專利名稱：一個新的人類睪丸特異性基因tdrg1的制作方法
技術領域：
本發明涉及人類基因，具體是一個新的睪丸特異性基因rZ)i G7的cDNA全 長克隆，并明確了該基因編碼的氨基酸序列以及在人體多種組織、不同發育階段 睪丸組織中的表達譜。
技術背景-根據WHO(1986)人類生殖研究發展和培訓特別規劃署研究報告，在發達國 家不育夫婦占已婚育齡夫婦的15%，而男性不育又占不育夫婦的43%。研究表 明，男性不育發生和發展是一個多基因參與的過程，約2000個不同的基因參與 了男性生殖及其調節過程，包括睪丸發育、生殖細胞分化、減數分裂以及精子 發生的各個階段。這些基因有的位于性染色體，有的則定位于常染色體。因此， 發現和研究與生精相關的新基因，成為了進一步揭示男性生精過程的分子機制的 關鍵，也可能為診治男性不育癥提供新的思路。人類基因組圖譜公諸于世后，以計算機和互聯網為工具，利用現有的表達序 列標簽(expressed sequence tag, EST)和生物信息數據庫，對人類基因組未知功 能新基因的發掘和蛋白質功能分析己成為近年研究的熱點。美國NCBI的 Unigene數據庫中擁有大量的EST，它們來源于不同組織、不同細胞、不同病理 狀態下所構建的cDNA (complementary DNA)文庫，已成為人們尋找新基因的 重要標志物。運用"數據庫消減雜交"(Digital Differential Display, DDD)方 法對不同文庫進行比較，獲得在統計學意義上存在明顯差異的代表新基因的克隆 重疊群，并結合實驗驗證克隆新基因的方法是目前發掘新基因的常用手段之一。

發明內容
本發明的目的在于提供了一個新的睪丸特異性基因rZ)/ G7的的cDNA全長 序列，并明確了其編碼的氨基酸序列，分析它在人體多種組織和不同發育階段睪 丸組織中的表達譜，以探索該基因在睪丸生精過程中所起的作用，進而開發治療 男性不育癥的基因藥物。.經互聯網進入美國NCBI (http:Vwww.ncbi.nlm.nih.gov)的Unigene數據庫， 運用DDD方法進行數種平行材料之間的比較。以9個人類睪丸cDNA文庫作為 檢測子(pool A) ， 76個其他組織或細胞株(如心、脾、肝、肺、腦、皮膚、腎、 卵巢、骨骼肌、胸腺、前列腺、小腸、大腸等)來源的cDNA文庫作為驅趕子 (pooffi)，通過poolA: poolB之間的比值來計算倍數差異，并以》10倍的差 異為篩選標準，經數據庫消減雜交篩選獲得可能存在表達差異的EST片段。選 取了其中一個電子預測其可能在睪丸組織中特異表達的代表新基因的克隆重疊 群(contig)Hs. 180197， i亥EST族中包含BC071820.1、BC033995.2和BC042123.1， 3個序列拼接后獲得一條長度為1197 bp的新序列。以拼接后的新序列為探針，運用多種基因預測軟件搜索EST和Unigene數據庫，經互聯網進入美國GenBank數據庫，利用BLAST檢索nr數據庫和EST 數據庫進行歸類、拼接、延長、査新，獲得受人類基因組圖譜支持的新基因的 cDNA全長為1197 bp。以成人睪丸組織的總mRNA為模板，進行逆轉錄。依據電子克隆的新基因 序列設計兩對引物(Pi/P2， P3/P4，見下文)在成人睪丸組織的cDNA文庫中進 行PCR擴增，以2%瓊脂糖電泳檢測PCR產物大小。將經瓊脂糖電泳驗證的PCR 產物連接到pUCm-T載體上，轉化大腸桿菌JM109。重組克隆在AB1377-3自動 測序儀上完成測序。結果表明兩對引物均擴增成功，實驗擴增產物的測序結果與 電子克隆所獲得的基因序列完全一致，從而實驗驗證了該基因在成人睪丸組織中 的表達。對睪丸、心臟、肝臟、腦、附睪、肺、腎、脾等人正常組織進行多組織半定 量RT-PCR分析，結果表明該新基因僅在人睪丸組織中表達。多組織半定量 Northern雜交分析亦顯示僅在睪丸組織中有約lJ9kb大小的陽性轉錄本存在。 說明新克隆的基因為睪丸特異性表達的基因。用半定量RT-PCR分析新基因在人 類不同發育階段睪丸組織中的表達，發現新基因在4個月和6個月的胎兒睪丸中 無表達，在15歲少年睪丸中強表達，在33歲青年睪丸中表達稍減弱，而在74 歲老年男性睪丸組織中的表達明顯減弱，從而提示該基因與男性性成熟與生精功 能有關。因此，我們將該新基因全長cDNA序列提交到GeneBank，登錄號為 DQ168992，經國際人類基因命名委員會批準命名為7DWG7 (Testis Development Related Gene 1)。7IJ)i G7基因定位于6p21.1-6p21.2，整個基因跨越約1.8kb，包括2個外顯子 和1個內含子。該基因含有303bp (504—806bp)的完整開放閱讀框，編碼100 個氨基酸，504-506bp處為起始密碼子ATG， 804-806bp處為終止密碼子TAG, 在ATG 5'端有1個同一相位的終止密碼子TGA， 3'端則有1個加尾信號 AATAAA及poly A尾。依據該基因的開放閱讀框序列，構建大腸桿菌表達載體重組71J)WG/蛋白， 利用重組蛋白免疫小鼠，制備了抗7Di G/蛋白單克隆抗體。以抗7D7 G/單克 隆抗體為一抗，天然人睪丸組織裂解液為抗原，進行Western Blot檢測。結果為 陽性，表明人睪丸組織中有陽性的7Z說G/蛋白表達。7ZWG/蛋白包括100個氨 基酸序列，分子量為17KD，無保守結構域，無跨膜區，無信號肽序列，推測為 一非分泌性蛋白。對其修飾位點預測結果顯示可能含有1個蛋白激酶C磷酸 化位點，2個酪蛋白激酶II磷酸化位點，3個N-肉豆蔻基化位點。對該蛋白質 序列進行相似性比較，結果顯示與其他已知蛋白質無明顯同源性，表明該7Di G7 基因及其編碼蛋白質均是全新的。本發明的優點1、 克隆了一個人類睪丸特異性新基因的全長cDNA序列，確定了 其編碼的氨基酸序列，初步闡明了該基因的功能，為下一步深入研究該基因功能 提供了基礎。2、 7Z)i G/基因與男性睪丸生精功能相關，有望成為診治男性不育癥的新靶 點，為開發治療男性不育癥的新藥物提供思路。本發明通過以下附圖和實施例作進一歩闡述，但并不限制本發明的范圍。


圖1. 7ZW(7/的cDNA核苷酸序列和其編碼的氨基酸序列； 圖2. RT-PCR實驗驗證電子克隆的新基因序列；M: Marker; 1:引物P!/P2; 2:引物P3/P4.圖3. rZ)A(7/的多組織半定量RT-PCR;M: Marker; 1:睪丸；2:心臟；3:肝；4:腦； 5:附睪；6:肺；7:腎；8:脾.圖4. 7ZWG/的多組織Northern雜交；M: Marker; 1:成人腦；2:心臟；3:肝臟；4:月市；5:脾臟；6:腎臟；7:睪丸8:骨骼.圖5. ri)i G/在不同發育階段睪丸組織的半定量RT-PCR;M: Marker; 1: 15歲人睪丸；2: 33歲青年睪丸；3: 74歲老年人睪丸；4: 4個月胎兒睪丸；5: 6個月胎兒睪丸.圖6. Western Blot驗證7Di G/蛋白； M: Marker;1、 2、 3抗原均為人類睪丸裂解液；抗體均為抗一7I)i G/單克隆抗體.
具體實施例方式實施例1實驗驗證基因的cDNA序列根據電子克隆的新基因序列設計Pi/P2， P3/P4兩對引物P1: sense 5'—GAAGAGGAGGGAGGCAGTCT—3，P2: antisense 5'—GCCCAATTCCTCTTGACTGA—3' P3: sense 5'—AAGGAGAGTGCCCTGCGTG—3'P4: antisense 5'—TCCCTGAAGGTGGAGTGCTG—3'PCR以成人睪丸組織的cDNA文庫為模板。反應條件94'C預變性5min后， 94。C變性30sec， 58。C退火30sec， 72。C延伸lmin，完成30個循環，最后72。C延 伸5min，置4。C保存。以2%瓊脂糖電泳檢測PCR產物大小。將經瓊脂糖電泳驗證的PCR產物連接到pUCm-T載體上，轉化大腸桿菌JM109。重組克隆在AB1377-3自動測序儀 上完成測序。實施例2 rZ)i G7在全身多組織和不同發育階段睪丸組織中的表達分析利用上述Pi/P2引物對在人各種組織cDNA文庫中進行半定量RT-PCR，按 逆轉錄試劑盒操作程序進行逆轉錄反應，反應體積20uL,模板RNA lug。以 GAPDH基因作為內參。為較客觀地反映mRNA表達的相對水平，在7Di G/基 因及GAPDH的PCR平臺期前結束PCR。采用下列反應條件進行94"C預變性 5min后，94。C變性30sec， 58。C退火30sec， 72。C延伸lmin，完成30個循環， 最后72"C延伸5min，置4'C保存。利用上述同樣的方法對新基因在不同發育階段睪丸組織中的表達情況進行 半定量RT-PCR。實施例3多組織Northern雜交(1) 、用DDLK-010試劑盒標記GW探針，純化后備用。(2) 、預雜交將預制人全身多組織核酸印跡膜取出，放入雜交袋中三面封 口 ，加入65T預熱的Hyb雜交液5mL，封口 。放65'C水浴振蕩雜交1小時。(3) 、雜交將標記好的探針放IO(TC煮10 15分鐘，立即放冰浴冷卻10 分鐘。將預雜交袋從水浴中取出，盡量排干袋中的預雜交液，取5mLHyb雜交 液，加入探針，混勻，加入到雜交袋中，封口，放65"水浴振蕩雜交過夜。(4) 、洗膜剪開雜交袋，用鑷子取出膜，放入裝有20mL的2XSSC 0.1% SDS溶液的平皿中，在室溫下振蕩洗滌兩次，每次5分鐘。再將膜放入0.1 XSSC 0.P/。SDS溶液(先放5(TC水浴預熱)中5(TC水浴振蕩洗滌兩次，每次15分鐘。 用鑷子將膜取出轉入裝有20mL洗滌緩沖液的平皿中振蕩洗滌5分鐘。(5) 、用20mL阻斷封閉30分鐘。 再將膜轉入10mL抗體溶液中振蕩孵育30分鐘。在20mL洗滌緩沖液中振蕩洗滌兩次，每次15分鐘。(6) 、信號檢測將膜放20mL檢測緩沖液中振蕩平衡5分鐘。(7) 、配制發光底物按1: 100比例將CDP-STAR濃縮底物加入到檢測 緩沖液中，混勻。均勻加在膜上，室溫反應5分鐘，用X-光片曝光10-30分 鐘，記錄結果。
權利要求
1、一個新的人類睪丸特異性基因TDRG1，其特征在于該人類新基因的cDNA核苷酸序列和編碼氨基酸序列如下1aagatcaggactgctgaaagaatgaagaagaacttacttggcctaggatg 5051 tggctagagaacggagcgcactttcacttacctggcaaggtggttttgga 100101 agtttccacggaagccttcccagggccgctgctgcccgtcctcgcctagg 150151 tgtggagcttcccgaccggctggggagggaatgtcctgcgggagccgccg 200201 aggaccctctttagcctcttccctggcttggctgcagctgcagtctggta 250251 ctcgcccattctgctcttcttcacctccgtattttctctctcacggaaga 300301 agaattccattctcccatcccaggaaggagagtgccctgcgtgccacgaa 350351 agagcccaggacccacaggacaaatacgtcactggcagacctgccttcgc 400401 cagcgccagcccatctctgaaacctccagcatttgtgccccggtccggcc 450451 cctcccaggcctgactctttccgtgaacggtcactgcgcaggatcaagct 500501 acaATGAAGAGGAGGGAGGCAGTCTGCGCGCACCGCCATTTTCTAGGAACT 550 M K R R E A V C A H R H F L G T551 GGGAAGCCCCCCCACCCCTTAGGAAGATCCATCCCTGTGGAACCTTGCCCA 601 G K P P H P L G R S I P V E P C P602 GGCTTACCAGCCTTTGCTGAGGTTGATCTATTGTCCCTCCTTGTCCCCATC 652 G L P A F A E V D L L S L L V P I653 AAAATATCCAGCACTCCACCTTCAGGGAGTAGACTTGACCCTCAAATAGCA 703 K I S S T P P S G S R L D P Q I A704 AGTTCAGCCTTCCCAGGTCTAGGTTCCCTGGGAGGTCAAGATTCGTCTGGT 754 S S A F P G L G S L G G Q D S S G755 TCCTTAGTACAGAGGGCTAGCTGTGAGTTGGAATCCCCCTATGAGCTTTAG 806 S L V Q R A S C E L E S P Y E L *807 aatcagtcaagaggaattgggccccttcccttcatccctcttcttttccct 857858 ttttgtcccagagctcagctctgactcaaaagtttttccatttaccatcaa 908909 catggaaacttggctcctcacgtaggtatattatcccccttttgtacatgg 959960 tcttgttgatccaaactccctttctgtgaaagaggcctgtggggctcaaga 10101011 agcctggtcagccagccaggctagtcccacatacctcagaaccagtttaat 10611062 aaaaaaggctctatgtcattcttttttaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa 11091110 aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa 11601161 aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa119全文摘要
運用“數據庫消減雜交”的方法克隆了一個新的人類睪丸特異性基因TDRG1，它的cDNA全長為1197bp，編碼100個氨基酸。TDRG1基因僅在人睪丸組織中表達，且在青少年睪丸組織中強表達，胎兒和老年睪丸組織中表達明顯減弱，表明該基因與男性性成熟與生精功能相關，有望成為診治男性不育癥的新靶點，為開發治療男性不育癥的新藥物提供思路。
文檔編號C12N15/10GK101255426SQ20081003071
公開日2008年9月3日 申請日期2008年2月28日 優先權日2008年2月28日
發明者文甲明, 湯育新, 蔣先鎮, 陽建福 申請人:蔣先鎮;陽建福;湯育新;文甲明