專利名稱：家蠶滯育品種的低溫催青轉基因方法
技術領域：
本發明涉及生物技術、生物工程領域，特別是涉及一種家蠶滯育品種的低溫催青轉基 因方法。
背景技術：
轉基因技術是現代生物學研究中的一項重要的技術，在功能基因研究、生物新產品開 發、生物素材創新、現代遺傳育種等方面發揮著重要的作用。
家蠶是重要的經濟昆蟲和鱗翅目昆蟲模式生物。隨著家蠶基因組測序工作的完成，利 用高效穩定的技術大規模地研究重要基因的功能成為家蠶功能基因組時代的重要課題，同 時，家蠶是理想的"昆蟲工廠"，利用現代基因工程技術開發絲腺生物反應器具有巨大的 市場前景。而家蠶轉基因技術是探索家蠶生長發育奧秘、拓展蠶業產業鏈、促進科技成果 實用化的有利武器。
自2000年日本科學家報道首次成功培育轉基因家蠶以來，國內外已陸續報道轉基因家 蠶成功的消息。但是迄今為止的報道中，所有轉基因實驗都是利用家蠶多化性品系的非滯 育卵，主要是因為多化性家蠶品種所產的卵為生種卵，其不需要任何的人工處理便能夠在 適當的溫濕度下連續發育直至孵化，這個特點極大地方便了轉基因實驗中的操作控制和轉 基因后的進一步實驗研究。但這些多化性家蠶品系與滯育性的生產上的家蠶實用品種比 較，具有絲量少，絲質差等經濟性狀差的特點。故利用多化性家蠶品種作為轉基因的材料
具有以下兩個方面的明顯缺陷①多化性家蠶品種經濟性狀差，利用轉基因所創造的附加
性狀在產量和質量上都無法達到直接推廣應用的標準，以多化性蠶種為原始材料的轉基因 品系只能作為育種原始材料，作為某一相關優良性狀的原始載體的角色運用于漫長而艱辛 的傳統育種之中。②多化性家蠶品種不具有滯育期，對其繼代維持只能依靠連續的飼養繁 殖，這樣需要浪費大量的人力和物力對獲得的轉基因家蠶品系進行維持和繼代，同時也大 大增加了獲得的轉基因家蠶品種資源丟失的風險。因此，利用多化性家蠶品種不但不利于 進行大規模的轉基因實驗，而且很難使研究成果快速轉化到生產實際中去。
家蠶滯育品種為一化或二化性品系，在產卵以后便進入一個比較漫長的滯育期，這樣 極有利于它們維持和繼代。另外生產上的實用家蠶品系幾乎都是滯育品系，多為一化或二 化性品系。如利用普通的家蠶滯育品系進行轉基因研究可以克服多化性家蠶品種轉基因研
究中所述的第二個缺陷，而利用生產上的實用家蠶滯育品系原種進行轉基因研究則可以克 服多化性家蠶品種轉基因研究中所述的所有缺陷。因此，家蠶滯育品種的轉基因研究具有 極為重要理論和實際意義。生產實際中，滯育卵一般在產卵后約16-20小時左右利用常規 的即時浸酸法能有效解除它們的滯育。而目前最有效的家蠶轉基因顯微注射時間是在產卵 后3-6小時，因為轉基因操作后卵上會上留下注射小孔，如果在注射后利用常規的即時浸 酸法會導致鹽酸滲入蠶卵內，從而致死，根本無法實現家蠶滯育品種的轉基因研究。因此， 家蠶滯育品種卵的滯育，給轉基因操作帶來很大的限制。
到目前為止，滯育性家蠶品種的轉基因技術在國內外還未見報道，更沒有一種成熟可 靠的方法實現家蠶滯育品種的轉基因，因此，探索家蠶滯育品種的轉基因的方法，是簡化 家蠶轉基因技術、加速科技成果實用化的迫切要求。

發明內容
本發明的目的在于提供一種家蠶滯育品種的轉基因蠶的制作路線方法。該路線方法利 用特殊的催青條件改變家蠶滯育品種下一代蠶卵的化性，使特殊的催青條件下獲得的當代 家蠶滯育品種蠶蛾交配，產下非滯育的下一代蠶卵，最后參照非滯育家蠶卵胚胎顯微注射 的轉基因方法進行轉基因，從而巧妙地突破家蠶滯育品種轉基因技術的障礙并有效制作轉
基因蠶。
本發明首次系統地調査了低溫催青對家蠶滯育品種下一代蠶卵化性的改變，并獲得了 通過低溫催青使家蠶滯育品種產下非滯育的下一代蠶卵的條件，并將這項技術與家蠶胚胎 顯微注射技術，熒光檢測與分子生物操作技術相結合，巧妙地突破了家蠶滯育品種轉基因 技術的瓶頸，建立了一種可靠的家蠶滯育品種的轉基因技術路線方法。
本發明家蠶滯育品種的低溫催青轉基因方法，依次通過以下步驟實現
(l)將家蠶滯育品種的蠶卵通過人工孵化處理后，置于15。C恒溫、相對濕度75%的環 境中催青至孵化，孵化的蟻蠶在常規條件下進行飼養；
(2) 在25。C的種繭保護溫度下收集同時化蛾的雌雄蠶蛾，在25'C、弱光的條件下交配 4h后拆對，并將雌蛾投放于上漿的蠶連紙上，在黑暗的環境中產卵，每間隔lh收集一次 蠶卵，并將收集的蠶卵置于25'C的環境中保護；
(3) 將蠶卵連同蠶連紙片用自來水沖洗以后，于蒸餾水中浸泡2-3min，而后用鑷子將 蠶卵轉移至用75%酒精消毒的載玻片上，并按照蠶卵腹面向右的標準將其排列整齊，排列 好的蠶卵置于35-37%的甲醛蒸氣中消毒5min;
(5)以收集時間開始記時，于收集后3h-6h用顯微注射儀將10-15nl、總濃度400ng/ul
的轉座載體質粒從蠶卵腹面中央注入已經消毒的蠶卵中，并用無毒的膠水封閉卵殼注射留 下的小孔；
(
6)將注射完成的蠶卵在35-37y。的甲醛蒸氣中消毒5min后，置于25'C、相對濕度85% 以上的濕度條件下，進行催青直到孵化，飼養孵化出來的蟻蠶，將當代(GO)的蠶蛾進行 自交或回交，獲得G1代蠶卵，掃描G1代蠶卵獲得轉基因個體；最后，獲得的轉基因個 體正常詞養、傳代，即完成家蠶滯育品種的轉基因蠶的制作。
h表示小時，min表示分鐘。
本發明的優點是-
本發明關于家蠶滯育品種的轉基因蠶的制作方法，首次利用低溫催青使家蠶滯育品種 產下的蠶卵為非滯育卵，然后參照非滯育卵轉基因家蠶顯微注射的制作方法，從而巧妙地 突破了家蠶滯育品種的轉基因技術的瓶頸。本發明的優點是，利用上述技術路線，可以有 效地實現家蠶滯育品種轉基因。而利用家蠶滯育品種創造的轉基因蠶品系，可以克服多化 性品系轉基因家蠶的所有缺點，其具有以下的明顯優勢①家蠶滯育品種，尤其是生產上 采用的實用性品種，各種經濟性狀都比較良好，外源或內源的轉基因目標性狀也非常優良， 在利用這些家蠶品種作為生物反應器時，其目的產物的產量與質量遠遠超過多化性品系的 轉基因家蠶；②現今蠶業生產中所采用的蠶品種多為滯育性的一化或二化性品種，在利用 轉基因技術創造新的遺傳素材或品種資源時，直接采用生產中普遍使用的實用性家蠶滯育 品種作為原始材料，可以避免漫長而煩瑣的育種過程，直接利用轉基因技術創造出各種性 狀優良的新的特殊家蠶品種，大大的縮短了育種的周期，也節約了大量的人力和物力；③
滯育性家蠶在自然條件下一年繁殖一個或兩個世代以后便自動進入一個漫長的滯育期，要 保存其品種資源只需要在一年內進行一次或兩次的飼養和簡單的蠶種管理即可，對其生產
和管理可以根據計劃的需要人為地進行調節，而且實用性家蠶品種的各項性狀通過長期育 種的選擇，都比較穩定，所以利用這些家蠶滯育品種作為家蠶轉基因研究的材料，可以簡 化資源保存的工作，降低品種資源丟失的風險，增強轉基因工作的計劃性，使轉基因工作 與實際生產更加緊密地結合。④家蠶滯育品種，特別是生產上的實用滯育品種一般個體較 大，其蠶卵也遠大于一般的多化性家蠶品種，抗逆性強，具有耐注射的特性。此外，家蠶 滯育品種的蠶卵一般具有一層著色的漿膜，可以降低熒光檢測時激發光對胚胎的傷害，這 些特點都降低了家蠶轉基因操作的難度，有助于轉基因的成功。所以本發明還具有適合廣 泛而有效地推廣的優點。
具體實施方式
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實施例1:
利用家蠶滯育品種"大造"作為原始材料，將正常飼養所得的蠶卵在常規的人工孵化
處理后全程置于15'C恒溫、相對濕度75%的環境中催青至孵化，孵化的蟻蠶在正常條件下
進行飼養，將當代的蠶蛾如前述方法進行自交，獲得下一代非滯育蠶卵，這些蠶卵于產下
后3h，用Eppendorf顯微注射儀，將10-15nl、總濃度400ng/ul的帶有神經和眼睛特異 啟動子啟動的紅色熒光蛋白標記的piggyBac載體和輔助載體，共同注射進入601粒蠶卵 中，用無毒膠水封住注射口，并經35。/。的甲酵蒸氣中消毒5min以后，置于25'C、相對濕 度85%的高濕度環境中催青孵化，將孵化的350頭GO代蟻蠶用人工飼料收集飼養至化蛾， 獲得的301頭GO代蠶蛾，通過自交或回交共獲得157蛾圈Gl代蠶卵，用01ympu^電動 宏觀熒光顯微鏡觀察篩選了 64蛾圈Gl代蠶卵并獲得29個陽性蛾圈，共獲得182頭家蠶 滯育品種"大造"的轉基因蠶，轉化效率為45.31%。
實施例2:
利用家蠶滯育品種"大造"作為原始材料，將正常飼養所得的蠶卵在常規的人工孵化 處理后先置于25。C恒溫、相對濕度85%條件下催青5天，然后置于15'C恒溫、相對濕度 75%的環境中催青至孵化，孵化的蟻蠶在正常條件下進行飼養，將當代的蠶蛾如前述方法 進行自交，獲得下一代非滯育蠶卵，這些蠶卵于產下后4h，用E卯endorf顯微注射儀，將 10-15nl、總濃度400ng/ul的帶有神經和眼睛特異啟動子啟動的紅色熒光蛋白標記的 PiggyBac重組轉座載體和輔助載體，共同注射進入596粒蠶卵中，用無毒膠水封住注射口 ， 并經37%的甲醛蒸氣中消毒5min以后，置于25'C、相對濕度90%的高濕度環境中催青孵化， 將孵化的297頭GO代蟻蠶用人工飼料收集飼養至化蛾，獲得的268頭GO代蠶蛾通過自交 或回交共獲得119蛾圈Gl代蠶卵，用01y即us⑧電動宏觀熒光顯微鏡觀察篩選了 51蛾圈 Gl代蠶卵并獲得12個陽性蛾圈，共獲得34頭家蠶滯育品種"大造"的轉基因蠶，轉化效 率為23. 53%。
實施例3:
利用家蠶滯育品種"夏芳"作為原始材料，將正常飼養所得的蠶卵在常規的人工孵化 處理后先置于25。C恒溫、相對濕度85%條件下催青6天，然后置于15。C恒溫、相對濕度 75%的環境中催青至孵化，孵化的蟻蠶在正常條件下進行飼養，將當代的蠶蛾如前述方法 進行自交，獲得下一代非滯育蠶卵，這些蠶卵于產下后6h，用E卯endorf顯微注射儀，將 10-15nl、總濃度400ng/ul的帶有神經和眼睛特異啟動子啟動的紅色熒光蛋白標記的 piggyBac重組轉座載體和輔助載體，共同注射進入810粒蠶卵中，用無毒膠水封住注射口 ，并經36%的甲酸蒸氣中消毒5min以后，置于25°C、相對濕度95%的高濕度環境中催青孵化， 將孵化的605頭G0代蟻蠶用人工詞料收集飼養至化蛾，獲得的439頭GO代蠶蛾通過自交 或回交共獲得146蛾圈Gl代蠶卵，用01ympu^電動宏觀熒光顯微鏡觀察篩選了 100蛾圈 Gl代蠶卵并獲得16個陽性蛾圈，共獲得59頭家蠶滯育品種"夏芳"的轉基因蠶，轉化效 率為16%。
實施例4:
利用家蠶滯育品種"洞/庭"作為原始材料，將正常飼養所得的蠶卵在常規的人工孵 化處理后全程置于15'C恒溫、相對濕度75%的環境中催青至孵化，孵化的蟻蠶在正常條件 下進行飼養，將當代的蠶蛾如前述方法進行自交，獲得下一代非滯育蠶卵，這些蠶卵于產 下后5h，用Eppendorf顯微注射儀，將10-15nl、總濃度400ng/ul的帶有神經和眼睛特 異啟動子啟動的紅色熒光蛋白標記的piggyBac轉座載體和輔助載體，共同注射進入714 粒蠶卵中，用無毒膠水封住注射口，并經36y。的甲醛蒸氣中消毒5min以后，置于25'C、 相對濕度95%的高濕度環境中催青孵化，將孵化的356頭G0代蟻蠶用人工詞料收集飼養至 化蛾，獲得的238頭G0代蠶蛾通過自交或回交共獲得92蛾圈G1代蠶卵，用0171^113 電 動宏觀熒光顯微鏡觀察篩選了 27蛾圈Gl代蠶卵并獲得8個陽性蛾圈，共獲得102頭家蠶 滯育品種"洞/庭"的轉基因蠶，轉化效率為29.62%。
權利要求
1、一種家蠶滯育品種的低溫催青轉基因方法，其特征在于依次通過下列步驟實現(1)將家蠶滯育品種的蠶卵通過人工孵化處理后，置于15℃恒溫、相對濕度75％的環境中催青至孵化，孵化的蟻蠶在常規條件下進行飼養；(2)在25℃的種繭保護溫度下收集同時化蛾的雌雄蠶蛾，在25℃、弱光的條件下交配4h后拆對，并將雌蛾投放于上漿的蠶連紙上，在黑暗的環境中產卵，每間隔1h收集一次蠶卵，并將收集的蠶卵置于25℃的環境中保護；(3)將蠶卵連同蠶連紙片用自來水沖洗以后，于蒸餾水中浸泡2-3min，而后用鑷子將蠶卵轉移至用75％酒精消毒的載玻片上，并按照蠶卵腹面向右的標準將其排列整齊，排列好的蠶卵置于35-37％的甲醛蒸氣中消毒5min；(5)以收集時間開始記時，于收集后3h-6h用顯微注射儀將10-15nl、總濃度400ng/ul的轉座載體質粒從蠶卵腹面中央注入已經消毒的蠶卵中，并用無毒的膠水封閉卵殼注射留下的小孔；(6)將注射完成的蠶卵在35-37％的甲醛蒸氣中消毒5min后，置于25℃、相對濕度85％以上的濕度條件下，進行催青直到孵化，飼養孵化出來的蟻蠶，將當代(G0)的蠶蛾進行自交或回交，獲得G1代蠶卵，掃描G1代蠶卵獲得轉基因個體；最后，獲得的轉基因個體正常飼養、傳代，即完成家蠶滯育品種的轉基因蠶的制作。h表示小時，min表示分鐘。
全文摘要
一種家蠶滯育品種的低溫催青轉基因方法。用特殊的催青條件改變家蠶滯育品種下一代蠶卵的化性，使特殊的催青條件下獲得的當代家蠶滯育品種蠶蛾交配，產下非滯育的下一代蠶卵，最后參照非滯育家蠶卵胚胎顯微注射的轉基因方法進行轉基因，從而巧妙地突破家蠶滯育品種轉基因技術的障礙并有效制作轉基因蠶。該方法直接采用生產中普遍使用的實用性家蠶滯育品種作為原始材料，可以避免漫長而煩瑣的育種過程，直接利用轉基因技術創造出各種性狀優良的新的特殊家蠶品種，可大大縮短育種的周期，節約大量的人力和物力。
文檔編號C12N15/85GK101195833SQ20071030390
公開日2008年6月11日 申請日期2007年12月21日 優先權日2007年12月21日
發明者向仲懷, 夏慶友, 徐漢福, 趙愛春, 成 魯 申請人:西南大學;重慶拓桑生物科技有限公司