專利名稱：：新的甲型肝炎滅活疫苗病毒毒株及其培養(yǎng)方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種制備曱型肝炎滅活疫苗的新的曱型肝炎病毒JS-4抹及其培養(yǎng)方法。
背景技術：
：曱型肝炎是由曱型肝炎病毒感染引起的一種嚴重危害人類健康的急性傳染病。在A艮中國家尤其是一個重要的公共衛(wèi)生問題，表現(xiàn)為較高的發(fā)病率和局部流行，甚至爆發(fā)引起死亡。因此曱肝的防治工作在全球的疾病預防控制中占有重要的地位。我國是曱型肝炎高^y亍區(qū)，每年至少有24萬人患曱肝it^巨大的經(jīng)濟損失和社會影響。國務院總理溫家寶在十屆人;Jm次^i過府工作報告中提出將甲型肝炎、流腦等傳染病納入國家計劃免疫。我國現(xiàn)有三個廠家生產(chǎn)甲肝減毒活疫苗，兩個廠家生產(chǎn)曱肝滅活疫苗，但由于各家使用的毒林、細月驢質(zhì)不同，產(chǎn)量質(zhì)量都有差異，我國人口眾多，曱肝疫苗仍遠不能滿足國內(nèi)市場的要求。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明一方面涉及一種新的曱型肝炎病^4抹，命名為JS4毒抹，該毒抹亍2008年1月25日保藏于中國典型培;^保藏中心,保藏編號為CCTCCNO:V200802。該病44林抗原滴度可達1:640—1:1280，感染性滴度為106.67—107.50CCID50/mL，經(jīng)絨猴毒力試JHi明該毒林毒力較弱，用它生產(chǎn)曱型肝炎滅活疫苗不仫在安全性方面更可靠，具有良好的免疫原性和保護效果，而且該毒抹具有在Vero細胞上增殖周期短、繁殖效率高的特性，適合于作;W^模工業(yè)化生產(chǎn)的甲型肝炎滅活疫苗毒種，是生產(chǎn)甲型肝i^滅活疫苗的理想毒株。本發(fā)明另一方面涉及曱肝病毒的培養(yǎng)方法，該方法包括以下步驟(a)從曱型肝炎急性感染患者糞便中分離，經(jīng)生物學特性鑒定確認為曱型肝炎病毒；(b)用活性炭處理后在Vero細胞上培養(yǎng)，早代次培養(yǎng)周期為28天，傳至10代后縮短至21天，繼續(xù)培養(yǎng)10代，培養(yǎng)溫度為35。C-36°C，培養(yǎng)時間從28天縮短培養(yǎng)直到培養(yǎng)高峰為21天；(c)選擇經(jīng)步驟(b)細皿養(yǎng)適應后的病毒測試后作為生產(chǎn)疫苗的毒林。本發(fā)明還涉及一種制備甲型肝炎滅活疫苗病毒抗原的方法，其特征是包括如下步驟(a)在培養(yǎng)液中靜止或立體吸附培養(yǎng)細月&^Vero細胞，使細胞濃度達到106~107/mL;(b)以感染劑量(M.O.I)為0.2-0.5將權利要求1的曱型肝炎病44林JS-4抹接種到上述細胞濃度的細胞基質(zhì)培養(yǎng)液中，在37。C與懸浮的細胞吸附30-50min后接種于3L三層瓶中，置35-36。C培養(yǎng)，期間每七天換液一次，21天收毒；(c)用消化液消化獲得病^~細胞培養(yǎng)懸液；(d)經(jīng)破碎抽提、濃縮純化、滅活后獲得曱型肝炎滅活疫苗病毒抗原。相比于現(xiàn)有技術，本發(fā)明提供的毒林用于曱肝滅活疫苗的生產(chǎn)，可大大提高疫苗的產(chǎn)量和質(zhì)量，適應于Vero細胞的曱肝病毒抹在國內(nèi)外均處于領先地位，比人二倍體細胞更適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。具體實施例方式下面結合實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明。實施例1曱型肝炎病毒毒抹JS-4抹的培養(yǎng)方法從臨床甲型肝炎病人采集的急性期糞便制備成20%懸液，用5%植物活性炭處理后10000rpm離心30min,吸取上清加適量抗生素，置4。C備用。待小方瓶Vero細胞長成單層后，洗細胞面一次，每弁IU妻種2ml糞便懸液，37。C吸附2小時，補充細胞維持液置36。C培養(yǎng)28天收毒，期間每七天換液一次。由(b)步驟分離傳代的樣品繼續(xù)進行Vero細胞適應性培養(yǎng)。不同的是每瓶細^^:種lmL樣品，37。C吸附2小時，36。C培養(yǎng)28天，傳至IO代后減少培養(yǎng)時間至21天，再繼續(xù)傳10代，先在克氏瓶傳5代，3L單層瓶傳3代，3L三層瓶傳2代。其中，每次培養(yǎng)期滿后，用胰酶一EDTA消化獲得的病f細胞培養(yǎng)懸液，置-80。C保存?zhèn)溆谩＝臃N前用超聲波破^ff義破碎細胞，破碎率達95%以上，以感染劑量(M.O.I)為0.2~0.5進行接種。最終獲得一抹甲型肝炎病毒毒抹，命名為JS4毒株，該毒4朱于2008年2月25日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC-V200亂該曱型肝炎滅活疫苗病毒毒株JS-4株的特征為病毒顆粒直徑27-32nm;耐酸性在pH3.0條件下，2—8。C作用18小時，感染性滴度無明顯影響；耐乙醚性經(jīng)乙醚2—8。C作用18小時，感染性滴度無明顯影響；中和試驗被HAV特異性抗體中和；基因序列分析與NCBIGeneBank中曱肝病毒基因序列同源性高達98.2%，屬同一基因亞型；抗原滴度1:640—1:1280;感染性滴度106.67—107.50CCID50/mL;繁殖高峰期21—28天；最適培養(yǎng)溫度35°C—36°C;繁殖部4立細月包包漿內(nèi)；具有曱肝病毒特性。實施例2制備曱型肝炎滅活疫苗病毒抗原的方法自Vero細胞工作種子庫取出細胞凍存管，迅ii^tA40。C水中溶化，然后加到預溫37。C的199培養(yǎng)液中，種入細胞瓶，置37。C培養(yǎng)，經(jīng)3~4天長成單層后，擴增數(shù)代，直至生產(chǎn)用的規(guī)定代次。將上述細萬M要0.2MOI加入實施例1獲得的曱型肝炎病毒毒株JS-4抹，在37。C與懸浮的細胞吸附40min后接種于3L三層瓶中，置36。C培養(yǎng)，期間每七天換液一次，21天收毒，其中培養(yǎng)液成份為199培養(yǎng)基，含2—8%小牛血清培養(yǎng)期滿后用消化液消化獲得的病毒一細胞培養(yǎng)懸液，經(jīng)破碎抽提、濃縮純化、滅活后獲得甲型肝炎滅活疫苗病毒抗原。本發(fā)明中相關實驗數(shù)據(jù)見以下列表。證明JS-4毒抹具有在Vert;細胞上高效穩(wěn)定增殖的特性，經(jīng)絨猴毒力試r^i正明該毒株毒力較弱，用它生產(chǎn)甲型肝炎滅活疫苗不僅在安全性方面更可靠，具有良好的免疫原性和保護效果。表1JS-4林不同代次抗原滴度及感染性滴度代次抗原滴度絲歸4(EUZO.lmL)103204.50156406.00186406.672012807.505表2JS-4抹19代增殖高峰期il驗結果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表3JS-4抹毒力情況比專交(絨猴il驗)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>權利要求1、一種甲型肝炎病毒毒株，命名為JS-4，該毒株保藏編號為CCTCC-V200802。2、一種培養(yǎng)曱型肝炎病44抹的方法，其特征是包括下述步驟(a)從甲型肝炎急性感染患者糞便中分離，經(jīng)生物學特性鑒定確認為曱型肝炎病毒；(b)用活性炭處理后在Vero細胞上培養(yǎng)，早代次培養(yǎng)周期為28天，傳至10代后縮短至21天，繼續(xù)培養(yǎng)10代，培養(yǎng)溫/復為35°C-36°C,培養(yǎng)時間從28天縮短培養(yǎng)直到培養(yǎng)高峰為21天；(c)選擇經(jīng)步驟(b)細胞培養(yǎng)適應后的病毒測試后作為生產(chǎn)疫苗的毒株。3、一種制備曱型肝炎滅活疫苗病毒抗原的方法，其特征是包括如下步驟(a)在培養(yǎng)液中靜止或立體吸附培養(yǎng)細胞基質(zhì)Vero細胞，使細胞濃度達到106-107/mL;(b)以感染劑量(M.O.I)為0.2-0.5將權利賣-求1的曱型肝炎病4^4朱JS-4抹接種到上述細胞濃度的細胞基質(zhì)培養(yǎng)液中，在37。C與懸浮的細胞吸附30-50min后接種于3L三層瓶中，置35-36。C培養(yǎng)，期間每七天換液一次，21天收毒；(c)用消化液消化獲得病^"細胞培養(yǎng)懸液；(d)經(jīng)破碎抽提、濃縮純化、滅活后獲纟尋甲型肝炎滅活疫苗病毒抗原。全文摘要本發(fā)明提供一種制備甲型肝炎滅活疫苗的新的甲型肝炎病毒JS-4株及其培養(yǎng)方法。該毒株是從一個甲型肝炎急性感染患者糞便中分離，再傳至Vero細胞上適應培養(yǎng)所得，經(jīng)中和試驗等方法證明為甲肝病毒，適應過程中，早代次培養(yǎng)周期為28天，傳至10代后縮短至21天，繼續(xù)培養(yǎng)10代，培養(yǎng)溫度為35℃-36℃，病毒繁殖周期由28天縮短到21天，抗原滴度可達1∶640-1∶1280，感染性滴度為106.67-107.50CCID50/ml。經(jīng)絨猴毒力試驗證明該毒株毒力較弱，用它生產(chǎn)甲型肝炎滅活疫苗不僅在安全性方面更可靠，而且具有良好的免疫原性和保護效果，是生產(chǎn)甲型肝炎滅活疫苗的理想毒株。文檔編號C12N7/08GK101525597SQ20081001865公開日2009年9月9日申請日期2008年3月8日優(yōu)先權日2008年3月8日發(fā)明者周佳麗,張玉慧,曹雨露,王益民,胡焱靈,蔣建江,明黃申請人:江蘇延申生物科技股份有限公司