專利名稱：一種提高蛹蟲草液體發酵蟲草菌素產量的方法
技術領域：
本發明涉及真菌發酵工程，具體而言涉及蛹蟲草液體發酵高產蟲草菌素 及高含蟲草菌素菌絲體的生產方法。
背景技術：
，隸屬于真菌界、子囊菌門、子囊菌綱、糞殼菌亞綱、肉座菌 目、麥角菌科、蟲草屬，又名北蟲草，北冬蟲夏草。它是蟲草屬真菌的模式 種，蛹蟲草含有多種有效成分，包括蟲草酸(D-甘露醇)、蟲草多糖、蟲草菌 素(cordyc印in)、麥角甾醇過氧化物和蟲草環肽等。
人們對蛹蟲草的藥理作用進行了大量的研究，證實其具有廣泛的藥理學 活性及臨床作用。蛹蟲草菌粉及膠囊于2003年被批準為國家一類新藥(中 藥)。產品標識其具有補肺益腎、止咳化痰之功效，能夠調節機體免疫功能， 提高機體綜合抗病能力，主要用于慢性支氣管炎、各種腫瘤及其它免疫系統 疾病的治療。經大量的研究證明，蛹蟲草液體發酵生產的菌絲體與天然冬蟲 夏草的成份極相似，并證明了它與天然冬蟲夏草有相似的藥理作用與臨床效 果，甚至在某些方面優于天然的冬蟲夏草(如毒性比天然的小)，可以代替 冬蟲夏草在臨床廣泛應用。
蟲草菌素即3'-脫氧腺苷(y-Deoxyadenosine),又稱蛹蟲草菌素，由 Curmingham等于l951年從蛹蟲草的培養濾液中分離得到。蟲草菌素是第一 個從真菌中分離出來的核苷類抗菌素。蟲草菌素的分子式為doHJA,分子 量251，堿性，針狀或片狀結晶，熔點230°C ~231°C，溶于水、熱乙醇和甲 醇，不溶于苯、乙醚和氯仿，蒽酮反應陽性，紫外光最大吸收波長為259nm。蟲草菌素具有多種生物學活性，比如抑菌作用、抗腫瘤作用、抑制人體免 疫缺陷病毒HIVI型病毒的作用、免疫調節作用、減肥和降血糖、降血脂作用。 其中，降血脂方面的效果尤為明顯，與巿售的法國力博福尼制藥公司生產的 非諾貝特(力平之)效果相當或優于非諾貝特；在治療白血病方面也在美國 由FDA批準進入了臨床研究(1997年11月美國癌癥研究所，2008年7月美 國0ncoVista公司)。蟲草菌素的結構式為
近年來，蛹蟲草的生產與應用受到了人們的關注，涉及蛹蟲草的專利申 請近百件。但是決大多數集中在固體培養的研究方面，涉及液體培養的很少， 例如200610010482. 4號"蛹蟲草液體靜置培養技術"、200510050531. 2號"一 種北冬蟲夏草液體菌種營養基的制備方法及其應用"、01124109.8 "發酵培 養生產蟲草素的方法"，但以上發明其單位產量很低，最高只有7.1mg/L; O3135295.2 "—種提高蟲草菌素含量的方法"公開了一種提高蟲草菌絲中蟲 草菌素含量的方法，但其采用752型分光光度計的檢測方法不當，因最大吸 收峰相近，未能將蟲草菌素和其他核苷類物質(如腺苷)區分開。故只有通 過工藝方法的改進才可克服現有缺點從而高效提高蛹蟲草蟲草菌素的產量。

發明內容
本發明的目的在于提供一種提高蛹蟲草液體發酵蟲草菌素產量的方法，
Cordycepin (3'-deoxyadenosine)
4以克服現有技術蛹蟲草菌絲體中蟲草菌素含量低和發酵液中蟲草菌素單位 產量低的缺陷。
本發明所使用的菌株為蛹蟲草(Corc^ce;^肌7/"r")無性型蛹草擬 青霉(/we"7湖7C"肌7/"/"/s) PM-71菌株，已于2008年4月17曰在中國微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，編號為CGMCCNo.2459。
發明人經過系統的研究和試驗后，提出了通過添加劑提高蛹蟲草液體發 酵蟲草菌素的產量，以及高含蟲草菌素蛹蟲草菌絲體的生產方法，方法包括
(1) 將菌株轉接于斜面培養基上進行培養、活化，得到斜面母種；
(2) 將斜面母種制成孢子濃度適中的孢子懸液，接于液體母種培養基中， 搖瓶培養，得到液體母種；
(3) 在發酵培養基中，加入添加劑腺嘌呤和甘氨酸按照一定比例配成的 復合物，高溫滅菌后冷卻，再將液體母種接入，搖瓶培養，得到含菌絲體(大 部分為菌絲球)的發酵液；
(4) 通過過濾將菌絲體及發酵液分離，用純凈水沖洗菌絲，洗去培養基 后，收集菌絲體，烘至恒重，制得高含蟲草菌素的干菌絲體。
在上述第二步的蛹蟲草液體母種制作方法中，所用的培養基配方為蛋白 胨1%,蔗糖2%, MgSO, 7H20 0.05 %, KH2P04 0. 1 %,水1000 mL, pH值自 然；所用工藝條件是液體母種培養基裝液量為5(hnL/250mL三角瓶；液體母 種于23。C、轉速150 r/ min下培養4d。
在上述第三步的蛹蟲草液體發酵過程中，所用的培養基配方為腺P票呤 0. 1 % ，甘氨酸O. 1 % ~ 1. 6 % ,蛋白胨l. 5 % ,蔗糖2 % ， MgS04 7H20 0. 05 % , KH2PO40.1%,水1000 mL, pH值自然；所用工藝條件是裝液量100mL/500mL 三角瓶，采用5%接種量將種子液接入發酵搖瓶中，在23。C下搖床以150 i7 min轉速培養lld。發明人指出，本發明的關鍵技術在于在發酵培養基中，同時加入腺嘌呤 和甘氨酸作為添加劑可以提高蛹蟲草液體發酵生產蟲草菌素的產量和效率。 腺喋呤和甘氨酸能有效地協同作用，使蟲草菌素產量明顯提高。同時使用
lg/L的腺嘌呤和8g/L的甘氨酸作為添加劑時，蟲草菌素產量最高，發酵液中 蟲草菌素含量為1844.21mg/L,是對照培養基的5. 26倍；菌絲體中蟲草菌素 含量達到了 25.90mg/g,是對照培養基的2.82倍。經檢測所生產的菌絲體里 腺嘌呤和甘氨酸的含量并不高，大部分被轉化成了目標產物。故本發明提高 了有效成分蟲草菌素的含量而不會影響菌絲體的質量。
蟲草菌素含量的檢測方法如下采用HPLC分析發酵液和干菌絲體中蟲草 菌素的含量，HPLC測定用PC2000型HPLC分析儀(Scientific systems Inc. ，PA， USA);檢測波長為259nm;柱溫30。C;流動相為10mM 1(1^04溶于甲醇/雙蒸水 (15:85)，流速為lml/min;進樣量為20jul。蛹蟲草發酵液中蟲草菌素含量 測定可先將發酵液稀釋到適當濃度后經0.45jam濾膜過濾除雜后檢測其中蟲 草菌素的含量；蛹蟲草菌絲體中蟲草菌素含量測定先精密稱取干菌絲粉0.2g 置于具塞試管中，加入雙蒸水10ml，超聲處理30min,然后在5000g下離心 l5min,最后經0."nm濾膜過濾除雜后檢測其中蟲草茵素的含量；若測定前 樣品經過稀釋，則乘以稀釋倍數。
本發明對提高蛹蟲草液體發酵的產量和效率，以及提高原料藥蛹蟲草菌 粉中有效成分的含量具有重要意義；生產的該菌絲可作功能食品，還可用作 原料藥；本方法易操作，蟲草菌素產量高，成本低，適于工業生產。
具體實施例方式
實施例1:將CGMCCNo. 2"9菌株轉接于PDA斜面培養基上25。C下培養 5d、活化2次，得到斜面母種；輕輕刮洗斜面母種并將之制成孢子懸液，然 后用無菌棉過濾掉懸液里的菌絲，每瓶液體母種接入濃度適中的蛹蟲草孢子，使制作的液體種的菌絲球細小而均勻，發酵液澄清透明。液體母種培養
基配方為蛋白胨1%,蔗糖2%, MgS04 . 7H20 0.05 %, KH2P04 0.1%，水 lOOOmL, pH值自然;250mL三角瓶裝液量為50mL，于23。C搖床以150 r/min 轉速培養4d,得到液體母種；
使用最優化的發酵培養基配方為腺嘌呤0.1%,甘氨酸0.8%,蛋白 胨1.5%,蔗糖2%, MgS04 . 7H20 0.05 %, KH2P04 0,1 %，水1000 mL， pH 值自然，高溫滅菌后冷卻，再將液體母種按5%的量接入裝液量為lOOmL的 500mL三角瓶中，在23。C下搖床以150 r/min轉速培養11天，得到大部分 菌絲體形態為菌絲球的發酵液；通過過濾將菌絲體及發酵液分離，再用純凈 水沖洗菌絲，洗去培養基后，收集菌絲體，烘至恒重，采用HPLC分析發酵 液和干菌絲體中蟲草菌素的含量。檢測結果顯示蛹蟲草發酵液中蟲草菌素 含量在1.8g/L以上；干菌絲體中蟲草菌素含量大于2.5%的。
以上所述，僅是本發明的較佳實施例而已，并非對本發明作任何形式上的 限制，任何未脫離本發明技術方案內容，依據本發明的技術實質對以上實施 例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾，均屬于本發明技術方案的范圍內。
權利要求
1.一種提高蛹蟲草液體發酵蟲草菌素產量的方法，該方法包括以下四步(1)將菌株轉接于斜面培養基上進行培養、活化，得到斜面母種；(2)將斜面母種制成孢子濃度一定的孢子懸液，接于液體母種培養基中，搖瓶培養，得到液體母種；(3)發酵培養基高溫滅菌后冷卻，再將液體母種接入，搖瓶培養，得到含菌絲體的發酵液；(4)通過過濾將菌絲體及發酵液分離，用純凈水沖洗菌絲，洗去培養基后，收集菌絲體，烘至恒重，制得蟲草菌素的干菌絲體；其特征在于在液體發酵培養基中添加腺嘌呤與甘氨酸的復合物，添加濃度分別為腺嘌呤0.1％，甘氨酸0.1％～1.6％。
2. 按照權利要求1所述的方法，其特征在于所述方法的第二步中，所 用的液體母種培養基配方為蛋白胨1 % ,蔗糖2 % ， MgS04 '7H" 0. 05 % , KH2P04 0.1%,水IOOO mL， pH值自然。
3. 按照權利要求1所述的方法，其特征在于所述方法的第二步中，所 用工藝條件是液體母種培養基裝液量為50mL/250mL三角瓶；液體母種于23 。C、轉速150 r/ min下培養4d。
4. 按照權利要求l所述的方法，其特征在于所述方法的第三步中，所用 的培養基配方為腺嘌呤O. 1%,甘氨酸O. 1% ~1.6%,蛋白胨l. 5%，蔗糖 2%， MgS04 7H20 0. 05 %, KH2P04 0.1%,水IOOO mL， pH值自然。
5. 按照權利要求1所述的方法，其特征在于所述方法的第三步中，所 用工藝條件是裝液量100mL/500mL三角瓶，釆用5%接種量將種子液接入發 酵搖瓶中，在23。C下搖床以150 r/ min轉速培養lld。
全文摘要
本發明公開了一種提高蛹蟲草液體發酵蟲草菌素產量的方法；該方法包括(1)將菌株轉接于斜面培養基上進行培養、活化，得到斜面母種；(2)將斜面母種制成孢子懸液，接于液體母種培養基中，搖瓶培養，得到液體母種；(3)發酵培養基高溫滅菌后冷卻，再將液體母種接入，搖瓶培養，得到含菌絲體的發酵液；(4)通過過濾將菌絲體及發酵液分離，純凈水沖洗菌絲，洗去培養基，收集菌絲體，烘至恒重，制得干菌絲體；技術關鍵是在發酵培養基中添加腺嘌呤和甘氨酸的復合物，添加濃度為腺嘌呤0.1％，甘氨酸0.1％～1.6％。本方法顯著提高蛹蟲草液體發酵生產蟲草菌素的產量和效率、提高原料藥蛹蟲草菌粉中有效成分的含量；本方法易操作，蟲草菌素產量高，成本低，適于工業生產。
文檔編號C12P19/40GK101492706SQ200810069010
公開日2009年7月29日 申請日期2008年11月25日 優先權日2008年11月25日
發明者康冀川, 文庭池, 祝 李, 李光榮, 雷幫星 申請人:貴州大學