專利名稱：分離與純化單個病毒的方法
技術領域：
本發明涉及一種病毒的分離與純化方法，特別是一種基于原子力顯微鏡 納米操縱技術分離單個病毒的方法。
背景技術：
對生物分子的分離分析一直是生物學研究的關鍵技術和重要內容。生命 科學和生物技術的迅猛發展迫切需要在更加微觀的尺度上(單細胞或單分子水平)將其分離進而獲取相關生物化學信息的手段和工具(大學化學，2004， 19:10-15)。近十年來，先后涌現出了各式各樣可以分離微量甚至單個特定生 物體的技術(分析試驗室，2002， 21: 97-104)，主要包括流式細胞術 (0^,z^t， 2000， 42: 284-289)、激光捕獲顯微分離(Science, 1996， 274: 998 - 1001)、毛細管電泳(Journal of Chromatography B， 1999， 722: 141-151)、雙向電泳(Trends Food. Sci. Technol., 1995， 6: 51-58)、光 鑷(Trends Food. Sci. Technol， 1995， 6: 51—58)、磁鑷(Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2000， 1:130-136)、微流控芯片(Applied Physics Letters, 2004， 84:1786-1788)。由于技術局限，目前這些手段大多還處于 分離單個細胞或者痕量分子，其分辨率也只有微米尺度，但對單個病毒和單 個病毒的分離仍然是比較困難的，并且不能夠定位分離。原子力顯微鏡(atomic force microscopy, AFM)不僅是一種具有納米分 辨率的成像手段，而且也是一種可以進行納米定位操縱的工具(^cr朋，2002， 33: 385-397)。人們先后嘗試了用AFM探針分離微量甚至單個生物分子。如 Heckl教授領導的研究小組于1997年率先實現了對染色體的特定區域的精確 分離C/分/Y/W. Wo:， 1997， 119: 232-237)，但獲得的物質是包括蛋白質 與核酸等在內的混合物，無法每次都獲得完全一致的樣品；后來，0esterhalt 等用AFM針尖從嗜鹽菌紫膜上分離出了單個蛋白質分子(^ie/7"， 2000， 286:143-146)，但問題在于事先要特定的抗體對針尖做修飾，其重復性也存在問 題；2003年Osada等將AFM針尖插入到細胞內部分離mRNA，從而研究了基因在 細胞內的表達情況，但這只能夠通過隨機黏附的方式來實現，無法準確定位， 更不能保證每次分離的數量(Journal of W朋oZu'"ec力/7^0^7， 2003， 1: 2)。 Lu等用AFM針尖成功地實現了對單個DNA分子的定位切割和分離(/. ^瓜C力e邁. 5bc， 2004， 126: 11136-11137)，但由于病毒大多為蛋白質外殼包被的顆 粒，直徑在幾十納米到幾百納米大小，要比蛋白質和DNA大很多，且十分易碎， 但目前還沒有用AFM來分離單個病毒的報道。發明內容本發明要解決的技術問題就是克服上述已有技術的局限，提供一種可對 單個病毒分離與純化的方法。本發明所提供的一種單個病毒的分離方法概括地說就是采用納米操縱技 術分離單個病毒的方法。具體地說，該方法包括下列步驟-(1) 將病毒樣品放置于平整的基底表面；(2) 利用可成像的分離裝置對病毒樣品進行成像，并獲取其物理性質；(3) 根據物理性質不同選定單個病毒； (4)用分離裝置探針針尖在含有單個病毒的區域內掃描，當針尖掃描到病毒附近時，根據所要分離的病毒的物理性質，降低針尖到一定高度，使針尖與病毒接觸并將病毒黏附在針尖上，從而實現單個病毒的分離。所說的基底，最好是原子級平整的基底，可以是云母，也可以是硅，也可以是玻璃、也可以是石墨，還可以是化學修飾后的基底。所說的病毒樣品可以是經純化或不純化的病毒溶液，也可以是含有病毒的組織或細胞切片。所說的單個病毒可以是病毒顆粒，也可以是裸露病毒。 所說的根據物理性質不同選定單個病毒，是根據病毒的形貌、大小、彈性選擇。所述使針尖與病毒接觸并將病毒黏附在針尖上的步驟是通過推的納米 操縱，改變探針針尖的降低的高度來調節針尖與病毒之間的作用力而實現。 所說的分離單個病毒，可以是一次只分離一個病毒，也可以是連續分離單個病毒。所述分離裝置為原子力顯微鏡或基于原子力顯微鏡原理的裝置。 所說的分離裝置的探針可以經過修飾或不經修飾。所說分離裝置的探針的針尖為單個，也可以是探針陣列，從而可以進行 并行分離。所說的分離裝置的探針可對處于空氣、液體或真空環境的樣品進行分離。所說的探針針尖的降低可以通過抬高模式(liftmode)，也可以通過改 變設置點(setpoinO或振幅大小實現。所說的病毒可以為不同大小、不同形狀、有或無包膜、DNA病毒或RNA 病毒，類病毒或病毒樣顆粒。本發明能夠對單個病毒進行分離，且能進行定位分離。由于是定位分離， 就可以根據病毒的性質、大小、彈性等物理性質的不同有目標性的分離特定 的病毒顆粒。且由于絕大多數病毒是由蛋白質包被的RNA或DNA的顆粒，并 且容易破裂，所以通常分離DNA或蛋白質的技術是無法實現對單個病毒的分 離的。也正是由于大多數病毒是蛋白質包被的RNA或DNA顆粒，本發明對單 個病毒分離的實現，使得可以對RNA或DNA進行后續生化分析，具有重要的 生物學意義和應用價值。


圖1是利用原子力顯微鏡探針分離病毒的過程示意圖。其中a顯示了分 離前的狀態，圈定的區域為要分離的病毒，b顯示了探針黏附并分離病毒后 的狀態。圖2是利用原子力顯微鏡探針分離腺相關病毒其中a為分離前的原子 力顯微鏡圖像；b為分離后的原子力顯微鏡圖像。圖中，標尺為500納米。圖3是利用原子力顯微鏡探針分離古菌病毒其中a為分離前的原子力 顯微鏡圖像；b為分離后的原子力顯微鏡圖像。圖中，標尺為500納米。
具體實施方式
下面著重以腺相關病毒、古菌病毒、黃瓜花葉病毒、空殼腺相關病毒為例來說明本發明的方法。實施例1:利用原子力顯微鏡納米操縱技術分離與純化單個腺相關病毒的 方法具體步驟如下1、 將病毒樣品放置于原子級平整的基底表面；為了使病毒在基底表面有適中的吸附力以同時滿足AFM成像和可以分離 的需要,必須根據病毒本身的性質選擇適當的基底或對基底進行適當的處理。 為達到分離腺相關病毒的目的，我們選用了云母作為固態基底。2、 用原子力顯微鏡(AFM)對腺相關病毒進行成像，獲得腺相關病毒的高 度與大小等物理性質；首先進行腺相關病毒樣品準備，腺相關病毒購自本元正陽基因技術股份 有限公司(目錄號A20115a，產品名稱rAAV2-Nu11)，病毒用超純水稀釋 至107v.g/Vl，取4pl上述病毒溶液滴加于潔凈的云母片中心，靜置5分鐘 用潔凈空氣或者液氮吹干，用AFM進行成像。成像時，釆用AFM輕敲模式 (tapping mode),在相對濕度為30 40%下的大氣條件下獲取，見圖2a。3、 在適當的區域選定單個病毒顆粒；根據病毒的大小(直徑20nm左右)與高度，選定所要分離的目標病毒。 為了更有效的分離樣品，最好是選擇那些在基底上只有一個病毒，且在其周 圍一定距離內，沒有其他樣品存在的區域。選定樣品后，將其定位在盡可能 小的區域內的中心位置，然后執行分離過程。4、 用原子力顯微鏡針尖在含有單個病毒的區域內掃描，當針尖快掃 描到病毒時，降低針尖，使針尖與病毒接觸，并進行"推"的納米操縱，通 過改變設置點來改變探針針尖的減低的高度，從而調節針尖與病毒之間的作 用力，使病毒黏附在針尖上，從而實現單個病毒的分離。具體過程為先用AFM輕敲模式掃描一條線，獲得這條線的信息(力，或 者它所轉換成的高度)，然后對同一條線進行第二次接觸模式(contact)掃描 時進行監視和調整(改變掃描力的大小)從而實現對這條線的操縱。整個成像 和操縱過程不用退出AFM的反饋系統而連續進行。這樣的操縱可以獲得很高 的精確性，而這主要是受探針尺度的限制。在實行"分離"的納米操縱時，獲得一幅圖像，如圖3a，選定感興趣的區域；接下來，通過增加力來驅動AFM 探針與選定區域接觸，從而利用AFM探針的移動，并且掃描的區域要盡量小， 然后執行二維掃描過程，在此掃描過程中通過改變探針對樣品分子所施力的 大小，克服基底對樣品的吸附使樣品轉移吸附到探針上，從而完成病毒顆粒 的分離，見圖2b。本實施例中原子力顯微鏡的探針的針尖為單個。以上病毒的AFM成像和 分離都是在NAN0Scope Ilia AFM系統上完成的，并在空氣環境下進行。掃 描頭為E型。AFM探針為Force modulation探針(Digital Instrument,美 國)。以上實施例中的原子力顯微鏡是現行商用儀器。實施例2:利用原子力顯微鏡納米操縱技術分離與純化單個古菌病毒的方法具體步驟如下1、 將病毒樣品放置于原子級平整的基底表面，此處選用硅片作為固態基 底。2、 用原子力顯微鏡(AFM)對古菌病毒進行成像，獲得古菌病毒的物理性質；首先進行古菌病毒樣品準備，古菌病毒為本實驗室自行從古菌中提取， 未經純化。上述病毒溶液置于潔凈的硅片中心，靜置5分鐘用潔凈空氣或者 液氮吹干，用AFM進行成像。成像時，采用AFM接觸模式，在相對濕度為30~40% 下的大氣條件下獲取，見圖3a。在圖像上有兩種大小明顯不同的病毒， 一種 直徑為40-50nm， 一種為120nm左右，本實施例分離40nm的小病毒。3、 在適當的區域選定直徑為80nm左右的單個病毒顆粒； 選擇在基底上只有一個病毒，且在其周圍一定距離內沒有其他樣品存在的區域。選定樣品后，將其定位在盡可能小的區域內的中心位置，然后執行 分離過程。4、 用原子力顯微鏡針尖在含有單個病毒的區域內掃描，當針尖快掃 描到病毒時，降低針尖，使針尖與病毒接觸，并進行"推"的納米操縱，通 過改變振幅大小來改變探針針尖的減低的高度調節針尖與病毒之間的作用 力，使病毒黏附在針尖上，從而實現單個病毒的分離，如圖3b所示；在分離 完一個病毒后，用同一個針尖，再次執行上述過程，分離獲得了第二個病毒。具體過程同實施例l。
本實施例中原子力顯微鏡的探針的針尖為單個。
以上病毒的AFM成像和分離是在Bioscopy (Digital Instrument,美國) 上完成的，并在真空環境下進行。掃描頭為J型。AFM探針為硅探針 (Silicon-MDT Ltd.,俄羅斯)。以上實施例中的原子力顯微鏡是利用基于原 子力顯微鏡原理設計的分離裝置。
實施例3:利用原子力顯微鏡納米操縱技術分離與純化單個黃瓜花葉病毒 的方法
具體步驟如下
1、 將含有病毒的組織切片放置于平整的基底表面，此處選用聚賴氨酸修 飾的玻璃片基底。將患花葉病的黃瓜葉片按常規的組織切片的方法制備病毒 樣品。
2、 用原子力顯微鏡(AFM)對黃瓜花葉病毒進行成像，在組織中找到含有 病毒的區域；成像時，采用AFM接觸模式，在近似真空的環境中。從圖像中 可以看到直徑為25nm左右的顆粒，與周圍組織有明顯的差別。
3、 在適當的區域選定圓形且直徑為25納米左右的單個病毒顆粒； 選擇在基底上只有一個病毒，且在其周圍一定距離內沒有其他樣品存在
的區域。選定樣品后，將其定位在盡可能小的區域內的中心位置，然后執行 分離過程。
4、用原子力顯微鏡針尖在含有單個病毒的區域內掃描，當針尖快掃描到病 毒時，降低針尖，使針尖與病毒接觸，并進行"推"的納米操縱，通過改變 設置點的大小來改變探針針尖的減低的高度調節針尖與病毒之間的作用力， 使病毒黏附在針尖上，從而實現單個病毒的分離。 具體過程同實施例l。
本實施例中原子力顯微鏡的探針的針尖為多個，用不同的針尖同時分離 多個病毒。
以上病毒的AFM成像和分離是在Bioscopy (Digital Instrument,美國) 上完成的，并在真空環境下進行。掃描頭為E型。AFM探針為氮化硅探針 (Silicon-MDT Ltd.,俄羅斯)。以上實施例中的原子力顯微鏡是利用基于原 子力顯微鏡原理設計的分離裝置。實施例4:利用原子力顯微鏡納米操縱技術分離與純化單個空殼腺病毒的 方法
具體步驟如下
1、 將病毒樣品放置于原子級平整的基底表面；
為了使病毒在基底表面有適中的吸附力以同時滿足AFM成像和可以分離 的需要，必須根據病毒本身的性質選擇適當的基底或對基底進行適當的處理。 為達到分離腺相關病毒的目的，我們選用了用聚賴氨酸修飾的云母作為固態
基底o
2、 用原子力顯微鏡(AFM)對腺病毒進行成像，并獲取病毒的物理性質， 空殼病毒的彈性要小于非空殼的病毒。
首先進行空殼腺病毒樣品準備，空殼腺病毒購自本元正陽基因技術股份 有限公司(目錄號Ad0125d，產品名稱Ad5F35-Nu11 )，病毒用超純水稀 釋至107v.g/pl，取4[al上述病毒溶液滴加于修飾后云母片中心，靜置5分 鐘用者液氮吹干，用AFM進行成像。成像時，采用AFM輕敲模式(tapping mode),在相對濕度為10 20%下的大氣條件下獲得該病毒的彈性特征。
3、 在適當的區域選定單個空殼病毒顆粒；
通過phase相判斷去彈性差異或者通過Xingfei Zhou等(Physical Review E， 71: 062901， 2005)的方法測定其彈性，確定哪些是空殼病毒。 為了更有效的分離樣品，最好是選擇那些在基底上只有一個病毒，且在其周 圍一定距離內，沒有其他樣品存在的區域。選定樣品后，將其定位在盡可能 小的區域內的中心位置，然后執行分離過程。
4、用原子力顯微鏡針尖在含有單個病毒的區域內掃描，當針尖快掃描到空殼 病毒時，因為是要分離空殼病毒，要比分離實心病毒多降低l-2mn，使針尖 與病毒接觸，并進行"推"的納米操縱，通過改變振幅來改變探針針尖的減 低的高度，從而調節針尖與病毒之間的作用力，使病毒黏附在針尖上，從而 實現單個病毒的分離。
本實施例中原子力顯微鏡的探針的針尖為單個。以上病毒的AFM成像和 分離都是在NAN0Scope IV AFM系統上完成的，并在空氣環境下進行。掃描 頭為E型。AFM探針為Force modulation探針(Digital Instrument,美國)。 以上實施例中的原子力顯微鏡是現行商用儀器。
對其他不同大小、不同形狀、有或無包膜、DNA病毒或RNA病毒也可以采 用上述基于原子力顯微鏡的納米操縱的方法得以分離，在此不再贅述。
權利要求
1、一種單個病毒的分離與純化方法，其特征在于該方法包括下列步驟(1)將病毒樣品放置于平整的基底表面；(2)利用可成像的分離裝置對病毒樣品進行成像，并獲取病毒的物理性質；(3)根據物理性質選定單個病毒；(4)用分離裝置探針針尖在含有單個病毒的區域內掃描，當針尖掃描到病毒附近時，根據所要分離的病毒的物理性質，降低針尖到一定高度，使針尖與病毒接觸并將病毒黏附在針尖上，從而實現單個病毒的分離。
2、 根據權利要求1所述的方法，其特征在于該基底為原子級平整的基底。
3、 根據權利要求1所述的方法，其特征在于病毒樣品是經純化或不純 化的病毒溶液或含有病毒的組織或細胞切片。
4、 根據權利要求1所述的方法，其特征在于選定單個病毒的步驟中，所 述病毒的物理性質是根據病毒的形貌、大小、彈性選擇。
5、 根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述使針尖與病毒接觸并 將病毒黏附在針尖上的步驟是通過推的納米操縱，改變探針針尖的降低的高 度來調節針尖與病毒之間的作用力而實現。
6、 根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述單個病毒的分離包括 一次只分離一個病毒或連續分離單個病毒。
7、 根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述分離裝置為原子力顯 微鏡或基于原子力顯微鏡原理的裝置。
8、 、根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于該基底為云母、硅片、 玻璃、石墨或化學修飾后的基底。
9、 根據權利要求1或3所述的方法，其特征在于病毒樣品中的單個病 毒是有包膜的病毒顆粒或裸露病毒。
10、 根據權利要求1或3所述的方法，其特征在于所述病毒樣品為處于 空氣、液體或真空環境的樣品。
11、 根據權利要求5所述的方法，其特征在于所述探針針尖的降低通過抬高樣品、改變設置點或振幅大小實現。
12、 根據權利要求l、 5或11所述的方法，其特征在于所述探針的針尖 為經過修飾的或不經修飾的。
13、 根據權利要求l、 5或11所述的方法，其特征在于所述探針的針尖 為單個或陣列。
14、 根據權利要求9所述的方法，其特征在于所述病毒樣品為處于空氣、 液體或真空環境的樣品。
15、 根據權利要求12所述的方法，其特征在于所述探針的針尖為單個或 陣列。
全文摘要
本發明提供一種單個病毒的分離與純化方法，該方法包括以下步驟①將病毒樣品放置于平整的基底表面；②利用原子力顯微鏡對病毒進行成像，獲取病毒的物理性質；③在適當的區域根據物理性質選定單個病毒；④用原子力顯微鏡針尖在含有單個病毒的區域內掃描，當針尖快掃描到病毒時，根據物理性質確定降低針尖的高度，使針尖與病毒接觸，并進行“推”的納米操縱，通過改變探針針尖的減低的高度來調節針尖與病毒之間的作用力，使病毒吸附在針尖上，從而實現單個病毒的分離。本發明能夠對單個病毒進行分離，且能進行定位分離，即根據病毒的形貌、大小、彈性等物理性質的不同有目標性的分離特定的病毒顆粒。此外，本發明使得可以對RNA或DNA進行后續生化分析，具有重要的生物學意義和應用價值。
文檔編號C12N7/00GK101565691SQ200810036428
公開日2009年10月28日 申請日期2008年4月22日 優先權日2008年4月22日
發明者呂軍鴻, 鵬 王, 鈞 胡 申請人:中國科學院上海應用物理研究所