專利名稱：同化甲醛基因植物表達載體的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種同化甲醛基因植物表達載體。
背景技術：
近年來，隨著經濟的發展和人民生活水平的提高，人們的居住條件得到了 較大改善。隨著居住面積的增大，室內裝修成了人們美化居室環境的重要一環， 但裝修的同時也引發了嚴重的室內環境污染問題。造成室內空氣污染最具有代 表性的化學物質是甲醛。由于裝修和家具制造要使用大量人造板材，而生產人 造板材需大量使用毒性高的甲醛為原料制造的膠粘劑，膠粘劑中的甲醛釋放期 很長， 一般長達15年，導致甲醛成為室內空氣中的主要污染物。
研究表明，甲醛具有強烈的致癌和促癌作用。大量文獻記載，其濃度達到
0.06 -0.07 mg/ 1113時，兒童就會發生輕微氣喘。濃度高時，可引起惡心嘔吐， 咳嗽胸悶，氣喘甚至肺水腫。長期接觸低劑量甲醛可引起慢性呼吸道疾病，引 起鼻咽癌、白血病，青少年記憶力和智力下降等。在所有接觸者中，兒童和孕 婦對甲醛尤為敏感，危害也就更大。
目前，常見居室甲醛污染凈化措施主要有三類。 一是通過電動風扇的循環作
用和過濾吸附裝置實現快速清除污染物的產品，但耗能較大，尤其是針對裝修導
致的污染，需要常年運行，成本較高。在污染物發散后期，因污染濃度降低，這種
措施的效果也會隨之降低。二是使用化學或天然產物，通過揮發或涂抹的方式降
解。吸附或以芳香氣味遮蓋有害氣體的產品，具有原理不可知性、操作煩瑣和潛
在二次污染等特點，近年來已經逐步退出市場。三是用納米Ti02催化氧化或臭
氧氧化法:實驗表明在紫外光條件下,濃度小于10mg/ m 3的甲醛能被完全凈化，
但用太陽光照射時，凈化效率僅為35 %。納米Ti02催化氧化法必須用納米Ti02
和紫外光，這將使此方法推廣帶來經濟和技術的局限性;臭氧法凈化效率低，同
時臭氧易分解，不穩定。近年來，利用植物凈化空氣的報道逐漸增多。美國科學家威廉，沃維爾經 過多年測試，發現很多種綠色植物都能一定程度地吸收空氣中的化學物質并將 它們轉化為自己的養料。

發明內容
本發明是將3-己酮糖-6-磷酸合酶基因的表達盒與6-磷酸-3-己酮糖異構酶 基因的表達盒重組，構建同化甲醛基因植物表達載體。
上述的目的通過以下的技術方案實現
同化甲醛基因植物表達載體，其組成包括在植物細胞中葉片特異表達型 的啟動子、組成型表達的啟動子、葉綠體轉運肽、3-己酮糖-6-磷酸合酶基因、 6-磷酸-3-己酮糖異構酶、終止子和篩選標記基因，將3-己酮糖-6-磷酸合酶基 因、6-磷酸-3-己酮糖異構酶基因重組到植物細胞表達的載體上，該載體的轉基 因植物葉綠體含有3-己酮糖-6-磷酸合酶、6-磷酸-3-己酮糖異構酶。
所述3-己酮糖-6-磷酸合酶基因表達產物為3-己酮糖-6-磷酸合酶，3-己 酮糖-6-磷酸合酶基因的5'端組裝葉綠體特異表達型啟動子PrbcS，它能使3-己酮糖-6-磷酸合酶基因在植物葉綠體細胞特異表達，3-己酮糖-6-磷酸合酶基 因的3'端組裝了nos終止子。
所述6-磷酸-3-己酮糖異構酶基因的表達產物為6-磷酸-3-己酮糖異構酶。
其特征在于6-磷酸-3-己酮糖異構酶基因的5'端組裝CaMV35S啟動子和葉綠體 轉運肽核苷酸序列，它們能使6-磷酸-3-己酮糖異構酶基因在植物葉綠體特異表 達；6-磷酸-3-己酮糖異構酶基因的3'端組裝了polyA終止子。
所述的基因重組方式是將3-己酮糖-6-磷酸合酶基因的表達盒與6-磷酸-3-己酮糖異構酶的表達盒串聯，使3-己酮糖-6-磷酸合酶基因與6-磷酸-3-己酮糖 異構酶基因在植物葉綠體特異表達。
所述的篩選基因是將所述載體的質粒組裝潮霉素B磷酸轉移酶基因(/^//7) 基因，作為轉基因植物的篩選標記，可以用潮霉素進行篩選。
所述的同化甲醛基因，3-己酮糖-6-磷酸合酶基因、6-磷酸-3-己酮糖異構酶 基因可以來自專性甲基營養菌，也可以來自兼性甲基營養菌及其他細菌。
技術方案有以下有益效果1. 本發明所述載體含有的兩個基因表達的產物可以定位到植物葉綠體細 胞，其產物可以同化甲醛進入到植物光合作用的卡爾文循環，使其轉化為植物 生長的養料，將該載體轉化具有經濟價值的觀賞花卉植物，從而提高其同化甲 醛的能力，對于凈化空氣甲醛污染具有重要的意義。
2. 以往通過電動風扇的循環作用和過濾吸附裝置實現快速清除污染物的 產品，耗能較大,尤其是針對裝修導致的污染，需要常年運行，成本較高。在污染 物發散后期，因污染濃度降低，這種措施的效果也會隨之降低。本發明利用光合 作用將甲醛同化，將甲醛轉化為植物的養料，進行良性的循環，而且作用持久。
3. 以往使用化學或天然產物，通過揮發或涂抹的方式降解、吸附或以芳香氣 味遮蓋有害氣體的產品，具有原理不可知性、操作煩瑣和潛在二次污染等缺點， 與此相比，本發明采用純生物過程，將微生物代謝甲醛的關鍵酶引入植物，原 理清楚，無毒、無害、無異味，不會造成二次污染，而且操作簡便。
4. 以往用納米Ti02催化氧化法凈化甲醛廢氣，必須用納米Ti02和紫外 光,具有經濟和技術的局限性，不易推廣。而臭氧法凈化效率低，同時臭氧易分
解，不穩定。本發明將微生物代謝甲醛的關鍵酶引入植物表達載體，用該載體的 轉基因植物凈化甲醛污染，具有成本低、效果持久、穩定性好和操作方便等優 點。
5. 對于短時間內產生的高濃度甲醛污染，居室內有限的天然觀賞植物顯然 不能立即清除。從生物學本能來看，植物對有害于生物的化學氣體可能過多地吞 噬，而且在吸入一定量后會導致中毒或影響生長。所以，要利用居室內有限的植 物，凈化被嚴重污染的空氣，就需要強化植物的這種功能，使之凈化效果更高， 自身的耐受能力更強，本發明為利用植物基因工程技術來實現這一目標提供了 可能。
6. 3-己酮糖-6-磷酸合酶和6-磷酸-3-己酮糖異構酶是核酮糖單磷酸途徑 的關鍵酶。該途徑最初是在甲基營養菌中發現的，但是最近的數據表明固定甲 醛的反應分布更廣泛，不僅是甲基營養菌，與3-己酮糖-6-磷酸合酶和6-磷酸 -3-己酮糖異構酶基因同源的基因也在許多非甲基營養生物中發現，包括細菌和 古生菌，其分布廣泛，不用浪費廣大的人力物力去尋找同源基因。
7. 在植物光合作用的卡爾文循環中存在核酮糖-5-磷酸Ru5P，甲醛與Ru5P在3-己酮糖-6-磷酸合酶作用下，可以合成3-己酮糖-6-磷酸Hu6P，在6-磷酸 -3-己酮糖異構酶的作用下Hu6P可以轉化為果糖-6-磷酸，而果糖-6-磷酸可以 繼續加入到光合作用的卡爾文循環中。所以，如果把3-己酮糖-6-磷酸合酶和 6-磷酸-3-己酮糖異構酶基因導入到植物葉綠體基因組，則可以將3-己酮糖-6-磷酸合酶和3-己酮糖-6-磷酸異構酶在葉綠體內大量表達，通過光合作用把甲醛 同化，使甲醛成為植物可以利用的養料，從而可以實現利用葉綠體轉基因植物 凈化甲醛污染的目的，為降低空氣甲醛污染創造一條嶄新的途徑。
這兩個關鍵酶可以同化甲醛進入到植物光合作用的卡爾文循環，使甲醛轉 化為植物生長的養料。將該載體轉化具有經濟價值的觀賞花卉植物，從而提高 植物同化甲醛的能力，對于凈化空氣甲醛污染具有重要的意義。


附圖1本發明同化甲醛基因植物表達載體pBIRYG的構建路線圖。
附圖2載體pBIRYG的構建過程中涉及到的pBluescriptlISK(+)、 pRBykG
載體圖譜。
附圖3載體pBIRYG的構建過程中涉及到的載體pBI121、 pBIRYG圖譜。 附圖4本發明同化甲醛基因植物表達載體pCMTPYF的構建路線圖。 附圖5載體pCMTPYF的構建過程中涉及到的pBluescript SK(+)、 pTP載 體圖譜。
附圖6載體pCMTPYF的構建過程中涉及到的pHS、 pCAMBIA1300載體圖譜。 附圖7載體pCMTPYF的構建過程中涉及到的pTPykF、 pC35載體圖譜。 附圖8載體pCMTPYF的構建過程中涉及到的pC35TPykF、 pCMTPYF載體圖譜。
附圖9本發明同化甲醛基因植物表達載體pCMGF的構建路線圖。 附圖IO本發明同化甲醛基因植物表達載體pCMGF圖譜。
具體實施例方式
實施例l:
同化甲醛基因植物表達載體pBIRYG的構建1.1 3-己酮糖-6-磷酸合酶(yckG)基因的克隆
根據GenBank中登錄的枯草芽孢桿菌的3-己酮糖-6-磷酸合酶基因(以下簡 稱yckG)序列設計引物P1，P2 (引物序列見表1. 1. 1) , Pl的5'端加上Sphl 酶切位點，P2的5'端加上PstI酶切位點，通過PCR的方法(PCR反應體系見 表1.1.2， PCR擴增條件見表1.1.3)擴增到500bp的片段。經測序(送交上海 生工)，該基因片段為527bp，與GenBank登錄的yckG基因的序列完全相同。 表1. 1. 1 PCR引物P1，P2序列 P1:5' -ATCGCATGCATGGAATTACAGCTTGC-3' P2:5 ， -CACCTGCAGTCAGGCTTTTGCTGGATC-3 ，
表1. 1.2 PCR反應體系 Template薩 1 u 1
10 x buffer 2.5ul dNTP Mix(2. 5mM) 2u 1
Primer 1(10uM) 1 U 1
Primer 2(10uM) 1 u 1
Ex Taq polymerase (5U/iil) 0. 5 u 1
ddH20 17 ul
Total 25ul 表l. 1.3 PCR擴增條件
94°C5min
94。C30s ，
55°C30s >
72 °C50s ^
72 。ClOmin
30 cycles
1. 2將yckG基因置于PrbcS啟動子下
將yckG基因用Sphl/PstI雙酶切(雙酶切反應及電泳體系見表1.2)，經
瓊脂糖凝膠電泳后，利用Gel Extraction kit (Takara， 以下同)回收530bp 的片段，將含有PrbcS啟動子的載體pRBCS也用Sphl/PstI雙酶切，回收4. 6kb 的片段，將此片段與yckG基因530bp的片段按摩爾比1: 3的比例在T4DNA連接酶的作用下連接30分鐘，將連接液轉化大腸桿菌DH5 a ，將轉化后的菌液均 勻涂于LB (50mg/LAmp)固體平板上過夜培養。挑取單菌落做菌落PCR(引物用 P1，P2，反應體系同上)，初步篩選克隆重組菌，獲得了 5個陽性克隆菌。再將 菌落PCR中的陽性克隆菌接種于LB (50mg/L Amp)液體培養基中，搖菌18小時， 堿裂解法提取質粒，用Pstl+Sphl雙酶切鑒定重組質粒，結果切出了 530bp的 片段，證明yckG基因已經成功地插入到pRBCS載體中，將此載體命名為pBRykG。 表1. 2 Sphl/Pstl雙酶切反應及電泳體系
質粒載體DNA 20 u 1
IOX反應緩沖液 5.0 ul
Hindin(雨/u 1) 2 y 1
Sphl (8U/ul) 2.5ul
ddH20 20. 5 iil
Total 50 yl
37。C條件下保溫3小時，然后用IXTAE(O. 04mol/L Tris-乙酸，0. 001mol/L EDTA)電泳緩沖液配置1. 0%瓊脂糖凝膠，在瓊脂糖中加入溴化乙錠(EB)至終 濃度為O. 5ug/ml，在3-5V/cm的電壓下電泳。
1.3將PrbcS-yckG片段克隆到pBI121載體
將pRByckG載體經HindlII/Smal酶切，電泳、回收包含PrbcS-yckG的片 段。將pBI121載體先用Sacl酶切，KOD DNA Polymerase (T0Y0B0)平滑(方法 見表1.3)，再用HindIII酶切，回收12, lkb片段，將此片段在T4DNA連接酶 的作用下與rbcS-yckG片段按摩爾比1: 3的比例連接，轉化大腸桿菌DH5 a ， 用與步驟②相同的方法做菌落PCR,得到3個陽性克隆，搖菌，堿裂解法提取質 粒，用HindlII+Sphl雙酶切鑒定重組質粒，結果切出了 2.4kb的片段，證明 PrbcS-yckG已經成功地插入到pBI121載體中，將此載體命名為pBIRYG。(雙酶 切、電泳、DNA片段回收方法同上) 表1.3 DNA片段末端的平滑
DNA片段 6n 1
10 Blunting Buffer 1 P 1
KOD Polymerase 114 1ddH20 2 u 1
Total 10 ill
實施例2 :同化甲醛基因植物表達載體pCMTPYF的構建 2.1葉綠體轉運肽(TP)核苷酸序列的擴增與克隆
根據GenBank中的登錄的大豆鐵蛋白基因序列設計引物P3， P4(引物序列見 表2. 1. 1)，P3的5，端加上BamHI酶切位點，P4的5'端加有PstI酶切位點。 通過PCR的方法(PCR反應體系同表1. 2, PCR擴增條件見表2. 1. 2)擴增到葉綠 體轉運肽(TP) 165bp的核苷酸序列，PCR產物經296的瓊脂糖凝膠電泳，將其用 Gel Extraction kit (Takara， 以下同)回收，用BamHI/Pstl雙酶切后克隆 到pBlueskript SK+載體的BamHI/Pstl位點，得pTP。
表2. 1. 1 PCR引物P3， P4序列
P3: 5' -AGTGGATCCATGGCTCTTgCTCCATCC-3，
P4: 5， -CTACTGCAGTGAGGCACAAACCCTAAG-3，
表2. 1.2 PCR擴增條件 94 。C 5min
94。C30s ，
55°C30s >30 cycles
72 。C20s
72°C10min
2.2 6-磷酸-3-己酮糖異構酶基因(yckF)的擴增與克隆
根據GenBank中的登錄的6-磷酸-3-己酮糖異構酶基因(以下簡稱yckF) 序列設計引物P5， P6 (引物序列見表2. 2) ， P5， P6的5'端都加有Pstl識別序 列，通過PCR的方法(PCR的反應體系與擴增條件參考表1. 2,表1. 3)擴增到 575bp的6-磷酸-3-己酮糖異構酶基因，將其克隆到pTP的Pstl位點，得 pTPyckF。
表2.2 PCR引物P5，P6序列
P5: 5' -G丁GCTGCAGATGAAAACGACTGAATAC-3，
P6: 5' -CTACTGCAGCTATTCAAGGTTTGCGTG-3'2.3 CaMV35S啟動子的克隆
將pHS用HindlII/BamHI酶酶切出837bp的CaMV35S啟動子序列，并將其 克隆到pCAMBIA1300的相應酶切位點，得pC35。
2.4 TP-yckF片段與CaMV35S啟動子的組裝
將pTPyckF用BamHI/EcoRI酶切，切出TP-yckF片段，將其克隆到pC35的 相應酶切位點，得pC35TPykF。 BamHI/EcoRI酶切切下740bp左右的條帶，說明 TP-yckF已經成功插入。
2. 5 polyA終止子的克隆與組裝
將pHS載體用EcoRI酶切，切出polyA終止子片段,將其克隆到pC35TPykF, 得pCMTPYF。
實施例3:同化甲醛基因植物表達載體pCMGF的構建
3. 1 PrbcS-yckG-nos表達盒的酶切、回收與平滑
將pBIRYG用HindlII/EcoRI酶切，切下2.8kb左右的PrbcS-yckG-nos條 帶，將其用Gel Extraction kit回收，并用KOD DNA Polymerase (T0Y0B0)進
行末端平滑。
3.2 pCAMTPF的酶切、回收與平滑
將pCAMTPF用Kpnl酶切后，將其用用Gel Extraction kit回收，KOD DNA Polymerase (T0Y0B0)進行末端平滑，去磷酸化(方法見表3.1)，與平滑好的 rbcS-yckG-nos片段進行連接，得pCMGF。
表3. 1堿性磷酸酶去磷酸化方法
在微量離心管中配置下列反應液，全量定容至50 P 1
DNA片段 10ul 10 x Buffer 5ul 堿性磷酸酶 1 P 1
dH20 34 ul
Total 50 ul
5(TC反應30分鐘，苯酚/氯仿/異戊醇(25: 24: 1)抽提2次，氯仿/異戊 醇(24: 1)抽提1次，添加5u 1的3M Na0AC，添加125u 1 (2. 5倍量)冷乙醇，在-20 。C下保冷40分鐘，離心分離收集沉淀，用200y 1的70%冷乙醇洗 凈后，減壓干燥，用15u 1的滅菌水溶解沉淀。
權利要求
1.一種同化甲醛基因植物表達載體，其組成包括在植物細胞中葉片特異表達型的啟動子、組成型表達的啟動子、葉綠體轉運肽、3-己酮糖-6-磷酸合酶基因、6-磷酸-3-己酮糖異構酶、終止子和篩選標記基因，其特征是將3-己酮糖-6-磷酸合酶基因、6-磷酸-3-己酮糖異構酶基因重組到植物細胞表達的載體上，該載體的轉基因植物葉綠體含有3-己酮糖-6-磷酸合酶、6-磷酸-3-己酮糖異構酶。
2. 根據權利要求l所述的同化甲醛基因植物表達載體，其特征是所述的 基因重組方式是將3-己酮糖-6-磷酸合酶基因的表達盒與6-磷酸-3-己酮糖異構酶 的表達盒串聯，使3-己酮糖-6-磷酸合酶基因與6-磷酸-3-己酮糖異構酶基因在植 物葉綠體特異表達。
3. 根據權利要求1或2所述的同化甲醛基因植物表達載體，其特征是所 述3-己酮糖-6-磷酸合酶基因表達產物為3-己酮糖-6-磷酸合酶，3-己酮糖-6-磷 酸合酶基因的5，端組裝葉綠體特異表達型啟動子PrbcS，它能使3-己酮糖-6-磷 酸合酶基因在植物葉綠體細胞特異表達，3-己酮糖-6-磷酸合酶基因的3，端組裝 了 nos 終止子。
4. 根據權利要求1或2所述的同化甲醛基因植物表達載體，其特征是所 述6-磷酸-3-己酮糖異構酶基因的表達產物為6-磷酸-3-己酮糖異構酶，6-磷酸-3-己酮糖異構酶基因的5，端組裝CaMV35S啟動子和葉綠體轉運肽核苷酸序列， 它們能使6-磷酸-3-己酮糖異構酶基因在植物葉綠體特異表達，6-磷酸-3-己酮糖 異構酶基因的3，端組裝了 polyA終止子。
5. 根據權利要求1或2所述的同化甲醛基因植物表達載體，其特征是所 述的篩選基因是將所述載體的質粒組裝潮霉素B磷酸轉移酶基因(hptll)基因， 作為轉基因植物的篩選標記，可以用潮霉素進行篩選。
6. 根據權利要求1或2所述的同化甲醛基因植物表達載體，其特征是所 述的同化甲醛基因，3-己酮糖-6-磷酸合酶基因、6-磷酸-3-己酮糖異構酶基因可 以來自專性甲基營養菌，也可以來自兼性甲基營養菌及其他細菌。
全文摘要
同化甲醛基因植物表達載體。本發明涉及一種同化甲醛基因植物表達載體。利用植物凈化甲醛成本低、效果持久、操作方便，但能夠凈化甲醛的植物種類不多，天然植物凈化甲醛的能力也非常有限。本發明其組成包括在植物細胞中葉片特異表達型的啟動子、組成型表達的啟動子、葉綠體轉運肽、3-己酮糖-6-磷酸合酶基因、6-磷酸-3-己酮糖異構酶、終止子和篩選標記基因，將細菌代謝甲醛的關鍵酶基因3-己酮糖-6-磷酸合酶基因、6-磷酸-3-己酮糖異構酶基因重組到植物細胞表達的載體上。該載體的轉基因植物葉綠體將含有這兩個酶，它們可以同化甲醛進入到植物光合作用的卡爾文循環，使甲醛轉化為植物生長的養料。本品用于制造凈化甲醛污染的轉基因植物。
文檔編號C12N15/82GK101314779SQ20071007228
公開日2008年12月3日 申請日期2007年5月30日 優先權日2007年5月30日
發明者亮 司, 爽 張, 毛文艷, 郭長虹 申請人:哈爾濱師范大學