專利名稱：環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)剛地弓形蟲的試劑盒及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于測(cè)定微生物的試劑盒和檢測(cè)方法，具體涉及一種環(huán) 介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)剛地弓形蟲的試劑盒及方法. 背景技術(shù)剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii, TOX)是貓科動(dòng)物的腸il^蟲，由法 國(guó)學(xué)者Nicolle及Manceaux在剛i^趾鼠的脾臟單核細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)，蟲體呈弓 形，故命名為剛地弓形蟲，該蟲呈世界性分布，人和許多動(dòng)物都能感染。傳 統(tǒng)的檢測(cè)方法有形態(tài)學(xué)診斷、免疫學(xué)檢測(cè)等.其中形態(tài)學(xué)的診斷方法最為可 靠，但費(fèi)時(shí)且易漏檢；免疫學(xué)方法并非直接檢測(cè)病原體，敏感性較低且特異 性不足。以核酸擴(kuò)增(Polymerase Chain Reaction, PCR)為基礎(chǔ)的分子生 物學(xué)技術(shù)的i2AS^艮，為弓形蟲的檢測(cè)提供了一種快速、靈敏的方法，但普 通PCR假陽性太高，不適合臨床使用，熒光定量PCR具有靈敏、準(zhǔn)確的優(yōu) 點(diǎn)，但采用TaqMan探針法費(fèi)用較高，采用熒光染料SYBR Green I可能與 非特異性雙鏈DNA結(jié)合容易產(chǎn)生假陽性。環(huán)介導(dǎo)等'溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP )不 需PCR經(jīng)過的變性、復(fù)性、5!伸三個(gè)階段，可在等溫^Hf下1小時(shí)內(nèi)將目 的序列擴(kuò)增109倍以上，因此不需特殊i更備，檢測(cè)時(shí)間更短、敏感性更高； 同時(shí)4條特異性引物識(shí)別把基因的6個(gè)特定區(qū)域，特異性更高，因此在M 物檢測(cè)上明顯優(yōu)于PCR (Notomi T， Okayama H， Masubuchi H， et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res, 2000， 28: E63.)。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是提供一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)剛地弓形蟲的試劑盒及方 法，解決了普通PCR存在的假陽性高和熒光定量PCR存在的費(fèi)用高的問題。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是 一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè) 剛地弓形蟲的引物，由一對(duì)外引物和一對(duì)內(nèi)引物組成，其序列為外引物1: GGGAATGAAAGAGACGCTAA外引物2: CTGTGTACCTCTTCTCGTATT內(nèi)引物1: TGCACAGATACTCATGAATTTCACTGTTTGCATAGGTTGCAGTC 內(nèi)引物2: ACTTTGGTGTATTCGCAGATTGGTTCACGATCTTCTTCTCCTG其中，所述的一對(duì)外引物與一對(duì)內(nèi)引物的摩爾數(shù)之比為1: 6~9。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是 一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè) 剛地弓形蟲的試劑盒，其特征在于由一套引物、IO倍環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增M 液、DNA聚合酶、陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和顯色劑組成；所述的一套引物是 由一對(duì)外引物和一對(duì)內(nèi)引物組成，其序列為外引物1: GGGAATGAAAGAGACGCTAA外引物2: CTGTGTACCTCTTCTCGTATT內(nèi)引物1: TGCACAGATACTCATGAATTTCACTGTTTGCATAGGTTGCAGTC 內(nèi)引物2: ACTTTGGTGTATTCGCAGATTGGTTCACGATCTTCTTCTCCTG 其中，所述的一對(duì)外引物與一對(duì)內(nèi)引物的摩爾數(shù)之比為l: 6~9;所述的 DNA聚合酶為具有鏈置換作用的Bst DNA聚合酶，活力為8個(gè)活性單位/微 升；所述的陽性對(duì)照為含有插入剛地弓形蟲一段特異序列的陽性質(zhì)粒，環(huán)介 導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)擴(kuò)增區(qū)位于該特異序列中，其濃度為107拷貝"1;所述的陰 性對(duì)照為滅菌雙蒸水；所述的顯色劑為20倍SYBR Green I.1、 上述方案中，所述的10倍環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液(通常用"10 x LAMP 反應(yīng)液"的形式M示，數(shù)字"10"表示的是使用時(shí)稀釋的倍數(shù))是由200 mM 三羥曱基^^曱烷鹽酸鹽、100mM氯化鉀、100mM硫酸銨、40 100mM硫 酸鎂、4 ~ 10M甜菜堿、5 ~ 18mM的dNTPs、和1%質(zhì)量百分濃度的曲#^1 X-100組成。2、 上述方案中，所述的陽性質(zhì)粒的制作方法為采用PCR擴(kuò)增一段剛地 弓形蟲基因特異序列，然后t、PMD18-T栽體，轉(zhuǎn)化至DH5a感受態(tài)細(xì)菌， 抽取質(zhì)粒DNA經(jīng)序列確M，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒DNA的濃度并 用滅菌雙蒸水調(diào)整拷貝數(shù)至107拷貝/ n 1。3、 上述方案中，所述的dNTPs為含有四種dNTP的等量混合物。4、 上述方案中，所述的mM晃學(xué)爾濃度的單位，指的是每升溶液中所含 有溶質(zhì)的摩爾數(shù)。5、 上述方案中，所述的SYBR Green I為高靈敏度的DNA熒光染料， SYBR Green I與雙鏈DNA的親和力非常高。對(duì)分子生物學(xué)中常用的酶沒有 抑制作用。本發(fā)明工作原理是環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)過程是先由外引物擴(kuò)增出內(nèi)引 物擴(kuò)增所需要的模板即起始反應(yīng)物模板的合成；緊接著由內(nèi)引物引導(dǎo)合成把 基因DNA片段，由于內(nèi)引物擴(kuò)增的DNA片段含有該引物5，端DNA片段的反向互補(bǔ)序列，因而這些反向互補(bǔ)序列之間通過雜交形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，另外一條內(nèi)引物與其互#^退火雜^引導(dǎo)鏈置換合^^，在擴(kuò)增的DNA片段 的另外一端產(chǎn)生了新的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，形成吸鈴狀結(jié)構(gòu)，在一小時(shí)內(nèi)該循環(huán)M 可使把DNA累積到109拷貝，電泳后可見擴(kuò)增終產(chǎn)物由大小不等的DNA片 段組成，呈梯狀條帶，也可通過熒光染料;^察擴(kuò)增結(jié)果。LAMP的整個(gè)反 應(yīng)分三步完成，即起初反應(yīng)物模板的合成、循環(huán)擴(kuò)增階段、延伸和再循環(huán)。 由于上述技術(shù)方案運(yùn)用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn)和效果1、 本發(fā)明利用BstDNA酶的鏈置換特性，設(shè)計(jì)4條引物，識(shí)別把序列的 6個(gè)區(qū)域，在等溫條件下生成大量重復(fù)的莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)，在定性檢測(cè)時(shí)不需任 何特殊設(shè)備。2、 本發(fā)明的特異性、敏感性均高于普通PCR技術(shù)。3、 本發(fā)明由于不需經(jīng)過PCR技術(shù)的3個(gè)溫度的重復(fù)循環(huán)，檢測(cè)時(shí)間比 PCR短。4、 本發(fā)明的結(jié)果判斷不需經(jīng)電泳，比PCR簡(jiǎn)單，極易推廣。對(duì)于定量 檢測(cè)，雖然借助了熒光定量PCR儀，但不需合成熒光探針，只需借助熒光 染料SYBR Green I，成本大大減低。5、 本發(fā)明的M溫度在601C 65TC左右，且識(shí)別乾基因6個(gè)特定區(qū)域， 引物多聚體及非特異性擴(kuò)增幾率大大降低，定量準(zhǔn)確性大大提高。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述實(shí)施例一 一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增定性檢測(cè)剛地弓形蟲的方法，該方法采 用的試劑盒由一套引物、IO倍LAMPJUL液、DNA聚合酶、陽性對(duì)照、陰 性對(duì)照和顯色劑組成.引物的序列為外引物1: GGGAATGAAAGAGACGCTAA外引物2: CTGTGTACCTCTTCTCGTATT內(nèi)引物1: TGCACAGATACTCATGAATTTCACTGTTTGCATAGGTTGCAGTC 內(nèi)引物2: ACTTTGGTGTATTCGCAGATTGGTTCACGATCTTCTTCTCCTG 其中， 一對(duì)外引物的摩爾數(shù)為5 pmol， 一對(duì)內(nèi)引物的摩爾數(shù)為30 pmol (摩爾數(shù)之比為1: 6 )。 10 x LAMP反應(yīng)液由200mM三鞋甲差^氨基甲烷鹽 酸鹽(Tris-HCL )、 100mM氯化鉀(KCL )、 100mM硫酸銨((NH4 ) 2S04 )、 80mM硫酸鎂(MgS04 )、 8M甜菜堿(Betaine )、 14mM的dNTPs、和1% 的曲拉通X-100 (Triton X-100 )組成。所述的DNA聚合酶為Bst DNA聚合醃，8個(gè)活性單位/微升。陽性對(duì)照為含有插入剛地弓形蟲一段特異序列的陽 性質(zhì)粒，LAMP反應(yīng)擴(kuò)增區(qū)位于該特異序列中，濃度為107拷貝/|11。陰性 對(duì)照為滅菌雙蒸水。所述的顯色劑為20倍SYBR Green I應(yīng)用液(20 x SYBR Green I) 定性檢測(cè)剛地弓形蟲按照下列步JSMi行(1) 、 HL仿-異戊醇法提取剛地弓形蟲DNA， M于25ylTE中。(2) 、加樣在0.5mlEppendorf管中加入以下試劑10xLAMP反應(yīng)液(采用實(shí)施例一中的試劑盒) 2.5 Jil一對(duì)外引物 5pmo1一對(duì)內(nèi)引物 30pmo1提取的剛地弓形蟲DNA 5Ml滅菌雙蒸水 補(bǔ)至24 jii 1(3) 、反應(yīng)于95t:變性5分鐘，冷卻至室溫后加1 p 1 BstDNA酶，水 谷鍋中60 65"C恒溫反應(yīng)1小時(shí).(4) 、結(jié)果判斷反應(yīng)結(jié)束后加lnl顯色劑，于紫外燈下觀察，反應(yīng)液 的顏色變?yōu)榫G色說明檢測(cè)結(jié)果陽性，并與陽性對(duì)照和陰性對(duì)照進(jìn)行比較。本實(shí)施例中的一對(duì)外引物與一對(duì)內(nèi)引物的摩爾數(shù)之比可以選擇l: 7、 1: 8或1:9。 10 x LAMP反應(yīng)液中的硫酸鎂的摩爾濃度可以選擇40 mM、60 mM 或者是100 mM。甜菜堿的摩爾濃度可以選擇4 M、 7 M或者是10M。 dNTPs 的摩爾濃度可以選擇6mM、 10mM或者是18mM。實(shí)施例二 一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增定量檢測(cè)剛地弓形蟲的方法，由一套引 物、10xLAMP反應(yīng)液、DNA聚合酶、陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和顯色劑組成。 引物的序列與實(shí)施例一相同， 一對(duì)外引物和一對(duì)內(nèi)引物的摩爾IS:之比為1: 8。 10 x LAMP >6^液中的疏酸鎂(MgS04)為85mM 200mM，甜菜堿(Betaine) 為7M、 dNTPs為16mM，其它藥品的摩爾濃度與實(shí)施例一相同。DNA聚合 酶、陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和顯色劑也與實(shí)施例一相同。 定量檢測(cè)剛地弓形蟲按照下列步驟進(jìn)行(1)、 i^"氯仿-異戊醇法提取剛地弓形蟲DNA，保存于25plTE中。 (2 )、標(biāo)準(zhǔn)曲線制作取陽性對(duì)照質(zhì)粒，按10倍倍比稀釋成107 ~ 103的 濃度梯度，在最佳^Ji條件下用Bio-Rad的iCycleriQTM熒光定量PCR儀 同時(shí)擴(kuò)增，以拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 (3)、加樣在0.2 1111薄壁管中加入以下試劑10xLAMP反應(yīng)液 2.5 ul一對(duì)外引物 5 pmol一對(duì)內(nèi)引物 40 pmol 提取的剛地弓形蟲DNA 5 ul顯色劑 0.2 ul滅菌雙蒸水 補(bǔ)至 24 ul(4) 反應(yīng)于951C變性5分鐘，冷卻至室溫后加1 p 1 BstDNA酶，于 Bio-Rad的iCycler iQTM熒光定量PCR儀上60 ~ 65"C恒溫反應(yīng)45分鐘。(5) 根據(jù)樣品的Ct值，通過與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，確定樣品的起始拷貝數(shù). 上述實(shí)施例只為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點(diǎn)，其目的在于讓熟悉此項(xiàng)技術(shù)的人士能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實(shí)施，并不能以此限制本發(fā)明的保 護(hù)范圍.凡#^本發(fā)明精神實(shí)質(zhì)所作的等效變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明 的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1、一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)剛地弓形蟲的引物，其特征在于由一對(duì)外引物和一對(duì)內(nèi)引物組成，其序列為外引物1GGGAATGAAAGAGACGCTAA外引物2CTGTGTACCTCTTCTCGTATT內(nèi)引物1TGCACAGATACTCATGAATTTCACTGTTTGCATAGGTTGCAGTC內(nèi)引物2ACTTTGGTGTATTCGCAGATTGGTTCACGATCTTCTTCTCCTG其中，所述的一對(duì)外引物與一對(duì)內(nèi)引物的摩爾數(shù)之比為1∶6～9。
2、 一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)剛地弓形蟲的試劑盒，其特征在于由一套引 物、IO倍環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液、DNA聚合酶、陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和顯色 劑組成；所述的一套引物是由一對(duì)外引物和一對(duì)內(nèi)引物組成，其序列為外引物l: GGGAATGAAAGAGACGCTAA 外引物2: CTGTGTACCTCTTCTCGTATT內(nèi)引物1: TGCACAGATACTCATGAATTTCACTGTTTGCATAGGTTGCAGTC 內(nèi)引物2: ACTTTGGTGTATTCGCAGATTGGTTCACGATCTTCTTCTCCTG 其中，所述的一對(duì)外引物與一對(duì)內(nèi)引物的摩爾數(shù)之比為1: 6~9;所述的 DNA聚合酶為具有鏈置換作用的Bst DNA聚合酶,活力為8個(gè)活性單位/微升； 所述的陽性對(duì)照為含有插入剛地弓形蟲一段特異序列的陽性質(zhì)粒，環(huán)介導(dǎo)等溫 擴(kuò)增反應(yīng)擴(kuò)增區(qū)位于該特異序列中，其濃度為107拷貝"1;所述的陰性對(duì)照 為滅菌雙蒸7jC;所述的顯色劑為20倍SYBR Green I。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述的10倍環(huán)介導(dǎo)等溫 擴(kuò)增^Jt^bl由200mM三羥甲差^氨基曱烷鹽酸鹽、100mM氯化鉀、lOOmM 疏酸銨、40 100mM硫酸鎂、4 10M甜菜堿、5 ~ 18mM的dNTPs、和1% 質(zhì)量百分濃度的曲拉通X-100組成.
全文摘要
一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)剛地弓形蟲的試劑盒及方法，用于測(cè)定微生物。本發(fā)明的試劑盒由一套設(shè)計(jì)的引物、10×LAMP反應(yīng)液、DNA聚合酶、陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和顯色劑組成。采用本發(fā)明可以定性定量檢測(cè)剛地弓形蟲。本發(fā)明利用Bst DNA酶的鏈置換特性，設(shè)計(jì)4條引物，識(shí)別靶序列的6個(gè)區(qū)域，在等溫條件下生成大量重復(fù)的莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)，在定性檢測(cè)時(shí)不需任何特殊設(shè)備。因此具有特異性、敏感性高和檢測(cè)時(shí)間比普通PCR短的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101250577SQ20081001865
公開日2008年8月27日 申請(qǐng)日期2008年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月5日
發(fā)明者徐蘭蘭, 斌 朱, 楊志雄, 葛海燕 申請(qǐng)人:蘇州大學(xué)