專利名稱：一種利用木糖母液制備2,3-丁二醇的方法
技術領域：
本發明屬于生物化工技術領域，尤其涉及一種利用工業副產物木糖母液制備2， 3-丁 二醇的方法。
背景技術：
2， 3-丁二醇(2， 3-butanedio1)是一種潛在的高附加值的平臺化合物。近年來由于石 油價格的不穩定以及石化產品價格的不斷上漲，2， 3-丁二醇的價格和生產在國際上也引 起越來越廣泛的關注。2， 3-丁二醇是一種無色無味的手性化合物，分子量90.12KDa，沸 點為180-184'C，凝固點較低，D-2， 3-丁二醇(-6(TC)可以作為抗凍劑。2， 3-丁二醇具 有較高的辛烷值，可以用于生產高級航空煤油。脫水可以轉化為工業溶劑甲乙酮，甲乙酮 可以作為燃料添加劑，并可以作為溶劑用于樹脂和制漆業。甲乙酮進一步脫水可以得到1， 3-丁二烯，可以作為底物用于合成橡膠工業(Syu MJ. Biological production of 2,3-butanediol. Appl Microbiol Biotechnol, 2001, 55: 10-18)。在我國，2， 3-丁二醇還被添加到白酒中以改 善白酒風味。2， 3-丁二醇脫氫可以得到乙偶因和丁二酮，可以作為香料作為食品添加劑。 2， 3-丁二醇在油墨、化妝品、香薰劑、軟化劑、增塑劑、炸藥和藥物載體等領域也具有 潛在用途(Xiu ZL, Zeng AP. Present state and perspective of downstream processing of biologically produced 1,3-propanediol and 2,3-butanediol. Appl Microbiol Biotechnol, 2008, 78: 917-926)。
隨著石化資源的日益枯竭以及石化工業對環境的影響，可再生資源引起來了越來越多 的關注。由于石油價格的不斷上漲及其不穩定性，石化產品價格不斷攀升，利用可再生資 源生產生物基大宗化學品如生物燃料等引起人們的極大興趣。利用可再生的生物質資源作 為底物，將生物煉制和綠色化學工業有機結合，可以建立起環境友好的、可持續性發展的 材料化學工業。
木質纖維素生物質原料，來源廣泛，再生迅速。利用生物、化學技術，木質纖維素生 物質原料可以生產可再生的化學品。玉米芯作為一種木質纖維素生物質原料，在我國有極 其廣泛的資源。在我國，一部分木糖醇是利用從玉米芯水解液中提取的木糖為原料制得的。 在該生產工藝中，產生了大量的副產物木糖母液。木糖母液含有濃度較高的混合糖(總糖 為60%左右)，主要是戊糖——木糖和阿拉伯糖，還有少量葡萄糖，具有開發應用的潛力， 但是目前木糖母液僅有少量關于焦糖色素生產的文獻報道，其它開發利用沒有報道，經檢 索，對于以木糖母液發酵生產2， 3-丁二醇的文獻和專利之前更沒有報道。肺炎克雷伯氏 菌具有底物譜廣泛，易于培養等優點，可以利用戊糖和己糖產生2， 3-丁二醇，是2， 3-丁二醇生產的優勢菌株。目前2， 3-丁二醇的發酵生產主要集中在利用葡萄糖為底物(Syu MJ. Biological production of 2,3-butanediol. Appl Microbiol Biotechnol, 2001, 55: 10-18; Qin et al. Production of 2,3-butanediol by Klebsiella pneumoniae using glucose and ammonium phosphate.Chin J Chem Eng, 2006, 14:132-136)，利用含戊糖和己糖的工業副產物原料為底 物發酵生產2， 3-丁二醇的專利尚沒有報道。而充分利用自然資源中的己糖和戊糖生產高 值化學品，可以提高生物質資源的利用效率，降低生產成本。

發明內容
本發明的目的是提供一種利用木糖母液發酵制備2， 3-丁二醇的方法，以實現工業副產物木糖母液的開發利用，生產高值平臺化合物2， 3-丁二醇。
本發明所述利用木糖母液發酵制備2， 3-丁二醇的方法包括如下步驟
(1) 選取木糖母液作為發酵底物，以如下組分配制發酵培養基木糖母液60 200 g/L，檸檬酸三銨2 8g/L，磷酸氫二銨5 40 g/L，乙酸鈉l 6g/L，氯化鉀l 5g/L， 硫酸鎂0.05 0.15 g/L，硫酸鋅0.05 0.20 g/L，硫酸錳0.05 0.20 g/L，硫酸亞鐵0.05 0.20 g/L， pH值調至6.0 7.0;
上述木糖母液總糖濃度為50% 70%，配制好的發酵培養基中的初始總糖濃度為30 100g/L。
(2) 以肺炎克雷伯氏菌(/^^&//" / "wwo"/fle) CICC 10011或者肺炎克雷伯氏菌 (《/efc/e〃fl/wew ow'"e) ATCC 8724作為發酵菌株，搖瓶或發酵罐發酵制備2， 3-丁二醇。
其中所述搖瓶發酵方法是以體積比5 10%的接種量，將肺炎克雷伯氏菌(尺/6^^//" p"ew附om'ae) CICC 10011或者肺炎克雷伯氏菌(^7efc,'e〃"p"eMWO"/ae) ATCC 8724種子液 接種于裝有50 150 mL發酵培養基的500 mL三角瓶瓶中，置于轉速為100 160 rpm的搖 床上，30 4(TC培養16 30小時，其中每隔2 4小時取樣測定發酵液中的糖殘量和2,3-丁二醇濃度，當發酵液中2,3-丁二醇濃度不再上升時，發酵停止；取發酵液分離、提取2,3-丁二醇；
5升發酵罐發酵方法是
當發酵培養基中的初始總糖濃度為61 100 g/L，進行分批發酵，即以體積比5 10% 的接種量，在無菌條件下將肺炎克雷伯氏菌(《/^^//"/ "^附^ &) CICC 10011或者肺炎 克雷伯氏菌(《/^^//<3/7服誦0"/恥)ATCC 8724種子液接種于5升發酵罐中，發酵罐裝液 量為2 4升，以溫度30 40。C、攪拌轉速250 500卬m、通氣量0.5 1.5 wm的條件進 行通風攪拌發酵培養，培養時間為20 40小時；發酵液初始pH值調至6.0 7.0，發酵過 程中，通過發酵罐關聯控制蠕動泵流加4 6 M的KOH或3 6 M的H3P04來調節pH 值，使之控制在pH5.5 6.5;發酵過程中，每隔2 4小時取樣測定發酵液中的糖殘量和 2,3-丁二醇濃度，2,3-丁二醇濃度不再上升時，發酵結束；取發酵液分離、提取2,3-丁二醇；
或者，若發酵培養基中的初始總糖濃度為30 60g/L，進行補料分批發酵，即以體積 比5 10。/。的接種量，在無菌條件下將肺炎克雷伯氏菌(/^^/6//"/ 恥"附0附^) CICC 10011 或者肺炎克雷伯氏菌(〖/^>^//0;7"^附卵/^) ATCC 8724種子液接種于5升發酵罐中，發 酵罐裝液量為2 4升，溫度30 4(TC、攪拌轉速250 500 rpm、通氣量0.5 1.5 wm進 行通風攪拌發酵培養；發酵液初始pH值調至6.0 7.0，發酵過程中，通過發酵罐關聯控 制蠕動泵流加4 6 M的KOH或3 6 M的H3P04來調節pH值，使之控制在pH 5.5 6.5;發酵過程中，每隔2 4小時取樣測定發酵液中的糖殘量和2,3-丁二醇濃度，當總糖 濃度降到20 40g/L時，脈沖流加木糖母液使底物濃度達到50 70g/L;當發酵過程中總 糖消耗速率小于2 g/(L七)時，停止補加木糖母液，當2,3-丁二醇濃度不再上升時，發酵 結束；取發酵液分離、提取2,3-丁二醇。
依據上述5升發酵罐的發酵條件與方法，還可以進行10升、50升或更大容積的發酵罐 發酵操作來制備2， 3-丁二醇。
上述種子液的制備方法是
在無菌條件下用接種環接1 2環肺炎克雷伯氏菌(ii:/efc/e〃a/wewmow/ae)CICC 10011 或者肺炎克雷伯氏菌(K/e&zW/a/wwwoH/ae) ATCC 8724于裝有50 150 mL液體種子培養基的500mL三角瓶中，置于轉速為100 160rpm的搖床上，30 4(TC培養10 16小 時，得到種子液；
其中，上述液體種子培養基的組分和含量分別是葡萄糖10 40g/L，磷酸氫二鉀l 3g/L，磷酸二氫鉀l 3g/L，硫酸銨5 30g/L，氯化鈉l 3g/L，硫酸鎂0.1 0.3 g/L， pH值調至6.0 7.0;蒸餾水配制，115'C滅菌20分鐘。
上述肺炎克雷伯氏菌(夂/￡^&//0 /wewmom'fle) CICC 10011或者肺炎克雷伯氏菌 ATCC 8724斜面培養用的斜面培養基組分和含量分別是葡萄糖 10 30g/L，蛋白胨2 8g/L，酵母膏2 6g/L，磷酸氫二鉀l 3g/L，磷酸二氫鉀1 3 g/L，氯化鈉l 3g/L，硫酸鎂0.1 0.3g/L，硫酸鋅0.1 0.3g/L,瓊脂粉15 22g/L， pH 值調至6.0 7.0;蒸餾水配制，115'C滅菌20分鐘。所述斜面活化培養的方法是將肺炎 克雷伯氏菌(尺/e^W/"/7加訓ow'"e)菌種接種于斜面培養基，30 4(TC條件下，靜置培養 12 18小時，4'C放置備用。
上述5升發酵罐較佳的發酵條件是溫度優選35-37r，攪拌轉速優選300 400rpm、 通氣量優選1.0 1.5vvm。
上述總糖的測定方法是取上述發酵液以8000 10000 rpm離心3 6分鐘，上清液 按體積比稀釋200 600倍后，采用DNS方法測定其中總糖含量。
上述2,3-丁二醇含量測定方法是取上述發酵液以8000 10000rpm離心3 6分鐘， 上清液按體積比稀釋2 7倍，用萃取劑按體積比l: l萃取上清，用氣相色譜分析測定萃 取物中的2， 3-丁二醇含量。
上述萃取劑是乙酸乙酯、氯仿、乙酸丁酯中的一種。
本發明的顯著特點是
實現了木糖醇工業副產物木糖母液的開發利用。將工業副產物木糖母液用于生產高值
平臺化合物2， 3-丁二醇，有利于降低成本和開發石化產品替代品。木糖母液直接原料來 源是農業低值副產品玉米芯，原料來源豐富，成本低，再生循環迅速，并且環境友好，因 此間接的實現了可再生資源的開發利用，利用可再生資源代替石化資源生產高價值化學 品，有利于經濟社會的可持續性發展。
木糖母液含有戊糖——木糖和阿拉伯糖，以及己糖——葡萄糖。目前用含戊糖和己糖 的工業副產物生產2， 3-丁二醇的專利鮮見報道。本專利實現了含木糖、阿拉伯糖和葡萄 糖的工業副產物木糖母液的利用，并獲得了高產的2， 3-丁二醇。經檢驗，利用本發明所 述方法最終2， 3-丁二醇的濃度達到78.9 g/L，總糖轉化率達到85%以上，2, 3-丁二醇最 大生產率為1.3g/(L/h)，具有極大的推廣和應用前景。
具體實施例方式
本發明所選用的菌株為肺炎克雷伯氏菌(K/efe/e〃a; "e"wo"/ae) CICC 10011或者肺炎 克雷伯氏菌(尺/eZwW/a; "eMmom'ae) ATCC8724。其中，肺炎克雷伯氏菌CICC 10011可由 中國工業微生物菌種管理保藏中心購得，肺炎克雷伯氏菌ATCC 8724可由美國標準生物 品收藏中心購得。
本發明所用的木糖母液，是以玉米芯為原料的木糖醇生產工業中的副產物。其中木糖 母液的常規生產流程為 一定量玉米芯放入水解釜中，在1.5kg壓力條件下，加入一定稀 釋濃度的硫酸水解一定時間，水解液板框壓濾機過濾，過濾得到的液體中和后用活性炭脫 色，經過離子交換樹脂脫酸處理，進入蒸發裝置中進行蒸發，得到總糖濃度為20%左右的濃縮液，然后重復脫色、離子交換和蒸發過程，得到總糖50%左右的濃縮液，然后進 行負壓蒸發濃縮，得到總糖80%左右的濃縮液，然后在結晶釜中以l °C/h左右的降溫速 度降溫結晶。將結晶后的混合物離心，得到的固體為木糖晶體，得到的液體即為本發明所 述的木糖母液。
上述木糖母液可以以工業副產物的形式從山東龍力生物科技有限公司、山東福田藥業 有限公司、山東邢店生物科技有限公司等公司直接購得。但不同公司不同批次的木糖母液 總糖含量指標有所不同，本發明方法適用于總含糖量為50 70%的木糖母液。
本發明方法中涉及的葡萄糖的測定方法為發酵液稀釋后離心，采用生物傳感分析儀 SBA-40C (山東省科學院生物研究所)測定。測定原理為利用固定化葡萄糖脫氫酶膜專一 性測定葡萄糖含量。
本發明方法中涉及的木糖、阿拉伯糖檢測方法為Agilent 1100高效液相色譜儀， G1311A四元泵，示差折光分析檢測器，進樣量10iaL。 Agilent HPLC 2D色譜工作站。色 譜柱為ZORBAX碳水化合物分析柱(4.6 X 150 mm)，柱溫30 5(TC，流動相為乙腈 水=80: 20(v/v)，流速1.2mL/min。以保留時間定性，外標法定量。
本發明方法中涉及的總糖的測定方法為使用DNS方法測定總糖。具體操作過程如 下吸取稀釋好的樣品3 mL于25 mL定糖管中，加入2.0 mL DNS試劑，沸水浴顯色5 分鐘，取出冷卻，用蒸餾水定容至25mL，同時做空白對照，用722型分光光度計測定波 長520nm處吸光度。利用250mg/kg的木糖標準溶液做出標準曲線，然后再根據標準曲 線計算出發酵液中總糖含量。
本發明方法中涉及的2,3-丁二醇的測定方法為VARIAN CP-3380氣相色譜儀檢測。 乙酸丁酯為萃取劑，體積比l: l萃取，取上層有機相檢測。具體測定的條件是火焰離 子監測器(FID)溫度為280°C，進樣器溫度為220°C，而毛細管柱溫是從50'C升溫到180 °C，升溫速度20°C/min，載氣為氮氣。利用2,3-丁二醇標準品(德國Sigma-Aldrich公司， 貨號361461)做出標準曲線，再根據標準曲線計算出發酵液中2,3-丁二醇的含量。
下面通過具體實施例對發明作進一步的說明
實施例l
制備肺炎克雷伯氏菌(尺/^^//" /wwwow'ae ) CICC 10011菌株的種子液 將肺炎克雷伯氏菌(《/e^W/a; "eMmow'ae) CICC 10011 (購自中國工業微生物菌種管 理保藏中心)菌種接種于斜面培養基，35'C條件下，靜置培養14小時，在無菌條件下用接 種環挑取2環于裝有100mL液體種子培養基的500mL三角瓶中，置于轉速為150rpm的 搖床上，37。C培養10小時，即制得肺炎克雷伯氏菌(《/^^^/7加"附0"/^) CICC10011菌 株的種子液。
上述斜面培養基是葡萄糖20g/L，蛋白胨3g/L，酵母膏4g/L，磷酸氫二鉀lg/L，磷 酸二氫鉀lg/L,氯化鈉3 g/L，硫酸鎂O.l g/L，硫酸鋅O.l g/L，瓊脂粉22 g/L， pH值調至 7.0，蒸餾水配制，115'C滅菌20分鐘。
上述種子培養基是葡萄糖30 g/L，磷酸氫二鉀2 g/L，磷酸二氫鉀2 g/L，硫酸銨IO g/L， 氯化鈉lg/L，硫酸鎂0.1g/L， pH值調至6.5，蒸餾水配制，115'C滅菌20分鐘。
實施例2
制備肺炎克雷伯氏菌(A:/e6wW/a;wewwom^) ATCC 8724菌株的種子液 將肺炎克雷伯氏菌(幻e^W/a/7朋imwm'ae) ATCC 8724 (購自美國標準生物品收藏中心)菌種接種于斜面培養基，37'C條件下，靜置培養12小時，在無菌條件下用接種環挑取 l環于裝有80mL液體種子培養基的500 mL三角瓶中，置于轉速為IOO rpm的搖床上， 35。C培養14小時，即制得肺炎克雷伯氏菌(K/efe/e〃fl/wewmo"/ae) ATCC 8724菌株的種子液。
上述斜面培養基是葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏6g/L，磷酸氫二鉀3g/L，磷 酸二氫鉀3g/L，氯化鈉lg/L，硫酸鎂0.3g/L，硫酸鋅0.3g/L，瓊脂粉20 g/L， pH值調至 6.0，蒸餾水配制，U5'C滅菌20分鐘。
上述種子培養基是葡萄糖40 g/L，磷酸氫二鉀3 g/L，磷酸二氫鉀3 g/L，硫酸銨30 g/L， 氯化鈉3g/L，硫酸鎂0.3g/L， pH值調至7.0，蒸餾水配制，115。C滅菌20分鐘。
實施例3
利用肺炎克雷伯氏菌(尺/e6wW/a ;wa/wo"/ae)CICC 10011在三角瓶中發酵生產2,3-丁二
醇
用實施例1制備的種子液，無菌條件下按體積比為5%的接種量接入裝液量為100 mL 液體發酵培養基的500mL三角瓶中，置于轉速為120 rpm的搖床上，3(TC培養30小時， 其中每3個小時取一次發酵液，用于測定發酵液中的糖殘量和2,3-丁二醇濃度，發酵完畢 后，2， 3-丁二醇的濃度為43.7g/1，轉化率為理論轉化率的87.4%。
上述發酵培養基是初始總糖濃度為100g/L，檸檬酸三銨3g/L，磷酸氫二銨15g/L, 乙酸鈉2g/L，氯化鉀lg/L，硫酸鎂0.05g/L，硫酸鋅0.10g/L，硫酸錳0.05g/L，硫酸亞 鐵0.15g/L， pH值調至6.4;蒸餾水配制，115'C滅菌20分鐘。
實施例4
利用肺炎克雷伯氏菌(/:Mw^〃ap"eMwow'ae) ATCC 8724在三角瓶中發酵生產2,3-丁二
醇
用實施例2制備的種子液，無菌條件下按體積比為10%的接種量接入裝液量為150 mL 液體發酵培養基的500 mL三角瓶中，置于轉速為100 rpm的搖床上，37。C培養20小時， 其中每2個小時取一次發酵液，用于測定發酵液中的糖殘量和2,3-丁二醇濃度，發酵完畢 后，2， 3-丁二醇的濃度為32.4g/l，轉化率為理論轉化率的92.6%。
上述發酵培養基是初始總糖濃度為70g/L，檸檬酸三銨6g/L,磷酸氫二銨25g/L， 乙酸鈉5g/L，氯化鉀5g/L，硫酸鎂0.15g/L，硫酸鋅0.05g/L，硫酸錳0.15g/L，硫酸亞 鐵0.20g/L， pH值調至7.0;蒸餾水配制，115'C滅菌20分鐘。
實施例5
利用肺炎克雷伯氏菌(尺/e^W/a/ "ewwom'fle) ATCC 8724在5升發酵罐中分批發酵生產 2，3-丁二醇
從肺炎克雷伯氏菌(《/e^'e〃a ATCC 8724 (購自美國標準生物品收藏中
心)新活化的斜面上，在無菌條件下用接種環接1環于裝有90 mL種子培養基的500 mL三 角瓶中，37°C、 150rpm往復震蕩條件下，培養12小時制得種子液。
德國貝朗(BIOSTAT B, B. Braun) 5升發酵罐中加入3升發酵培養基，以體積比計按 6。/。的接種量向發酵培養基中接入180mL種子培養液，以發酵罐攪拌轉速300rpm，通氣量 1.0 vvm，初始pH值為6.5， 35'C條件發酵27小時。其中每3個小時取一次發酵液，測定發 酵液中的糖殘量和2,3-丁二醇濃度。發酵完畢后，2， 3-丁二醇的濃度為30.1 g/1，糖轉化率 為理論轉化率的86%。
8上述發酵培養基是初始總糖濃度為70g/L，檸檬酸三銨2g/L，磷酸氫二銨30g/L， 乙酸鈉4g/L，氯化鉀5g/L，硫酸鎂0.10g/L，硫酸鋅0.20g/L，硫酸錳0.10g/L，硫酸亞 鐵0.15g/L， pH值調至6.5;蒸餾水配制，U5'C滅菌20分鐘。
實施例6
利用肺炎克雷伯氏菌(尺/efe/e〃a p"wmom'ae) CICC 10011在5升發酵罐中補料分批發酵 生產2,3-丁二醇
從肺炎克雷伯氏菌(幻efo/e〃fl，ewmo"/"e) CICC 10011 (購自中國工業微生物菌種管 理保藏中心)新活化的斜面上，在無菌條件下用接種環接2環于裝有150mL種子培養基 的500mL三角瓶中，35°C， 100rpm往復震蕩條件下，培養14小時制得種子液。
德國貝朗(BIOSTAT B, B. Braun) 5升發酵罐中加入3升發酵培養基，以體積比計按 10。/。的接種量向發酵培養基中接入300 mL種子培養液，以發酵罐攪拌轉速400 rpm，通氣 量1.5 vvm，初始pH值為7.0， 37'C條件進行發酵。其中每3個小時取一次發酵液，測定發 酵液中的糖殘量和2,3-丁二醇濃度，當總糖濃度降到20 30g/L時，脈沖流加木糖母液， 使底物濃度達到50 70 g/L。當發酵過程中總糖消耗速率小于2g/(L七)時，停止補加木糖 母液，當2,3-丁二醇濃度不再上升時，發酵結束，發酵時間約為61小時。發酵完畢后，2， 3-丁二醇的濃度為78.9 g/1，糖轉化率為理論轉化率的85.1%。
上述發酵培養基是初始總糖濃度為40g/L，檸檬酸三銨4g/L，磷酸氫二銨40g/L， 乙酸鈉6g/L，氯化鉀5g/L，硫酸鎂0.15g/L，硫酸鋅0.10g/L，硫酸錳0.20g/L，硫酸亞 鐵0.05g/L， pH值調至7.0;蒸餾水配制，115'C滅菌20分鐘。
實施例7
利用肺炎克雷伯氏菌(幻^^//"; "^ 0"/^) ATCC 8724在5升發酵罐中補料分批發酵 生產2,3-丁二醇
從肺炎克雷伯氏菌(《/^*//" ; "eMWom'ae) ATCC 8724 (購自美國標準生物品收藏中 心)新活化的斜面上，在無菌條件下用接種環接l環于裝有100mL種子培養基的500mL三 角瓶中，35°C， 150ipm往復震蕩條件下，培養13小時制得種子液。
德國貝朗(BIOSTAT B， B. Braun) 5升發酵罐中加入4升發酵培養基，以體積比計按 5M的接種量向發酵培養基中接入200mL種子培養液，以發酵罐攪拌轉速500ipm，通氣量 0.75 wm，初始pH值為6.8， 3(TC條件進行發酵。發酵中每3個小時取一次發酵液，測定發 酵液中的糖殘量和2,3-丁二醇濃度。當總糖濃度降到20 30g/L時，脈沖流加木糖母液， 使底物濃度達到60 70g/L。當發酵過程中總糖消耗速率小于2g/(L七)時，停止補加木糖 母液，當2,3-丁二醇濃度不再上升時，發酵結束，發酵時間約為72小時。發酵完畢后，2， 3-丁二醇的濃度為67.2 g/1，糖轉化率為理論轉化率的86.9%。
上述發酵培養基是初始總糖濃度為50g/L，檸檬酸三銨6g/L，磷酸氫二銨35g/L， 乙酸鈉4g/L,氯化鉀4g/L，硫酸鎂0.15g/L，硫酸鋅0.15g/L，硫酸錳0.15g/L，硫酸亞 鐵0.15g/L， pH值調至6.8;蒸餾水配制，115'C滅菌20分鐘。
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權利要求
1.一種利用木糖母液制備2，3-丁二醇的方法，其特征在于選取木糖母液作為發酵底物，以如下組分配制發酵培養基木糖母液60～200g/L，檸檬酸三銨2～8g/L，磷酸氫二銨5～40g/L，乙酸鈉1～6g/L，氯化鉀1～5g/L，硫酸鎂0.05～0.15g/L，硫酸鋅0.05～0.20g/L，硫酸錳0.05～0.20g/L，硫酸亞鐵0.05～0.20g/L，pH值調至6.0～7.0；上述木糖母液總糖濃度為50％～70％，配制好的發酵培養基中的初始總糖濃度為30～100g/L；以肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)CICC 10011或者肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)ATCC 8724作為發酵菌株，搖瓶或發酵罐發酵制備2，3-丁二醇；其中所述搖瓶發酵方法是以體積比5～10％的接種量，將肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)CICC 10011或者肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)ATCC 8724種子液接種于裝有50～150mL發酵培養基的500mL三角瓶瓶中，置于轉速為100～160rpm的搖床上，30～40℃培養16～30小時，其中每隔2～4小時取樣測定發酵液中的糖殘量和2，3-丁二醇濃度，當發酵液中2，3-丁二醇濃度不再上升時，發酵停止；取發酵液分離、提取2，3-丁二醇；5升發酵罐發酵方法是當發酵培養基中的初始總糖濃度為61～100g/L，進行分批發酵，即以體積比5～10％的接種量，在無菌條件下將肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)CICC 10011或者肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)ATCC 8724種子液接種于5升發酵罐中，發酵罐裝液量為2～4升，以溫度30～40℃、攪拌轉速250～500rpm、通氣量0.5～1.5vvm的條件進行通風攪拌發酵培養，培養時間為20～40小時；發酵液初始pH值調至6.0～7.0，發酵過程中，通過發酵罐關聯控制蠕動泵流加4～6M的KOH或3～6M的H3PO4來調節pH值，使之控制在pH 5.5～6.5；發酵過程中，每隔2～4小時取樣測定發酵液中的糖殘量和2，3-丁二醇濃度，2，3-丁二醇濃度不再上升時，發酵結束；取發酵液分離、提取2，3-丁二醇；或者，若發酵培養基中的初始總糖濃度為30～60g/L，進行補料分批發酵，即以體積比5～10％的接種量，在無菌條件下將肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)CICC 10011或者肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)ATCC 8724種子液接種于5升發酵罐中，發酵罐裝液量為2～4升，溫度30～40℃、攪拌轉速250～500rpm、通氣量0.5～1.5vvm進行通風攪拌發酵培養；發酵液初始pH值調至6.0～7.0，發酵過程中，通過發酵罐關聯控制蠕動泵流加4～6M的KOH或3～6M的H3PO4來調節pH值，使之控制在pH 5.5～6.5；發酵過程中，每隔2～4小時取樣測定發酵液中的糖殘量和2，3-丁二醇濃度，當總糖濃度降到20～40g/L時，脈沖流加木糖母液使底物濃度達到50～70g/L；當發酵過程中總糖消耗速率小于2g/(L·h)時，停止補加木糖母液，當2，3-丁二醇濃度不再上升時，發酵結束；取發酵液分離、提取2，3-丁二醇。
2. 如權利要求1所述利用木糖母液制備2， 3-丁二醇的方法，其特征在于所述種子液的制備方法是在無菌條件下用接種環接1 2環肺炎克雷伯氏菌(尺/eZwW/a;7"e"wo"/ae)CICC 10011 或者肺炎克雷伯氏菌(A7eZwW/" /w^/wo"/"e) ATCC 8724于裝有50 150 mL液體種子培 養基的500mL三角瓶中，置于轉速為100 160rpm的搖床上，30 40'C培養10 16小 時，得到種子液；其中，上述液體種子培養基的組分和含量分別是葡萄糖10 40 g/L，磷酸氫二鉀l 3g/L，磷酸二氫鉀l 3g/L,硫酸銨5 30g/L，氯化鈉l 3g/L,硫酸鎂0.1 0.3 g/L， pH值調至6.0 7.0;上述肺炎克雷伯氏菌(《/efe/e〃a /wewwow/ae) CICC 10011或者肺炎克雷伯氏菌 (0e^W/a/wwmo"/ae) ATCC 8724斜面培養用的斜面培養基組分和含量分別是葡萄糖 10 30g/L，蛋白胨2 8g/L，酵母膏2 6g/L，磷酸氫二鉀l 3g/L,磷酸二氫鉀1 3 g/L，氯化鈉l 3g/L，硫酸鎂0.1 0.3g/L，硫酸鋅0.1 0.3g/L，瓊脂粉15 22g/L， pH 值調至6.0 7.0。
3. 如權利要求1所述利用木糖母液制備2， 3-丁二醇的方法，其特征在于所述5升 發酵罐發酵條件是溫度為35-37。C,攪拌轉速為300 400rpm、通氣量為1.0 1.5vvm。
4. 如權利要求1所述利用木糖母液制備2， 3-丁二醇的方法，其特征在于所述總糖 的測定方法是取所述發酵液以8000 10000 rpm離心3 6分鐘，上清液按體積比稀釋200 600 倍后，采用DNS方法測定其中總糖含量。
5. 如權利要求1所述利用木糖母液制備2， 3-丁二醇的方法，其特征在于所述2， 3-丁二醇含量測定方法是取所述發酵液以8000 10000 rpm離心3 6分鐘，上清液按體積比稀釋2 7倍，用萃 取劑按體積比l: l萃取上清，用氣相色譜分析測定萃取物中的2， 3-丁二醇含量。
6. 如權利要求5所述利用木糖母液制備2， 3-丁二醇的方法，其特征在于所述萃取 劑是乙酸乙酯、氯仿、乙酸丁酯中的一種。
全文摘要
本發明公開了一種利用木糖母液制備2，3-丁二醇的方法，是利用木糖母液作為發酵底物，用肺炎克雷伯氏菌作為發酵菌株，通過分批發酵和補料分批發酵來生產制備2，3-丁二醇。本發明方法最終2，3-丁二醇的濃度達到78.9g/L，總糖轉化率達到85％以上，2，3-丁二醇最大生產率為1.3g/(L·h)。本發明針對石油資源日益枯竭及石化產品價格上漲，利用可再生農業副產物玉米芯深加工生產木糖醇的副產物木糖母液，通過微生物發酵生產高值平臺化合物2，3-丁二醇，實現了木糖醇工業副產物木糖母液的后開發及高價值利用。
文檔編號C12P7/02GK101550431SQ20091001499
公開日2009年10月7日 申請日期2009年5月8日 優先權日2009年5月8日
發明者唐鴻志, 姜天翼, 李理想, 鈺 王, 王愛龍, 平 許, 馬翠卿 申請人:山東大學