專利名稱：：用響應面法優化林可霉素發酵生產的種子培養基的制作方法
技術領域：
：本發明屬于微生物發酵領域，更具體地，本發明涉及一種優化的林可霉素發酵生產的種子培養基。
背景技術：
：林可霉素(Lincomycin)—種有用的醫藥中間體，用于制備抗生素，其通常由鏈絲菌(如林可鏈霉菌)產生。目前，用林可鏈霉菌發酵生產林可霉素的過程非常復雜，在種子培養方面存在以下缺陷培養基組分的配比不合理，導致林可鏈霉菌生長和繁殖速率較小，培養周期長；培養工藝繁雜，常采用中間補料的方式來延長培養時間，以增加菌濃(PMV);移種時PMV較小，種子已經老化，嚴重影響林可霉素發酵過程的正常進行，生產效率較低。因此，本領域迫切需要改良林可霉素生產菌的種子培養基，以期提高林可霉素的發酵效率。
發明內容本發明的目的在于提供一種優化的用于林可霉素發酵生產的種子培養基以及基于所述培養基的林可鏈霉菌種子培養方法。在本發明的第一方面，提供一種林可鏈霉菌種子培養基，所述培養基含有碳源、氮源、磷源、無機鹽，培養基中含有以下必要組分淀粉，葡萄糖，黃豆餅粉，硝酸銨，和硫酸銨，且它們的含量如下淀粉18.7±2g/L;葡萄糖24.3±1g/L;黃豆餅粉22.3±1g/L;硝酸銨1.33±0.2g/L;硫酸銨2±0.1g/L。淀粉在另一優選例中，所述的培養基是液體培養基。更優選的，將各組分溶于水中，形成液體培養基。在另一優選例中，所述的培養基由碳源、氮源、磷源、無機鹽、微量元素構成。在另一優選例中，培養基中淀粉，葡萄糖，黃豆餅粉，硝酸銨，和硫酸銨的含量如下18.7±1g/L;24.3±0.5g/L;黃豆餅粉22.3±0.5g/L;硝酸銨1.33土0.1g/L;硫酸銨2±0.05g/L。在另一優選例中，培養基中還含有選自下組的組分玉米漿，牛肉膏，酵母膏，或它們的組合。在另一優選例中，玉米漿，牛肉膏，或酵母膏的含量是26士6g/L。在另一優選例中，玉米漿，牛肉膏或酵母膏的含量是26土3g/L。在另一優選例中，培養基中還含有以下組分碳酸鈣，氯化鈉，磷酸二氫鉀，和硝酸鈉。在另一優選例中，碳酸鈣，氯化鈉，磷酸二氫鉀，和硝酸鈉的含量如下7±2g/L;0.7±0.2g/L;0.045±0.02g/L;0.85±0.2g/L。氯化鈉，磷酸二氫鉀，和硝酸鈉的含量如下7±1g/L;0.7±0.1g/L;0.045±0.01g/L;0.85±0.1g/L。在另一優選例中，所述的培養基基本上由組分淀粉，葡萄糖，黃豆餅粉，硝酸銨，硫酸銨，玉米漿，碳酸鈣，氯化鈉，磷酸二氫鉀，和硝酸鈉添加于水中而構成。碳酸鈣氯化鈉磷酸二氫鉀硝酸鈉在另一優選例中，碳酸鈣,碳酸鈣氯化鈉磷酸二氫鉀硝酸鈉在本發明的第二方面，提供所述的培養基的用途，用于林可鏈霉菌的種子培養。在本發明的第三方面，提供一種林可鏈霉菌種子培養的方法，所述方法包括采用所述的培養基培養林可鏈霉菌種子。在另一優選例中，培養溫度是30±2°C;優選的，培養溫度是3o±rc;更優選的，培養的溫度是30土0.5°C在另一優選例中，培養時每分鐘的通氣量是1.2±0.2L/L培養基；優選的，培養時每分鐘的通氣量是1.2±0.1L/L培養基；更優選的，培養時每分鐘的通氣量是1.2±0.05L/L培養基。本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。圖1顯示了硫酸銨與葡萄糖交互影響菌體濃度的曲面圖(A)及等高線圖(B)。圖2顯示了pH(A)和菌體濃度(B)的變化曲線。具體實施方式針對目前現有技術中林可鏈霉菌培養基組分配比不合理，林可鏈霉菌生長和繁殖速率較小，培養周期長，培養工藝繁雜，種子易老化等缺陷，本發明人經過反復的研究和試驗，首次揭示一種優化的林可鏈霉菌種子培養基，該培養基配比合理，林可鏈霉菌生長和繁殖速率高，培養周期短即可達到高的菌濃，從而可有效避免種子的老化，有效提高后續林可霉素發酵過程的生產效率。在此基礎上完成了本發明。本發明人通過以下方法對培養基進行優化首先設定初始培養基，并以淀粉、葡萄糖、黃豆餅粉，硝酸氨和硫酸銨作為影響因子，進行兩水平因子設計，結果確定葡萄糖和硫酸氨為顯著影響因子。根據軟件分析的結果，得到淀粉、葡萄糖、黃豆餅粉，硝酸氨和硫酸銨的較佳配比。然后，以葡萄糖和硫酸銨為顯著影響因子進行響應面設計，淀粉、黃豆餅粉、硝酸銨按照較佳配比不變，其余因子按照初始配比不變，進一步優化得到葡萄糖、硫酸銨的最佳配比。根據前述的優化結果，并且經過本發明人反復多次的配比試驗，證實了林可鏈霉菌種子培養基中淀粉、葡萄糖、黃豆餅粉，硝酸氨和硫酸銨的較佳含量如表1。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>本發明的培養基中除了含有上述必要組分以外，還可含有其它氮源、無機鹽、或微量元素等常規的培養基成份。碳源是指能提供微生物營養所需碳元素的營養源。氮源是指能提供微生物營養所需氮元素的營養源。無機鹽是構成菌體成分、酶活性基組成或維持酶活性、調節滲透壓、pH等的成份。這些常規的成份，可以采用常規的鏈霉菌培養基中相應成份及用量。這些成份可用本領域技術人員熟知的其它成份替代，且本領域的技術人員可以根據常規知識確定其作為本發明的優選方式，所述的培養基中還含有選自下組的組分玉米漿，牛肉膏，酵母膏，或它們的組合。優選的，玉米漿，牛肉膏，或酵母膏的含量是26土6g/L。更優選的，玉米漿，牛肉膏或酵母膏的含量是26土3g/L。作為本發明的優選方式，所述的培養基中還含培養基中還含有以下組分碳酸鈣，氯化鈉，磷酸二氫鉀，和硝酸鈉。優選的，碳酸鈣，氯化鈉，磷酸二氫鉀，和硝酸鈉的較佳含量如表2。較佳配比更佳配比碳酸鈣7±2g/L;7士1g/L;氯化鈉0.7±0.2g/L;0.7±0.1g/L;磷酸二氫鉀0.045±0.02g/L;0.045±0.01g/L;硝酸鈉0.85±0.2g/L。0.85±0.1g/L。本發明的培養基可以直接配制成液態，從而用于林可鏈霉菌的培養；此外，本發明的培養基也可以被配制成固態形式，在需要時溶解于溶劑(如水)。本領域人員在參考了本發明提供的組分配比后，很容易根據配比來配制固態或液態的培養基。經本發明人優化后的培養基配方，它含有足夠的營養成份，配方合理，足以滿足林可鏈霉菌種子培養的營養所需，菌體生長和繁殖速率高，培養周期短即可達到高的菌濃，特別有利于后續林可霉素發酵過程。將優化后的種子培養基配方與初始的配方相比較，初始種子培養基中葡萄糖和硫酸銨的含量均偏高，而淀粉和黃豆餅粉的含量則偏低。本發明人在效果驗證中發現，采用初始培養基培養，在開始的一段培養時間內，由于林可鏈霉菌周圍高滲透壓環境或分解代謝物阻遏效應的影響，其生長和繁殖受到抑制，培養周期太長，缺點主要表現在兩方面一是種齡長，種子老化，進入發酵過程后，導致林可鏈霉菌生產"后勁"不足現象，生產效率低；二是增加了染菌的幾率。而優化培養基中減少了速效碳氮源的含量，適當增加了遲效碳氮源的含量，大大縮短了種子培養周期；進入發酵過程后，林可鏈霉菌生理活性強，代謝水平高，生產"后勁"很足，為提高生產效率提供了基本保障。作為本發明的一種優選實施方式，所述的培養基的組分和含量為(g/L):淀粉18.7，葡萄糖24.3，黃豆餅粉22.3，硝酸銨1.33，硫酸銨2，玉米漿26，碳酸鈣7，氯化鈉O.7，磷酸二氫鉀0.045，硝酸鈉O.85。各組分溶于水中制成液態培養基。在本發明的一個實施例中，所述培養基與優化以前的培養基相比，培養時間大大縮短，由50多小時縮短為20小時左右；并且，優化后的培養基在培養20小時的菌濃高于優化前培養基在培養53小時的菌濃。本發明的培養基適合于不同規模的林可鏈霉菌的種子培養，如搖瓶規模的種子培養以及發酵罐規模(如15L種子罐)的種子培養。本發明還提供一種林可鏈霉菌種子培養的方法，所述方法包括用本發明提供的種子培養基進行培養。培養林可鏈霉菌的其它條件(如溫度、濕度、通氣量等)可采用本領域已知的條件。作為本發明的優選方式，培養溫度是30士2。C;優選的，培養溫度是30土1°C;更優選的，培養的溫度是30土0.5°C。作為本發明的優選方式，培養時每分鐘的通氣量是1.2±0.2L/L培養基；優選的，培養時每分鐘的通氣量是1.2±0.1L/L培養基；更優選的，培養時每分鐘的通氣量是1.2±0.05L/L培養基。本發明的主要優點在于(1)本發明的培養基配比合理，林可鏈霉菌生長和繁殖速率高，培養周期短即可達到高的菌濃，從而可有效避免種子的老化，有效提高后續林可霉素發酵過程的生產效率。(2)由于培養基配方合理，且所需培養時間短，因此無需進行中間補料，在培養原料利用率高且浪費少的基礎上，操作也大大簡化。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室指南(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。材料與方法l.儀器FUS-15L多參數全自動控制發酵罐(上海國強生化工程裝備有限公司)。2.菌種與培養基菌禾中林可鏈毒菌(6Yre/^M7yce517//C07/7e/75^'51，>5".7jf'/7C07/7e/LS/51)L—427，購自江西國藥有限責任公司。3.種子培養方法(1)搖瓶種子培養將母瓶中的種子液按6y。的接種量接種至搖瓶種子培養基(500ml搖瓶)，搖床轉速為220r/min，在溫度為30。C和相對濕度為4045%的培養間培養48h。(2)FUS-15L罐中的種子培養搖瓶種子液按10%的接種量接種至15L罐種子培養基(滅菌后種子培養基體積約7L)，攪拌轉速為260400r/min，每分鐘通入1L培養液的滅菌空氣體積為1.2L。4.測定方法細胞干重(DCW):吸取發酵液10ml，稱濕重，布氏漏斗抽濾，濕固形物水洗3次后8(TC恒溫烘12h，稱重，計算DCW(g/L)。總糖(TS)和還原糖(RS)含量采用斐林氏法測定[參見北京大學生物系生化教研室；生物化學實驗指導[M];高等教育出版社，1986:92-96.]。實施例1兩7夂平因子設計(2LevelFactorialDesign)本實施例從培養基的影響因子中找出顯著影響因子，采用兩水平因子設計。本研究的實驗設計、數據分析及響應值優化采用DesignExpert7.0軟件來進行。設計的初始培養基配方為(g/L):淀粉14，葡萄糖28，黃豆餅粉20，玉米漿26，氯化鈉0.7，硝酸鈉0.85,碳酸鈣7，硝酸銨2，硫酸銨2.3，磷酸二氫鉀0.045。根據前期試驗，在初始種子培養基中淀粉、葡萄糖、黃豆餅粉、硝酸銨和硫酸銨為較為關鍵的因素。因此選取淀粉、葡萄糖、黃豆餅粉、硝酸銨和硫酸銨為影響因子進行兩水平因子設計，其余組分含量同初始培養基。各因子濃度范圍的設定如表3所示。表3變量高低水平值的設定<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>兩水平的因子設計及實驗結果如表4所示。以菌濃(PMV)作為響應值，由軟件分析得到的方差分析結果如表5所示。表4兩水平因子設計及實驗結果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>130.820.90.030.0437.31.870.56140.30.50.40.060.0433.30.450.55150.820.40.060.0432.31.970.48160.551.250.650.0450.075430.790.58170.30.50.40.030.11410.510.65表5方差分析表平方和DF均方離差F值幾率〉F模型695.916115.985.420.0125顯著B413.111413.1119.300.0017顯著AB30.53130.531.430.2629AC21.86121.861.020.3387AD18.71118.710.870.3743BE196.701196.709.190.0142顯著CD15.02115.020,700.4240曲率78.26178.263.660.0882非顯著殘差192.64921.40總閨差966.8016本設計模型的F值為5.42，由于噪聲的影響而出現大于F值的幾率僅為0.0125%(<0.05%)，故本設計模型是顯著的。影響因子B(Glucose)、BE(Glucose與硫酸銨的交互作用項)的F值分別為19.3和9.19，由于噪聲影響而出現比各自F值大的幾率(Prob)均在5W以下，故它們對模型的影響是顯著的。曲率的F值為3.66，出現比F值大的幾率為0.0882%(>0.05%),說明模型的響應曲面顯著彎曲，進一步說明模型具有很強的顯著性。再結合另外兩個響應值進行綜合分析，確定葡萄糖和硫酸銨為顯著影響因子。由軟件分析得到一組優化配比(g/U:淀粉18.7，葡萄糖26.9，黃豆餅粉22.3，硝酸鈉1.33，硫酸銨1.8(其它組分含量同初始培養基)。實施例2響應面設計(Responsesurfacedesign)以葡萄糖和硫酸銨為顯著影響因子進行響應面設計，其余因子在每一設計組中的含量(g/L)相同，即淀粉18.7，黃豆餅粉22.3，硝酸銨1.33，玉米漿26，碳酸鈣7，氯化鈉0.7，磷酸二氫鉀0.045,硝酸鈉0.85。實驗設計和分析結果分別如表6-表IO所示。_表6變量高低水平值的設定_<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表8方差分析<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表9相關系數分析表<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>多元回歸方程為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>回歸方程的確定系數R2為0.9659，該方程對菌濃的預測值是可信的。硫酸銨與葡萄糖交互影響菌體濃度的曲面圖(A)及等高線圖(B)見圖1。由圖l知，在一定的濃度范圍內，葡萄糖和硫酸銨對PMV的影響具有正協同作用，這說明林可鏈霉菌在進行快速生長和繁殖的過程中需要有一定濃度的易利用碳源(葡萄糖)和易利用氮源(硫酸銨)；當培養基中的葡萄糖和硫酸銨超過一定濃度范圍時，PMV迅速下降，可能有以下幾個方面的原因一是大量葡萄糖被快速利用，產生較多的有機酸，部分分泌至胞外，導致發酵液的pH降低；硫酸銨是一種生理酸性鹽，在發酵起始階段，丙氨酸脫氫酶(VDH)同化NH/的速率較大，生成較多的H+，導致pH值迅速下降；同時，菌體產生C02溶解在發酵液中也使其酸度增大，上述幾個因素的綜合作用，使得發酵液的pH值降至很低值(如pH<6.0)，如菌體長時間處于此環境中，可能導致細胞膜的通透性增大而使菌體初級代謝的一些關鍵調控酶的活力下降；二是發酵液中葡萄糖濃度太高時，林可鏈霉菌在高滲透壓的環境中不能進行正常的生理活動。三是葡萄糖的分解代謝物阻遏效應，遲效碳源(如淀粉)難于被林可鏈霉菌利用；高濃度的NH/抑制林可鏈霉菌對遲效氮源(如黃豆餅粉)的降解，實驗發現，此環境條件下生長的菌絲耐剪切能力較小，菌體因為受到機械性損傷而降低代謝水平。當PMV的預測值為52.36%時，葡萄糖和硫酸銨的濃度分別為24.3和2g/L，即二級種子培養基的優化配比(g/L)為淀粉18.7，葡萄糖24.3，黃豆餅粉22.3，硝酸銨1.33，硫酸銨2，玉米槳26，碳酸鈣7，氯化鈉O.7，磷酸二氫鉀0.045，硝酸鈉0.85(培養基1)。實施例3培養基的配制培養基的配方如表io所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>配制培養基的方法精確稱取各組分，將各組分混合后加適量蒸餾水溶解，定容，使培養基中個組分滿足表中配比。實施例4驗證實驗將初始培養基和優化培養基(培養基l)分別用于FUS-15L種子罐培養，培養過程中的pH變化和PMV變化如圖2A和圖2B所示。可見培養基1僅需要不到20小時即可獲得很高的菌濃，20h時PMV為51%，pH回升至7.3以上；而初始培養基在53小時的菌濃僅為40%。經發酵試驗檢測，采用培養基1獲得的種子活性高，生產林可霉素的產率高；而采用初始培養基獲得的種子種齡高，活性差，生產林可霉素的產率明顯低。將培養基2、培養基3和培養基4分別用于FUS-15L種子罐培養，其它培養條件同前，結果發現，均在20-25小時即可獲得很高的菌濃，種子不易老化。在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。權利要求1.一種林可鏈霉菌種子培養基，所述培養基含有碳源、氮源、磷源、無機鹽，其特征在于，培養基中含有以下必要組分淀粉，葡萄糖，黃豆餅粉，硝酸銨，和硫酸銨，且它們的含量如下淀粉18.7±2g/L；葡萄糖24.3±1g/L；黃豆餅粉22.3±1g/L；硝酸銨1.33±0.2g/L；硫酸銨2±0.1g/L。2.如權利要求1所述的培養基，其特征在于，培養基中淀粉，葡萄糖，黃豆餅粉，硝酸銨，和硫酸銨的含量如下淀粉18.7±1g/L;葡萄糖24.3±0.5g/L;黃豆餅粉22.3±0.5g/L;硝酸銨1.33±0.1g/L;硫酸銨2±0.05g/L。3.如權利要求l所述的培養基，其特征在于，培養基中還含有選自下組的組分玉米漿，牛肉膏，酵母膏，或它們的組合。4.如權利要求3的培養基，其特征在于，玉米漿，牛肉膏，或酵母膏的含量是26土6g/L。5.如權利要求l所述的培養基，其特征在于，培養基中還含有以下組分碳酸f丐，氯化鈉，磷酸二氫鉀，和硝酸鈉。6.如權利要求5所述的培養基，其特征在于，碳酸鈣，氯化鈉，磷酸二氫鉀，和硝酸鈉的含量如下碳酸鈣7±2g/L;氯化鈉0.7±0.2g/L;磷酸二氫鉀0.045±0.02g/L;硝酸鈉0.85±0.2g/L。7.權利要求1所述的培養基的用途，其特征在于，用于林可鏈霉菌的種子培養。8.—種林可鏈霉菌種子培養的方法，其特征在于，所述方法包括釆用權利要求1所述的培養基培養林可鏈霉菌種子。9.如權利要求8所述的方法，其特征在于，培養溫度是30士2'C。10.如權利要求8所述的方法，其特征在于，培養時每分鐘的空氣通氣量是1.2±0.2L/L培養基。全文摘要本發明屬于微生物發酵領域，公開了一種林可鏈霉菌種子培養基，所述培養基含有碳源、氮源、磷源、無機鹽，且含有以下必要組分淀粉，葡萄糖，黃豆餅粉，硝酸銨，和硫酸銨，本發明還公開了各必要組分的優化配比。本發明的培養基配比合理，利用該培養基培養，林可鏈霉菌生長和繁殖速率高，培養周期短即可達到高的菌濃，從而可有效避免種子的老化，有效提高后續林可霉素發酵過程的生產效率。文檔編號C12N1/20GK101220343SQ20081003295公開日2008年7月16日申請日期2008年1月23日優先權日2008年1月23日發明者炬儲,夏建業,莊英萍,張嗣良,嘯李,杭海峰,王永紅,郭美錦申請人:華東理工大學