雙歧桿菌的快速定量檢測方法。
背景技術：
：雙歧桿菌(Bifidobacterium)是人和動物腸道內最主要的生理性細菌之一，從1989年法國巴斯德研究院Tissier博士發現雙歧桿菌至今的100多年來，人們從雙歧桿菌的形態學和生理學、分類學和遺傳學、微生態學、生理功能和應用等諸多方面對其進行了廣泛的研究。雙歧桿菌是一類革蘭氏陽性專性厭氧菌，存在于人和動物的消化道中，為腸道優勢菌群，對維持機體健康具有重要意義，它對人機體具有獨特的益生作用，綜合目前文獻的報道，雙歧桿菌具有維持腸道菌群平衡，剌激機體的免疫機能，防止消化道疾病，促進消化和吸收，緩解乳糖不耐癥，降低血清膽固醇，抗癌抗氧化等益生作用。因而，國內外出現了研究和開發雙歧桿菌產品的熱潮，雙歧桿菌被廣泛開發應用于醫療、保健、食品等方面。由于雙歧桿菌制品是一種微生態調節劑，其活菌的數量決定或影響著產品品質，只有當雙歧桿菌活菌數達到106Cfu/mL以上，才能發揮正常的生理功能。并且雙歧制品的菌株必須來源于人，動物源菌株及其他來源菌株用于雙歧制品生產不能在人體中定植，因而達不到保健功效。與此同時，雙歧桿菌的檢測技術也得到了很大的發展。目前，雙歧桿菌的檢測技術主要可分為兩大類，一類是以傳統的平板菌落計數為基礎的檢測技術；另一類是以分子生物學為基礎的各種檢測技術。傳統的平板菌落計數依賴于選擇性培養基，利用抗生素對各種菌的抑制作用不同，在培養基中添加不同種類、不同濃度的抗生素，從而達到選擇性培養雙歧桿菌的目的。但是目前的選擇性培養基不能真正完全特異性選擇雙歧桿菌，各種抗生素都可能對雙歧桿菌會有不同程度的抑制作用，尤其是采用多種抑制劑時，極易造成檢測結果的誤差。此外，在計數操作過程中環境中的氧氣會導致部分雙歧桿菌死亡，也會影響菌數的估計。在所有以PCR為基礎的改進檢測方法和以信號或探針放大為基礎的檢測新方法中，分子信標-實時PCR技術是目前最為理想的辦法。這種技術在同一密閉試管中，實現PCR擴增與靶核苷酸探針雜交檢測同時進行，這樣就可以對PCR產物的數量和特異性進行快速動態的評估。"實時"指的是每個PCR循環之后都對擴增產物進行檢測。目前主要有4種方法可用于DNA擴增產物的檢測，分別為T叫Man探針法、分子信標法、雜交探針法和SYBRGreenl熒光染料法，這些方法有著相近的靈敏度。T叫Man技術已經被用來定量檢測糞便樣品中的雙歧桿菌，基于SYBRGreenI的實時PCR方法也被用于雙歧桿菌種或屬的檢測，但目前還沒有應用分子信標法來檢測雙歧桿菌的報道。由于探針涉及雜交過程，要比單純的DNA結合染料有更高的特異性，同時有報道顯示分子信標的特異性高于線性探針。溴化乙錠疊氮化物(Ethidiumbromidemonoazide，EMA)是一種熒光核酸染料，可以與死菌體的DNA結合形成共價化合物，進而能抑制死菌體的DNA進行PCR擴增(Nogvaetal.,2003)。如果將EMA、分子信標探針、實時PCR等材料和技術應用于雙歧桿菌的檢測，可以快速檢測出活的雙歧桿菌的數量，增加檢測的靈敏度，縮短檢測時間。
發明內容本發明的目的是通過在普通PCR技術的基礎上加入了一條熒光標記的分子信標探針，將EMA與分子信標-實時PCR的方法進行結合，不但可以很好的區分死菌活菌，并且可以進行定量檢測。上述的目的通過以下的技術方案實現一種快速定量檢測活的雙歧桿菌的方法，取樣后，將樣品io倍稀釋后，進行EMA處理，然后提取樣品的DNA,進行分子信標-實時PCR檢測，根據標準曲線計算雙歧桿菌的含量，所述的DNA提取過程是EMA處理后的含雙歧桿菌制品，加入18%的檸檬酸鈉和1MNaOH，lOOOOrpm離心lOmin，收集菌體細胞，用無菌超純水洗滌后，懸浮于無菌超純水中，取菌懸液，加入到濃度為2X的Tritox-100液中，100'C水浴處理10min后，立即置于冰水中冷卻，所得上清液直接用于分子信標-實時PCR擴增，所述的含雙歧桿菌制品的重量份數為1，所述的檸檬酸鈉的重量份數為0.15，所述的NaOH的重量份數為0.1，所述的無菌超純水的重量份數為0.1，所述的菌懸液的重量份數為0.01,所述的Tritox-lOO液的重量份數為0.1。上述的快速定量檢測活的雙歧桿菌的方法，所述的取樣無菌操作將充分混勻的含雙歧桿菌制品的樣品放入含有PBS緩沖液的滅菌錐形瓶內做成1:IO的均勻稀釋液，室溫靜置水合30min。上述的快速定量檢測活的雙歧桿菌的方法，所述的EMA處理樣品，其特征是取混合均勻的10倍稀釋含雙歧桿菌制品的樣品稀釋液，加入濃度為lmg/mLEMA貯液，充分混勻，避光反應5min，采用650W的鹵素燈照射2min，樣品距光源20cm，操作在冰上進行，每個樣品做兩個平行，所述的雙歧桿菌制品的樣品稀釋液的重量份數為1，所述的EMA貯液的重量份數為0.0015。上述的快速定量檢測活的雙歧桿菌的方法，所述的分子信標-實時PCR檢測的方法是在普通PCR技術的基礎上加入了一條熒光標記的探針，即在已設計的引物擴增區構建分子信標探針，當探針保持完整時，報告熒光基團發射的熒光信號被淬滅熒光基團吸收，淬滅熒光基團抑制了報告熒光基團的熒光信號而不發光，檢測系統不能檢測到報告熒光基團的熒光信號，當兩者距離較遠時，抑制作用消失，熒光信號增強，熒光信號與PCR產物同比增長，隨PCR產物的增加而增強，引物/探針濃度比為0.8pM/0.4jiM,熒光信號采集的退火溫度為40。C，M^+濃度為4.0mM，循環參數為94。Cx3min—94°Cx30sec—40。Cx35sec—59。Cx35sec—72°Cxlmin。上述的快速定量檢測活的雙歧桿菌的方法，所述的引物包括正向引物和反向引物，其中Bif-F為正向引物，長度為19bp,序列為5'-TCTGGCTCAGGATGAACGC-3'，結合位點落在長雙歧桿菌16SrDNA序列的20~38bp號位置；Bif-R為反向引物，長度為20bp,序列為5'-CACCGTTACACCGGGAATTC-3'，結合位點落在長雙歧桿菌16SrDNA序列的655674bp號位置。上述的快速定量檢測活的雙歧桿菌的方法，所述的分子信標探針5'端標記熒光基團FAM,6-羥基勞光素，熒光發射峰值在518nm處，3'端標記淬滅基團DABCYL,4-4'-(惡烷氨基苯偶氮)苯甲酸，熒光發射峰值在491nm處，兩者之間構成能量傳遞結構，分子信標序列為5誦FAM國CCAGGCATCCGGCATTACCACCCGTCCTGG畫3畫DABCYL。上述的快速定量檢測活的雙歧桿菌的方法，所述的分子信標-實時PCR檢測的方法的標準曲線是以不同菌數的陽性模板對數(LogCO)為橫坐標，以PCR反應過程中出現熒光信號的初始循環數Ct為縱坐標繪制雙歧桿菌的標準曲線，濃度范圍在2Xl()S2Xl(^CFU/ml之間時，標準曲線線性良好，相關系數R值大于0.97，所建立分子信標-實時PCR檢測標準曲線，Y=-3.568X+42.322。這個技術方案有以下有益效果1.EMA-分子信標-實時PCR的檢測方法，將溴化乙錠疊氮化物(EMA)、分子信標探針、實時PCR等材料和技術應用于雙歧桿菌的檢測，可以快速、定量檢測出活雙歧桿菌的數量，增加檢測的靈敏度，縮短檢測時間。EMA-分子信標-實時PCR方法對含雙歧桿菌制品中活雙歧桿菌的最低檢出限為2xlO"CFU/mL(g);檢測時間為4h;非雙歧桿菌屬微生物對本方法的檢測結果無影響。此方法可用于含雙歧桿菌制品中雙歧桿菌的快速定量檢測。2.本發明所建立的EMA-分子信標-實時PCR檢測方法重復性好，不同批次和同批次的批內、批間的重復性試驗CV值均小于5X，；特異性強，擴增曲線呈現明顯的S型，非雙歧桿菌屬微生物對檢測結果無影響；靈敏度高，對乳制品中活雙歧桿菌的最低檢出限為2xlO"CFU/mL(g);線性范圍寬，起始模板數在2xl08CFU/ml-2xl04CFU/ml之間具有良好的線性關系，相關系數大于97%。；檢測時間為4h，與平板菌落計數方法相比顯著縮短檢測時間。3.本發明所建立的EMA-分子信標-實時PCR檢測方法與傳統平板菌落計數檢測方法相比較，兩種檢測方法獲得的結果差異不顯著(p>0.05)，實驗結果表明，所建立的EMA-分子信標-實時PCR檢測方法具有靈敏、特異、簡便和快速的特點，可用于對雙歧桿菌活菌數的定量檢測。4.EMA-分子信標-實時PCR技術與傳統的PCR技術相比，整個過程采用完全閉管檢測，因此擴增產物污染的可能性很低，在同一儀器中可以定性、定量、突變及多重測定，定量范圍比傳統PCR方法高出23個數量級。5.由于省去了傳統的電泳、照相等操作步驟，避免了放射性物質或凝膠電泳染色時溴化乙啶等污染和危害，因此安全可靠，而且所需時間更短；檢測靈敏度比傳統PCR方法高出10100倍。6.由于EMA-分子信標-實時PCR技術是在普通PCR基礎上增加了一條熒光探針，由專門的儀器在擴增的同時檢測熒光強度的變化，大大提高了檢測靈敏度。同時熒光探針又起到了DNA雜交探針的作用，相當于通過PCR和DNA雜交兩者反應驗證檢測的特異性。而且，整個操作過程只需在加樣時開蓋一次，其后的過程完全是閉管操作，并且不需要對PCR產物進行凝膠電泳、染色劑染色、在紫外光下觀察等PCR后操作，大大減少了污染的機會，同時也避免了染色劑對人體的毒害作用。7.EMA-分子信標-實時PCR檢測方法不需要繁瑣的培養富集，操作過程簡單，儀器自動給出結果，檢測時間短，只需4h(包括樣品前處理時間)。EMA-分子信標-實時PCR檢測方法可檢測活菌數。分子信標的構建及其性能檢測1.1分子信標的構建在己設計的引物擴增區，經多序列分析軟件ClustalW及DNAman對已知的34種雙歧桿菌16SrRNA/16SrDNA進行多重比對分析后，利用探針設計軟件BeaconDesigner2.0，選取高度保守區161180bp片段作為設計分子信標環部結構的模板，軟件分析證實此片段不存在二級結構。構建出分子信標環部寡核苷酸序列，長度為20bp;通過軟件BeaconDesigner2.0程序給出的莖部序列并結合引物設計軟件PrimerPremier5.0，參考莖部設計要求(Marras,2002)，最終確定出分子信標莖部序列。探針5'端標記熒光基團FAM(6-羥基熒光素，熒光發射峰值在518nm處)，3'端標記淬滅基團DABCYL(4-4'-(惡烷氨基苯偶氮)苯甲酸，熒光發射峰值在491nm處)，兩者之間構成能量傳遞結構。分子信標序列為5-FAM誦CCAGGCATCCGGCATTACCACCCGTCCTGG畫3畫DABCYL1.2分子信標與其目標DNA的響應特性通過F-4500熒光分光光度計的測定，結果表明當分子信標與目標DNA的終濃度比值為1:20時，分子信標的熒光強度增加最為明顯(見圖3-3和圖3-4),信噪比(S/N)和淬滅效率(Eff)最高(見表3-4)。同時對分子信標與目標DNA的動力學響應也進行了研究(見表3-4)，結果表明在濃度比值為1:20時，分子信標和目標DNA的雜交最快，5min之內即可完成。但從表3-4中可以看出隨著分子信標與目標DNA終濃度比的增加，信噪比和淬滅效率雖均有所增加，但增加幅度卻并不明顯，說明濃度對分子信標與目標DNA雜交效率影響不大，但對雜交速度卻有較大的影響。表l-l分子信標與目標DNA的響應特征<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>1.3分子信標與目標DNA的熱變性條件分子信標與目標DNA的熱變性情況見圖1-3。單獨存在的分子信標在低溫時形成發卡結構，在溫度低于35°C的情況下，熒光強度維持在較低的水平(本底水平)，表明分子信標的發卡處于閉合狀態，結構穩定；在3545'C區間，隨著溫度的變化熒光強度變化很小，表明分子信標的發卡開始打開，但主要還是以穩定的發卡結構存在；當溫度超過45-C后，隨著溫度的逐漸升高，熒光強度急劇增加，表明分子信標的發卡迅速打開；當溫度升至7(TC以后，隨溫度的升高，熒光強度變化不大，表明所有的分子信標的發卡已全部打開。可見，本研究所構建的分子信標的發卡既可以閉合也可以打開，符合分子信標-實時PCR過程對分子信標的要求。當分子信標與目標DNA雜交后，可以看出在40'C以下時，其熒光值明顯高于分子信標單獨存在時的熒光值，這主要是由于分子信標與目標DNA結合后，使得分子信標的莖部打開，5'端的熒光基團與3'端的淬滅基團分開而產生熒光，熒光值維持在較高的水平；但隨著溫度的升高，分子信標與目標DNA的雜交體所形成的雙鏈結構逐漸開始變性，解鏈；當溫度升高到在70'C時，所有的分子信標與目標DNA完全分離，其熒光值與分子信標單獨存在時的體系無明顯差異。因此，本研究所構建的分子信標可以與目標DNA進行特異性結合，可以用于雙歧桿菌的定性檢測。依據分子信標的熱變性條件，可以看出，在45'C時，分子信標自身解鏈趨勢開始上升，所以分子信標的退火溫度不得超過45。C。因此應在45'C以下設置不同的退火溫度，采集熒光信號，比較擴增曲線，最終確定最優的循環參數。分子信標-分子信標-實時PCR反應體系的優化2.1循環參數的確定在循環參數6的條件下，熒光擴增曲線具有較典型的"S"型形態和特異性擴增，并且穩定性、重復性好。擴增曲線及產物電泳結果見圖2-l，圖2-2。在其它5個循環參數下，其擴增的穩定性、重復性均較差，見圖2-3。最終確定循環參數為94°Cx3min^94。Cx30s—40°Cx35s—59°Cx3Qte—72°Cxlmin40cycles此外，從圖2-2中可以看出分子信標的加入對PCR擴增并無影響。但從圖2-3可以看出循環參數對分子信標-實時PCR反應的擴增曲線有直接影響。在實驗中發現在4(TC、4rC、42-C時采集熒光信號，所得擴增曲線趨勢差別不大，但在40'C時曲線形態最好，且在這一溫度下分子信標與目標DNA雜交體約有50%變性，由此可知40'C為分子信標的最佳Tm值。同時變性時間的縮短(從lmhi到30sec)不僅有利于特異性產物的擴增，而且穩定性更好。2.2引物/探針濃度的優化通過分析熒光擴增曲線的形態及比較Ct值的大小，確定最佳引物/探針濃度比。首先觀察曲線形態(見圖2-4),可見引物/探針濃度比為0.4pM/0.4jiM、0.4nM/0.8pM、0.8nM/0.4jiM時曲線的上升趨勢要比其它5個濃度比的趨勢明顯。再分析比較各組的Ct值大小(見表2-l)。表2-l不同引物/探針Ct值的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>注數據角標不同表示差異顯著(P<0.05)經過SAS軟件的統計學分析，0.8nM/0.4jiM組的Ct值明顯小于其它組的值(P<0.05)，再結合曲線形態的分析及最大RFU值，最終選擇最優引物/探針濃度比為0.8nM/0.4nM。3.Mg2+濃度的優化在確定的最佳循環參數及引物/探針濃度比條件下，優化M^+的最適濃度。本實驗設置了9個Mg2+濃度，即2.0mM、2.5mM、3.0mM、3.5mM、4.0mM、4.5mM、5.0mM、5.5mM、6.0mM。結果顯示M^+對熒光強度有一定的影響，濃度過高或過低，都會減弱熒光強度；M^+濃度為2.0mM、2.5mM、4.0mM時，所得到的擴增曲線形狀好且曲線的上升趨勢要比其它6個濃度趨勢明顯(見圖3-l)，熒光強度相對較高，但最大RFU值無明顯變化。從擴增曲線上看，M^+濃度的改變只影響曲線的RFU值，但幾乎不影響Ct值，可見Ct值只與模板的濃度有關。由于M^+濃度是影響Taq酶活性的關鍵因素，而且M^+濃度過高會增加引物二聚體的形成，因此確定2.5mM為M^+最佳濃度。至此確定出分子信標-分子信標-實時PCR最佳反應體系，見表3-2。表3-2分子信標-分子信標-實時PCR最優反應組分Tab.3隱2Theoptimumcomponentofreal-timePCRandmolecularbeacon<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>dNTPMixture(2.5mM)Bif-F(IOjiM)Bif-R(IOjiM)Bif-MB(5jiM)DNAtempalteTaqDNAPolymerase(2.5U/jil)ROXReferenceDye44440.5200pM0.4jiM1.25U標準循環參數94。Cx3min~^94。Cx30s—40。Cx35s—59。Cx39s—72。Cxlmin40cyclesEMA-分子信標-實時PCR檢測乳制品中活雙歧桿菌條件的確定4.1含雙歧桿菌制品稀釋度的確定本實驗將含有雙歧桿菌的奶粉和酸奶分別設置了3個不同的濃度，即原始濃度、IO倍稀釋和IOO倍稀釋。將不同稀釋度的樣品分別采用EMA-分子信標-實時PCR方法和平板菌落計數法進行計數，計數結果分別見表4-1和表4-2。_表4-1不同稀釋度奶粉中雙歧桿菌的計數結果_<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>注同行數據角標不同表示差異顯著(p<0.05)表4-2不同稀釋度酸奶中雙歧桿菌的計數結果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>(Ct士SD)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>由表4-1和4-2可以看出含有雙歧桿菌的奶粉和酸奶在原始濃度條件下進行檢測，EMA-分子信標-實時PCR方法所得結果與平板菌落計數方法所得結果差異顯著(p0.05)。這可能是由于樣品原始濃度比較大，樣品濁度較大，從而導致ema在鹵素光源照射后仍有殘留，在隨后的dna提取過程中，殘留的ema與dna結合，進而抑制dna的分子信標-實時pcr擴增，導致檢測結果不準確。含有雙歧桿菌的奶粉在10倍稀釋度下進行檢測，兩種計數方法所得的結果差異不顯著(pX).05)。含有雙歧桿菌的奶粉和酸奶在100倍稀釋度下進行檢測，兩種計數方法所得的結果差異顯著(p0.05)。這是由于稀釋樣品的濃度較低，導致在DNA提取過程中所獲得的dna量小于實際量，即濃度低時會影響dna的提取量。根據以上對這兩種乳制品的計數結果可知，產品稀釋度會影響ema-分子信標-實時PCR的檢測結果，當樣品濃度過高或過低時，所得的檢測結果與平板菌落計數相比均有顯著差異，只有當乳制品稀釋度適宜時，采用ema-分子信標-實時pcr方法才能真實地反映出其中的活菌數量。在本實驗條件下，所選用的兩種乳制品的最適宜稀釋度為10倍。4.2.EMA最小用量的確定4.2.1EMA最小用量的確定將制備含雙歧桿菌死菌體奶粉溶液和酸奶，對所制備的酸奶進行10倍稀釋，再分別采用0.5jig/mL，l.Ojig/mL,1.5ng/mL,2.0ng/mL，2.5ng/mL和5.0fig/mL六種濃度的EMA對上述兩種制備物進行處理，然后進行分子信標-實時PCR擴增，所獲得的擴增曲線分別見圖4-l和圖4-2。結果顯示六種濃度的EMA對兩種乳制品制備物中雙歧桿菌死菌體DNA的分子信標-實時PCR擴增抑制程度不同。當EMA的濃度小于1.5ng/mL時，雙歧桿菌死菌體DNA還可以進行分子信標-實時PCR擴增，但擴增曲線與對照(control)相比，無明顯S型；當EMA的濃度大于1.5fig/mL(含1.5照/mL)時，雙歧桿菌死菌體DNA的分子信標-實時PCR擴增基本受到抑制。根據以上的實驗結果，確定能夠抑制乳制品中雙歧桿菌死菌體DNA時PCR擴增的最小EMA用量為1.5ng/mL。4.2.2EMA對乳制品中活雙歧桿菌DNA的分子信標-實時PCR擴增的影響將制備含雙歧桿菌活菌奶粉溶液和酸奶，對所制備的酸奶進行10倍稀釋，再分別采用0.5fig/mL,1.0ng/mL，1.5fig/mL，2.0fig/mL，2.5pg/mL和5.0fig/mL六種濃度的EMA對上述兩種制備物進行處理，然后進行分子信標-實時PCR擴增，所獲得的擴增曲線分別見圖4-3和圖4-4。結果顯示由于EMA濃度不同，兩種乳制品制備物中雙歧桿菌活菌DNA的分子信標-實時PCR擴增曲線形態也不同。由圖4-3和圖4-4可知，當EMA達到設置的最大量5.0fig/mL時，雙歧桿菌活菌DNA還可以進行分子信標-實時PCR擴增，但擴增曲線與對照(control)相比，曲線RFU值很小，無明顯S型，但是曲線仍然有Ct值；當EMA的濃度為1.5照/mL時，EMA對雙歧桿菌活菌DNA的分子信標-實時PCR擴增基本沒有影響。根據以上的實驗結果可知，所確定的EMA最小用量(1.5jig/inL)對雙歧桿菌活菌DNA的擴增無影響，因此確定EMA的最小用量為1.5ng/mL。4.3EMA最短曝光時間的確定4.3.1EMA在650W鹵素光源照射下最短曝光時間的確定將制備含雙歧桿菌活菌的奶粉溶液和酸奶，對所制備的酸奶進行10倍稀釋，采用EMA(終濃度為1.5fig/mL)對上述兩種制備物進行處理，再用650W的鹵素燈分別照射30s、lmin、2min、3min和5min，樣品距光源20cm,然后進行分子信標-實時PCR擴增，所獲得的擴增曲線分別見圖4-5和圖4-6。結果顯示由于曝光時間不同，兩種乳制品制備物中雙歧桿菌活菌DNA的分子信標-實時PCR擴增曲線形態也不同。當EMA的曝光時間小于2min時，雙歧桿菌死菌體DNA還可以進行分子信標-實時PCR擴增，但擴增曲線與對照(control)相比，無明顯S型；當EMA的曝光時間豳過2min(含2min)時，EMA對雙歧桿菌活菌DNA的分子信標-實時PCR擴增基本沒有影響，所得到Ct值與對照相比差異不顯著(pX).05)。根據以上的實驗結果，確定650W鹵素光源EMA最短曝光時間為2min。4.3.2EMA在500W鹵素光源照射下最短曝光時間的確定將制備含雙歧桿菌活菌的奶粉溶液和酸奶，對所制備的酸奶進行10倍稀釋，采用EMA(終濃度為1.5jig/mL)對上述兩種制備物進行處理，再用500W的鹵素燈分別照射5min、10min、15min和20min，樣品距光源14cm,然后進行分子信標-實時PCR擴增，所獲得的擴增曲線分別見圖4-7和圖4-8。結果顯示由于曝光時間的不同，兩種乳制品制備物中雙歧桿菌活菌DNA的分子信標-實時PCR擴增曲線形態不同。當EMA的曝光時間小于15mhi時，雙歧桿菌死菌體DNA可以進行分子信標-實時PCR擴增，但擴增曲線與對照(control)相比，無明顯S型；當EMA的曝光時間超過15min(含15min)時，EMA對雙歧桿菌活菌DNA的分子信標-實時PCR擴增基本沒有影響，所得到Ct值與對照相比差異不顯著(pX).05)。根據以上的實驗結果，確定500W鹵素光源EMA最短曝光時間為15min。4.4不同強度曝光光源的比較將制備含雙歧桿菌活菌的奶粉和酸奶，對所制備的酸奶進行10倍稀釋，采用EMA(終濃度為1.5jig/mL)對上述兩種制備物進行處理，再用650W的鹵素燈照射2min，樣品距光源20cm;同時用500W的鹵素燈別照射15min,樣品距光源14cm，然后進行分子信標-實時PCR擴增，所獲得的擴增曲線分別見圖4-9和圖4-10。結果顯示采用不同強度曝光光源進行照射后，兩種乳制品制備物中雙歧桿菌活菌DNA的分子信標-實時PCR擴增曲線形態基本一致，熒光強度相對較高，最大RFU值均無明顯變化，所得到的Ct值結果差異不顯著(pX).05)。但是由于本實驗是在冰上操作，照射時間越長，需要換冰的頻率越高，導致實驗操作繁瑣，檢測時間延長，影響EMA-分子信標-實時PCR的檢測時間。所以本實驗選定的曝光光源為650W鹵素光源，照射時間為2min。圖1是分子信標-分子信標-實時PCR標準曲線。圖1-1分子信標與目標DNA不同濃度比雜交熒光光譜.圖1-2分子信標與目標DNA濃度比為1:20時雜交熒光光譜。圖1-3分子信標與目標DNA的熱變性。圖2-l循環參數6時分子信標-分子信標-實時PCR擴增曲線。圖2-2循環參數6時分子信標-分子信標-實時PCR產物凝膠電泳。圖2-3不同循環參數下分子信標-分子信標-實時PCR擴增曲線的比較。圖2-4不同引物/探針濃度下分子信標-分子信標-實時PCR擴增曲線的比較。圖3-1不同M^+濃度下分子信標-分子信標-實時PCR擴增曲線的比較。圖4-1不同濃度EMA對奶粉制備物中雙歧桿菌死菌體DNA的分子信標-實時PCR擴增的影響。圖4-2不同濃度EMA對酸奶制備物中雙歧桿菌死菌體DNA的分子信標-實時PCR擴增的影響。圖4-3不同濃度EMA對奶粉制備物中雙歧桿菌活菌DNA的分子信標-實時PCR擴增的影響。圖4-4不同濃度EMA對酸奶制備物中雙歧桿菌活菌DNA的分子信標-實時PCR擴增的影響。圖4-5不同曝光時間對奶粉制備物中雙歧桿菌活菌DNA的分子信標-實時PCR擴增的影響。圖4-6不同曝光時間對酸奶制備物中雙歧桿菌活菌DNA的分子信標-實時PCR擴增的影響。圖4-7不同曝光時間對奶粉制備物中雙歧桿菌活菌DNA的分子信標-實時PCR擴增的影響。圖4-8不同曝光時間對酸奶制備物中雙歧桿菌活菌DNA的分子信標-實時PCR擴增的影響。圖4-9不同強度曝光光源對奶粉制備物中雙歧桿菌活菌DNA的分子信標-實時PCR擴增的影響。圖4-10不同強度曝光光源對酸奶制備物中雙歧桿菌活菌DNA的分子信標-實時PCR擴增的影響。本發明的具體實施例方式實施例l:一種快速定量檢測活的雙歧桿菌的方法，取樣后，將樣品10倍稀釋進行EMA處理，然后提取樣品的DNA，分子信標-實時PCR檢測，根據標準曲線計算雙歧桿菌的含量，所述的DNA提取過程是EMA處理后的含雙歧桿菌制品，加入18%的檸檬酸鈉和1MNaOH，lOOOOrpm離心10min，收集菌體細胞，用無菌超純水洗滌后，懸浮于無菌超純水中，取菌懸液，加入到濃度為2%的Tritox-100液中，100。C加熱處理lOmin后，立即置于冰水中快速冷卻，所得上清液直接用于分子信標-實時PCR擴增，所述的含雙歧桿菌制品的重量份數為l,所述的檸檬酸鈉的重量份數為0.15，所述的NaOH的重量份數為0.1，所述的無菌超純水的重量份數為0.1，所述的菌懸液的重量份數為0.01，所述的Tritox-100液的重量份數為0.1。實施例2:實施例1中所述的快速定量檢測活的雙歧桿菌的方法，所述的取樣，無菌操作將充分混勻的含雙歧桿菌制品的樣品放入含有PBS緩沖液的滅菌錐形瓶內做成l:IO的均勻稀釋液，室溫靜置水合30min。實施例3:實施例1或2中所述的快速定量檢測活的雙歧桿菌的方法，所述的EMA處理樣品，取混合均勻的含雙歧桿菌制品的樣品稀釋液，加入濃度為lmg/mLEMAlt液，充分混勻，避光反應5min，采用650W的鹵素燈照射2min，樣品距光源20cm,操作在冰上進行，每個樣品做兩個平行，所述的雙歧桿菌制品的樣品稀釋液的重量份數為1，所述的EMA貯液的重量份數為0.0015。實施例4:上述實施例中所述的快速定量檢測活的雙歧桿菌的方法，所述的分子信標-實時PCR檢測的方法是在普通PCR技術的基礎上加入了一條熒光標記的探針，即在已設計的引物擴增區構建分子信標探針，當探針保持完整時，報告熒光基團發射的熒光信號被淬滅熒光基團吸收，淬滅熒光基團抑制了報告熒光基團的熒光信號而不發光，檢測系統不能檢測到報告熒光基團的熒光信號，當兩者距離較遠時，抑制作用消失，熒光信號增強，熒光信號與PCR產物同比增長，隨PCR產物的增加而增強，引物/探針濃度比為0.8jiM/0.4nM，熒光信號采集的退火溫度為4(TC，Mg"濃度為4.0mM,循環參數為94°Cx3min—94°Cx30sec—40°Cx35sec—59。Cx35sec—72°Cxlmin40cycles實施例5:上述實施例快速定量檢測活的雙歧桿菌的方法，所述的引物包括正向引物和反向引物，其中Bif-F為正向引物，長度為19bp，序列為5'-TCTGGCTCAGGATGAACGC-3'，結合位點落在長雙歧桿菌16SrDNA序列的20~38bp號位置；Bif-R為反向引物，長度為20bp，序列為5'-CACCGTTACACCGGGAATTC-3'，結合位點落在長雙歧桿菌16SrDNA序列的655~674bp號位置。快速定量檢測活的雙歧桿菌的方法，所述的分子信標探針5'端標記熒光基團FAM(6-羥基熒光素，熒光發射峰值在518nm處)，3'端標記淬滅基團DABCYL(4-4'-(惡烷氨基苯偶氮)苯甲酸，熒光發射峰值在491nm處)，兩者之間構成能量傳遞結構，分子信標序列為5-FAM-CCAGGCATCCGGCATTACCACCCGTCCTGG-3畫DABCYL實施例6:上述實施例快速定量檢測活的雙歧桿菌的方法，所述的分子信標-實時PCR技術檢測的原理是，在普通PCR技術的基礎上加入了一條熒光標記的探針，探針的5'端標記一個報告熒光基團即reporter,R;靠近3'端標記一個淬滅熒光基團即quencher,Q;兩者之間約7~10nm時就可發生FRET。當探針保持完整時，報告熒光基團發射的熒光信號被淬滅熒光基團吸收，淬滅熒光基團抑制了報告熒光基團的熒光信號而不發光，檢測系統不能檢測到報告熒光基團的熒光信號。當兩者距離較遠時，抑制作用消失，熒光信號增強。熒光信號與PCR產物同比增長，隨PCR產物的增加而增強，溴化乙錠疊氮化物是一種熒光核酸染料，可以與死菌體的DNA結合形成共價化合物，進而能抑制死菌體的DNA進行PCR擴增，當EMA加入到含有死活菌的樣品中時，活菌的細胞膜是完整的，加入EMA后，EMA只存在菌的表面，不能滲透到活菌的細胞中，通過鹵素光源照射，曝光一段時間后，活菌表面游離的EMA分解或形成羥胺化合物，由于死菌體的細胞膜破壞，EMA進入到細菌的細胞中，在DNA提取的過程中，活菌表面游離的EMA曝光分解或形成羥胺化合物，對活菌的DNA沒有綁定，而存在于死菌體細胞中的EMA，在提取過程中，與死菌體的DNA結合形成共價化合物，活菌的DNA可以進行PCR擴增，但是由于EMA與死菌體的DNA結合形成共價化合物，因此死菌體的DNA不能進行PCR擴增，繪制標準曲線，將EMA與分子信標-實時PCR的方法進行結合不但可以很好的區分死菌活，并且可以進行定量檢測。標準曲線的建立-以不同菌數的陽性模板對數(LogCO)為橫坐標，以PCR反應過程中出現熒光信號的初始循環數(Ct)為縱坐標繪制雙歧桿菌的標準曲線，結果表明當濃度過大(超過2X108CFU/ml)或過低(低于2X104CFU/ml)時，標準曲線相關性不好；濃度范圍在2Xl()S2Xl(^CFU/ml之間時，標準曲線線性良好，相關系數R值大于0.97。因此，依據此模板范圍建立了EMA-分子信標-實時PCR檢測標準曲線，見表l及圖l。表1EMA-分子信標-實時PCR標準曲線的Ct值<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>所檢乳制品樣品中雙歧桿菌的含量計算按圖1建立的標準曲線，計算所檢含雙歧桿菌制品的樣品中雙歧桿菌的結果計算方法如下根據標準曲線y=-3.568X+42.322，y-代表分子信標-實時PCR檢測結果的Ct值。x—代表待測含雙歧桿菌制品的樣品中的雙歧桿菌菌數Log值。所檢乳制品樣品中雙歧桿菌的含量[LogCO/mL=Log值+2由于將含雙歧桿菌制品的樣品稀釋10倍，在分子信標-實時PCR中DNA模板為5UL，總體積為50UL，又進行一次10稀釋。相當于含雙歧桿菌制品的樣品稀釋了100。所以在計算所檢含雙歧桿菌制品的樣品中雙歧桿菌的含量為Log值+2。權利要求1.一種快速定量檢測活的雙歧桿菌的方法，其特征是取樣后，將樣品10倍稀釋后，進行EMA處理，然后提取樣品的DNA，進行分子信標-實時PCR檢測，根據標準曲線計算雙歧桿菌的含量，所述的DNA提取過程是EMA處理后的含雙歧桿菌制品，加入18％的檸檬酸鈉和1MNaOH，10000rpm離心10min，收集菌體細胞，用無菌超純水洗滌后，懸浮于無菌超純水中，取菌懸液，加入到濃度為2％的Tritox-100液中，100℃水浴處理10min后，立即置于冰水中冷卻，所得上清液直接用于分子信標-實時PCR擴增，所述的含雙歧桿菌制品的重量份數為1，所述的檸檬酸鈉的重量份數為0.15，所述的NaOH的重量份數為0.1，所述的無菌超純水的重量份數為0.1，所述的菌懸液的重量份數為0.01，所述的Tritox-100液的重量份數為0.1。2.根據權利要求1所述的快速定量檢測活的雙歧桿菌的方法，其特征是所述的取樣無菌操作將充分混勻的含雙歧桿菌制品的樣品放入含有PBS緩沖液的滅菌錐形瓶內做成l:IO的均勻稀釋液，室溫靜置水合30min。3.根據權利要求1或2所述的快速定量檢測活的雙歧桿菌的方法，所述的EMA處理樣品，其特征是取混合均勻的10倍稀釋含雙歧桿菌制品的樣品稀釋液，加入濃度為lmg/mLEMA貯液，充分混勻，避光反應5min，采用650W的卣素燈照射2min，樣品距光源20cm，操作在冰上進行，每個樣品做兩個平行，所述的雙歧桿菌制品的樣品稀釋液的重量份數為1，所述的EMA貯液的重量份數為0.0015。4.根據權利要求1所述的快速定量檢測活的雙歧桿菌的方法，所述的分子信標-實時PCR檢測的方法是在普通PCR技術的基礎上加入了一條熒光標記的探針，即在已設計的引物擴增區構建分子信標探針，當探針保持完整時，報告熒光基團發射的熒光信號被淬滅熒光基團吸收，淬滅熒光基團抑制了報告熒光基團的熒光信號而不發光，檢測系統不能檢測到報告熒光基團的熒光信號，當兩者距離較遠時，抑制作用消失，熒光信號增強，熒光信號與PCR產物同比增長，隨PCR產物的增加而增強，引物/探針濃度比為.0.8pM/0.4nM，熒光信號采集的退火溫度為40'C,M^+濃度為4.0mM,循環參數為.94°Cx3min—94。Cx30sec—40°Cx35sec—59。Cx35sec—72°Cxlmin。.40cycles5.根據權利要求4所述的快速定量檢測活的雙歧桿菌的方法，其特征是:所述的引物包括正向引物和反向引物，其中Bif-F為正向引物，長度為19bp,序列為5'-TCTGGCTCAGGATGAACGC-3'，結合位點落在長雙歧桿菌16SrDNA序列的2038bp號位置；Bif-R為反向引物，長度為20bp，序列為5'-CACCGTTACACCGGGAATTC-3'，結合位點落在長雙歧桿菌16SrDNA序列的655~674bp號位置。6.根據權利要求4所述的快速定量檢測活的雙'歧桿菌的方法，其特征是所述的分子信標探針5'端標記熒光基團FAM，6-羥基熒光素，熒光發射峰值在518nm處，3'端標記淬滅基團DABCYL,4-4'-(惡烷氨基苯偶氮)苯甲酸，熒光發射峰值在491nm處，兩者之間構成能量傳遞結構，分子信標序列為5國FAM-CCAGGCATCCGGCATTACCACCCGTCCTGG-3'-DABCYL。7.根據權利要求1所述的快速定量檢測活的雙歧桿菌的方法，其特征是所述的分子信標-實時PCR檢測的方法的標準曲線是以不同菌數的陽性模板對數(LogCO)為橫坐標，以PCR反應過程中出現熒光信號的初始循環數Ct為縱坐標繪制雙歧桿菌的標準曲線，濃度范圍在2X1082X104CFU/ml之間時，標準曲線線性良好，相關系數R值大于0.97，所建立分子信標-實時PCR檢測標準曲線，Y=-3.568X+42.322。全文摘要快速定量檢測活的雙歧桿菌的方法。本發明涉及一種用于含雙歧桿菌制品中活的雙歧桿菌的快速定量檢測方法。雙歧桿菌的檢測技術分為傳統的平板菌落計數為基礎的檢測和分子生物學為基礎的各種檢測。本方法取樣將樣品10倍稀釋后，進行EMA處理，提取樣品的DNA，分子信標-實時PCR檢測，根據標準曲線計算雙歧桿菌的含量，DNA提取過程是EMA處理后的樣品，加18％的檸檬酸鈉和1MNaOH，10000rpm離心10min，收集菌體細胞，超純水洗滌后，取菌懸液，加入濃度為2％的Tritox-100液中，100℃水浴處理10min后，立即冷卻，上清液用于分子信標-實時PCR擴增。本發明用于含雙歧桿菌的制品中活的雙歧桿菌的定量檢測。文檔編號C12Q1/68GK101319250SQ20071007232公開日2008年12月10日申請日期2007年6月6日優先權日2007年6月6日發明者孟祥晨,睿龐,超王申請人:東北農業大學