專利名稱：：無動物組分細胞培養基的制作方法
技術領域：
：本發明是對現有細胞培養基組分的改進，尤其是提供了一種無動物組分細胞培養基，屬于生物材料
技術領域：
。
背景技術：
：細胞培養基是生物
技術領域：
中培養細胞主要的生物材料，直接影響到細胞的質量，只有好的培養基才能篩選、馴化出優質細胞。現有的細胞培養基中基本都含有小牛血清，用于維持細胞在體外較長時間生長繁殖，鑒于血清含有一些對細胞產生毒性的物質，會影響細胞的生長，甚至會造成細胞死亡，同時也增加了工業化生產中分離純化的難度，目前，已有無血清培養基問世，但是在原代培養或者細胞生長狀況不良時還是只能先用無血清的培養液進行培養，待細胞生長旺盛以后才能再換成現有無血清培養液；而且多數細胞轉入現有的無血清培養基培養要有一個適應的過程，一般要逐步降低血清濃度，直至無血清培養。由于目前的無血清培養基包含非常少的蛋白質，所以更易于受外界因素影響，并缺乏血清中天然中和毒素、保護細胞大分子，容易導致所培養細胞的致死性損害。
發明內容本發明提供一種無動物組分細胞培養基，解決了現有無血清培養基不能直接培養生長狀況不良的細胞，多數細胞要逐歩降低血清濃度才能適應現有的無血清培養基及易受外界因素影響、容易造成致死性損害的問題。本發明無動物組分細胞培養基是由以下物質制成的細胞培養基中含196-204mg氯化鈣、392-408mg氯化鉀、95.72-99.62mg無水硫酸鎂、6664-6936mg氯化鈉、119.31-124.17mg無水磷酸二氫鈉、123.48-128.52mgL-精氨酸鹽酸鹽、30.66-31.92mgL-胱氨酸鹽酸鹽、286.16-297.84mgL-谷氨酰胺、50.96-53.04mgL-亮氨酸、50.96-53.04mgL-異亮氨酸、41.16-42.84呢L-組氨酸鹽酸鹽、35.28-36.72mgL-酪氨酸、980-1020mgD葡萄糖、0.99-1.Olmg氯化膽堿、0.99-1.Olmg葉酸、0.99-1.Olmg煙酰胺、0.99-1.Olfflg鹽酸吡哆醛、0.09-0.llmg核黃素、0.99-1.Olmg鹽酸硫胺。在上述組方中還含有71.05-73.95mgL-賴氨酸鹽酸鹽、14.70-15.30mgL-蛋氨酸、31.36-32.64mgL-苯丙氨酸、45.08-46.92呢L-纈氨酸、47.04-48.96呢L-蘇氨酸、9.80-10.20mgL-色氨酸、1.98-2.02mgi-肌醇、9.98-10.02mg酚紅、0.99-l.OlmgD泛酸鈣。本發明的無動物組分細胞培養基的制備工藝如下按上述比例稱取原料，混合均勻即得本發明細胞培養基。使用時，將本發明培養基溶于1000ml水中，經除菌過濾后即可使用。本發明細胞培養基使用多種氨基酸以化學加工合成，完全替代血清培養基中的氨基酸組分，同時也減輕了后期分離純化的工作壓力。本發明細胞培養基可用于培養CHO細胞、NSO細胞、BHK21細胞、VERO細胞、HEK293細胞、MDCK細胞、HeLa細胞、MDBK細胞等細胞。對于必須添加血清培養的特殊細胞，如Marcl45細胞、骨髓間充質干細胞等，在本發明的細胞培養基中添加<3%質量的低量血清后即可實現成功培養，而現有血清培養基中則必須加入量為質量的8%10%。下面通過培養VERO細胞的對比試驗表明本發明的積極效果使用本發明制備的細胞培養基和普通MEM細胞培養基(產品代碼MD600，批號080312)在37。C的條件下直接培養復蘇后的VER0細胞，并用顯微鏡觀察各組細胞形態及生長增殖情況。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>本發明培養基培養的細胞分裂百分率明顯優于普通MEM細胞培養基，培養基中細胞長成單層的時間與傳統培養基相同，而且細胞形態基本一致(VER0細胞在不同培養基中的形態分別如圖1和圖2所示)。本發明培養基的營養成分優于普通血清培養基，培養基中細胞增殖迅速，代謝旺盛，細胞分裂百分率(24h)明顯高于普通血清培養基。本發明相對于現有技術具有的優點和進步細胞可直接在細胞培養基上培養，而不必逐步馴化和培養，增加了所培養細胞的密度及收獲次數，提高表達量，從而提高醫藥領域的疫苗產量；可有效的避免動物源性對所培養動物或人細胞的干擾。解決了現有無血清培養基培養細胞過早死亡、形態不飽和的問題。本發明培養基培養的細胞不易發生老化脫落現象，細胞增殖迅速、代謝旺盛，細胞成活率高達95%以上，簡化了后期的分離純化工藝，使雜質含量降低，提高產品純度，降低生產成本。圖l、為本發明細胞培養基在Vero細胞捕捉照片；圖2、為G舊CO公司(美國)培養基在Vero細胞捕捉照片。具體實施例方式通過以下實施例進一步舉例描述本發明，并不以任何方式限制本發明，在不背離本發明的技術解決方案的前提下，對本發明所作的本領域普通技術人員容易實現的任何改動或改變都將落入本發明的權利要求范圍之內。實施例l細胞培養基中含196mg氯化f丐、392mg氯化鉀、95.72mg無水硫酸鎂、6664呢氯化鈉、119.31mg無水磷酸二氫鈉、123.48mgL-精氨酸鹽酸鹽、30.66mgL-胱氨酸鹽酸鹽、286.16mgL-谷氨酰胺、50.96mgL-亮氨酸、50.96mgL-異亮氨酸、41.16mgL-組氨酸鹽酸鹽、35.28mgL-酪氨酸、980ragD葡萄糖、0.99mg氯化膽堿、0.99mg葉酸、0.99mg煙酰胺、0.99mg鹽酸吡哆醛、0.09mg核黃素、0.99mg鹽酸硫胺，混合均勻即可。實施例2在實施例l的原料中添加73.95呢L-賴氨酸鹽酸鹽、15.30mgL-蛋氨酸、32.64mgL-苯丙氨酸、46.92mgL-纈氨酸、48.96mgL-蘇氨酸、10.20mgL-色氨酸、2.04mgi-肌醇、10.20mg酚紅、1.02mgD泛酸鈣，混合均勻即可。實施例3本發明細胞培養基的制備無動物組分細胞培養基由200mg氯化鈣、400mg氯化鉀、97.67mg無水硫酸鎂、6800mg氯化鈉、121.7鈿g無水磷酸二氫鈉、126mgL-精氦酸鹽酸鹽、31.92mgL-胱氨酸鹽酸鹽、292mgL-谷氨酰胺、42mgL-組氨酸鹽酸鹽、52mgL-異亮氨酸、52mgL-亮氨酸、72.5ragL-賴氨酸鹽酸鹽、15mgL-蛋氨酸、32mgL-苯丙氨酸、48mgL-蘇氨酸、lOmgL-色氨酸、36mgL-酪氨酸、46mgL-纈氨酸、1000mgD葡萄糖、10mg酚紅、lmgD泛酸鈣、lmg氯化膽堿、lmg葉酸、2mgi-肌醇、lmg煙酰胺、lmg鹽酸吡哆醛、0.lmg核黃素、lmg鹽酸硫胺混合均勻制成。實施例4本發明細胞培養基的制備由204mg氯化鈣、408mg氯化鉀、99.62mg無水硫酸鎂、6936rag氯化鈉、124.17mg無水磷酸二氫鈉、128.52mgL-精氨酸鹽酸鹽、31.60mgL-胱氨酸鹽酸鹽、297.84ragL-谷氨酰胺、42.84呢L-組氨酸鹽酸鹽、53.04mgL-異亮氨酸、53.04mgL-亮氨酸、73.95mgL-賴氨酸鹽酸鹽、15.30mgL-蛋氨酸、32.64mgL-苯丙氨酸、48.96mgL-蘇氨酸、10.20mgL-色氨酸、36.72呢L-酪氨酸、46.92mgL-纈氨酸、1020ragD葡萄糖、10.02mg酚紅、1.OlmgD泛酸鈣、l.Olmg氯化膽堿、l.Olmg葉酸、2.02mgi-肌醇、l.Olmg煙酰胺、1.Olmg鹽酸吡眵醛、0.llmg核黃素、l.Olmg鹽酸硫胺混合均勻制成。實施例5細胞培養基中含204mg氯化鈣、408mg氯化鉀、99.62mg無水硫酸鎂、6936mg氯化鈉、124.17mg無水磷酸二氫鈉、128.52mgL-精氨酸鹽酸鹽、31.92mgL-胱氨酸鹽酸鹽、197.84mgL-谷氨酰胺、53.04mgL-亮氨酸、53.04mgL-異亮氨酸、42.84mgL-組氨酸鹽酸鹽、36.72mgL-酪氨酸、1020mgD葡萄糖、1.Olmg氯化膽堿、1.Olrag葉酸、1.Olmg煙酰胺、1.Olmg鹽酸吡哆醛、0.llmg核黃素、1.Olmg鹽酸硫胺混合均勻即可。實施例6在實施例5中還含有71.05mgL-賴氨酸鹽酸鹽、14.70mgL-蛋氨酸、31.36mgL-苯丙氨酸、45.08mgL-纈氨酸、47.04mgL-蘇氨酸、9.80mgL-色氨酸、1.98mgi-肌醇、9.98mg酚紅、0.99mgD泛酸鈣混合均勻即可。實施例7本發明細胞培養基的制備由196呢氯化f丐、392rag氯化鉀、95.72rag無水硫酸鎂、6664mg氯化鈉、119.31mg無水磷酸二氫鈉、123.48mgL-精氨酸鹽酸鹽、30.66mgL-胱氨酸鹽酸鹽、286.16mgL-谷氨酰胺、41.16mgL-組氨酸鹽酸鹽、50.96mgL-異亮氨酸、50.96mgL-亮氨酸、71.05mgL-賴氨酸鹽酸鹽、14.70mgL-蛋氨酸、31.36mgL-苯丙氨酸、47.04呢L-蘇氨酸、9.80mgL-色氨酸、35.28mgL-酪氨酸、45.08mgL-纈氨酸、980mgD葡萄糖、9.98mg酚紅、0.99mgD泛酸鈣、0.99mg氯化膽堿、0.99nig葉酸、1.98mgi-肌醇、0.99mg煙酰胺、0.99mg鹽酸吡哆醛、0.09mg核黃素、0.99mg鹽酸硫胺混合均勻即可。實施例8細胞培養基中含200mg氯化鈣、400mg氯化鉀、97.67mg無水硫酸鎂、6800mg氯化鈉、121.74mg無水磷酸二氫鈉、126mgL-精氨酸鹽酸鹽、31.29ragL-胱氨酸鹽酸鹽、292mgL-谷氨酰胺、52呢L-亮氨酸、52mgL-異亮氨酸、42mgL-組氨酸鹽酸鹽、36mgL-酪氨酸、1000mgD葡萄糖、lmg氯化膽堿、lmg葉酸、0.99-l.Ol呢煙酰胺、lfflg鹽酸吡哆醛、0.lmg核黃素、lmg鹽酸硫胺，混合均勻制成。實施例9在實施例8中還含有72.5mgL-賴氨酸鹽酸鹽、15mgL-蛋氨酸、32mgL-苯丙氨酸、46mgL-纈氨酸、48mgL-蘇氨酸、lOmgL-色氨酸、2mgi-肌醇、10mg酚紅、lmgD泛酸鈣。權利要求1、一種無動物組分細胞培養基，是由以下物質制成的細胞培養基中，含196-204mg氯化鈣、392-408mg氯化鉀、95.72-99.62mg無水硫酸鎂、6664-6936mg氯化鈉、119.31-124.17mg無水磷酸二氫鈉、123.48-128.52mgL-精氨酸鹽酸鹽、30.66-31.92mgL-胱氨酸鹽酸鹽、286.16-297.84mgL-谷氨酰胺、50.96-53.04mgL-亮氨酸、50.96-53.04mgL-異亮氨酸、41.16-42.84mgL-組氨酸鹽酸鹽、35.28-36.72mgL-酪氨酸、980-1020mgD葡萄糖、0.99-1.01mg氯化膽堿、0.99-1.01mg葉酸、0.99-1.01mg煙酰胺、0.99-1.01mg鹽酸吡哆醛、0.09-0.11mg核黃素、0.99-1.01mg鹽酸硫胺。2、權利要求1所述的細胞培養基，其特征在于含有71.05-73.95mgL-賴氨酸鹽酸鹽、14.70-15.30mgL-蛋氨酸、31.36-32.64mgL-苯丙氨酸、45.08-46.92mgL-纈氨酸、47.04-48.96mgL-蘇氨酸、9.80-10.20mgL-色氨酸、1.98-2.02mgi-肌醇、9.98-10.02mg酚紅、0.99-1.OlmgD泛酸鈣。3、權利要求1或2所述的細胞培養基的制備工藝如下按比例稱取原料，混合均勻即得。全文摘要本發明提供一種無動物組分細胞培養基，是由氯化鈣、氯化鉀、無水硫酸鎂、氯化鈉、無水磷酸二氫鈉、L-精氨酸鹽酸鹽、L-胱氨酸鹽酸鹽、L-谷氨酰胺、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-組氨酸鹽酸鹽、L-酪氨酸、D葡萄糖、氯化膽堿、葉酸、煙酰胺、鹽酸吡哆醛、核黃素、鹽酸硫胺等按比例混合制成的。細胞可直接在本發明的細胞培養基上培養，而不必逐步馴化和培養，增加了所培養細胞的密度及收獲次數，提高表達量，從而提高醫藥領域的疫苗產量；可有效的避免動物源性對所培養動物或人細胞的干擾。解決了現有無血清培養基培養細胞過早死亡、形態不飽和的問題。文檔編號C12N5/07GK101381702SQ200810051140公開日2009年3月11日申請日期2008年9月10日優先權日2008年9月10日發明者雷王申請人:吉林省賽達生物科技有限公司