專利名稱：一種用于防治肝硬化的人源細胞珠蛋白及其制備方法
技術領域：
本發明涉及生物化學領域，具體涉及一種用于防治肝硬化真核蛋白質的重組表達。
背景技術：
我國是肝病大國，據2002年國家衛生部肝病研究組的統計資料顯示，全國乙型肝炎感 染就診人數為7500萬人次，居全國各類傳染病之首。與此同時，脂肪肝、酒精肝、藥肝和肝 硬化等其他肝臟疾病的發病率同比上升了 17.8%,達到5000萬，已經成為威脅我國人民生 命健康的又一嚴重社會問題。在慢性肝炎中25%左右經過5 10年將會轉為肝硬化，肝硬化 中約20%將轉為原發性肝癌。另資料統計顯示，60%的嗜酒者患有脂肪肝；30%的酒精性脂 肪肝可演變為肝纖維化；10%以上可轉化為肝硬化。
硏究表明，肝纖維化是肝硬化的前期病理階段,是肝臟受到慢性損傷時，細胞外基質(ECM) 可逆性沉積的創傷愈合過程。積極探索肝纖維化發病機制，尋求有效治療措施對降低肝硬化發 病率和死亡率具有重要意義。阻止肝纖維化的進展或促進纖維化的逆轉是治療的關鍵。國內
外目前治療本病尚無可靠藥物，西藥抗肝纖維化治療療效差且副作用大；近年來國內外醫藥 界開始重視中醫藥抗肝纖維化的研究。但在理法方藥理論指導下藥理實驗證實療效可靠的中 成藥尚屬空缺。肝硬化患者用藥總的原則是少用藥、精選用藥，切忌濫用、盲目用。因為服 食的各種藥物都必須經過肝臟解毒處理，濫用藥物很可能不但起不到保護肝臟的作用，反而 加重肝臟的負擔，得不償失。利用生物技術治療該疾病的研究，是基于機體發病的機理而作 出針對其關鍵過程的治療，同時藥物來源于機體的本身，具有高療效、低副作用的特點，市
場前景良好。
目前認為，肝星狀細胞(h印atic stellate cell, HSC)在肝纖維化發生發展中起主導作用。 在各種致病因素作用下,靜止期HSC被激活并增殖、轉化為肌成纖維樣母細胞，合成和分泌ECM 上調，同時合成和釋放大量基質金屬蛋白酶抑制因子(TIMPs)，使間質膠原酶等蛋白酶活性降 低，ECM降解減少，最終導致ECM積聚而發生肝纖維化乃至肝硬化。
國內外學者對肝纖維化的可逆性已無異議。鑒于HSC在肝纖維化發病機制中的主導作用， 大多數抗肝纖維化研究都以HSC為靶標。通過對抗氧化應激，抑制炎癥反應，調節相關細胞因 子的活性，干擾細胞因子信號轉導等途徑抑制HSC增殖、活化，誘導HSC凋亡，均可呈現一定 的抗肝纖維化效應。
Kawada等(見BiolChem. 2001， 276(27) 25318-25323)在進行大鼠肝星狀細胞的蛋白 質組學研究時，發現了一種新蛋白，該蛋白在肝星狀細胞活化的過程中有明顯的上調表達，揭示該蛋白在肝纖維化過程中發揮著重要的生物功能。目前在國際上比較多的被命名為細胞珠 蛋白(cytoglobin, Cygb,GeneID: 114757)，也有人稱之為肝星狀細胞激活相關蛋白(Stellate cell activation-assciated protein, STAP)，它屬于一個S 發5見的hexacoordinate globin超家方矣 的成員，該家族的成員在動物，藍細菌及植物中都有表達。研究表明，該蛋白家族的一些成 員，可以清除機體內的毒素，例如氧化亞氮(nitric oxide)，過氧化亞硝酸鹽 (peroxynitrite)'以及氫過氧化物(hydrogen peroxide) 。 / "J.朋J"等人的研究也證實 了在大鼠的肝星狀細胞中過表達cytoglobin可以緩解氧化壓力，抑制肌成纖維樣母細胞的分 化，同時減少細胞外基質的沉降。
細胞珠蛋白可以從動物和人的細胞組織中提取得到，但是可獲得量極少，不能滿足臨床的 需求，因此，學者們將研究方向轉向了原核表達。眾所周知，真核生物中的大部分功能蛋白 在表達后需要經過一系列的修飾折疊形成高級結構才具有生物活性，將這類蛋白的基因轉到 原核生物中雖然也可獲得一級結構相同的蛋白質，但是原核生物中缺少蛋白修飾折疊所需的 工具，往往所得的蛋白質由于不具備正確折疊的高級結構而導致其生物活性較低甚至喪失生 物活性。
中國專利申請"人源肝星狀細胞激活相關蛋白(Stellate cell activation-assciated protein, STAP)治療肝臟疾病的用途"(申請號為200710020563.7)公開了一種利用基因重組技術構 建表達菌獲得STAP的方法，具體步驟如下將STAP的cDNA克隆到pET-28a表達載體并 轉化到Ecoli BL21中表達出STAP包涵體，所得包涵體用Sephadex G-25層析柱復性和純化， 得到重組人源肝星狀細胞激活相關蛋白(rhSTAP)。但是上述方法所得的rh STAP以包含體 的形式表達出來的，包含體是一種錯誤折疊的、沒有生物活性的、以沉淀狀態存在的蛋白質， 即使是經過復性也只可能具備部分生物活性，甚至沒有生物活性，難以保證每個生產批次蛋 白質的穩定性和均一性。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種生物活性穩定的重組人源細胞珠蛋白。
本發明解決上述問題的技術方案是
一種人源細胞珠蛋白的表達質粒，該質粒是將SEQ NO. 1所示的DNA片段用Afcot和歷"dIII 酶切后克隆到載體pET-32a的表達區得到。
一種轉化體，其特征在于該轉化體的宿主為大腸桿菌BL21 (DE3)，導入的重組載體為本 發明所述的人源細胞珠蛋白的表達質粒。
一種重組人源細胞珠蛋白，該蛋白由本發明所述的轉化體在異丙基-e-D-硫代半乳糖苷
的誘導培養下的表達產物經凝血因子FXa切割去除Trx標簽、His標簽和FXa識別序列后獲
4得，其中所述的表達產物是由Trx標簽、His標簽、FXa識別序列和人源細胞珠蛋白依次連接 構成的融合蛋白。
本發明所述表達質粒的制備方法由以下步驟組成
(1) 提取H印G2細胞的總RNA，用引物1和引物2進行反轉錄PCR得到序列為SEQN0.2 的DNA片段；
(2) 以序列為SEQ NO.2的DNA片段為模板用引物2和引物4進行PCR反應得到序列 為SEQN0.3的DNA片段；
(3) 以序列為SEQ N0.3的DNA片段為模板用引物3和4進行PCR反應得到序列為SEQ NO.l的DNA片段；
(4) 序列為SEQNO.l的DNA片段用〃co1和他; dl11酶切后克隆到載體pET-32a的表 達區，得到重組質粒pET-32a- hCygb;
所述引物1的序列為5， - CTGGTATTGAGGGTCGCATGGAGAAAGTGCCA-3， ( SEQN0.4); 所述引物2的序列為5' - TCATCATCATCATTCTTCTGGTATTGAGGGTCGCA-3'( SEQN0.5); 所述引物3的序列為5' - GATGGCCATATGCACCATCATCATCATCATTC-3' ( SEQN0.6); 所述引物4的序列為5， - GCACTCGCTAAGCTTCTACGGCCCCGAAAGGG-3' ( SEQN0.7)。 本發明所述轉化體可用常規的方法將重組質粒PET-32a- hCygb轉化到大腸桿菌 (^yc力er/c/ ia BL21 (DE3)中獲得，如電穿孔法、氯化鈣轉化法等。
本發明所述重組人源細胞珠蛋白的制備方法由以下步驟組成
(1) 將本發明所述轉化體在含異丙基-P -D-硫代半乳糖苷的LB培養基中誘導培養；
(2) 收集菌體，將菌體破碎，取上清，用組氨酸標記親和層析柱分離出融合蛋白；
(3) 所得融合蛋白用凝血因子FXa酶切，然后上組氨酸標記親和層析柱，用氯化鈉溶液 按1 99% (w/v)的濃度變化進行梯度洗脫，收集出現第一個洗脫峰的洗脫液，最后用pH值 為8. 0、濃度為lOmM的Tris-HCl緩沖液透析，濃縮即可。
本發明人源細胞珠蛋白的表達質粒可在原核宿主中表達融合蛋白，該融合蛋白由Trx標 簽、His標簽、FXa識別序列和人源細胞珠蛋白依次連接構成，用凝血因子FXa酶切去掉Trx 標簽、His標簽和FXa識別序列即可獲得重組人源細胞珠蛋白，所得重組蛋白具有與天然人 源細胞珠蛋白相同生物活性，對肝硬化有顯著的治療以及預防作用。
本發明所述重組人源細胞珠蛋白(rhCygb)，從原核表達到用凝血因子FXa切割，經歷了 兩次折疊，由于其在折疊和切割的過程中，用于折疊的一級結構以及折疊的條件不同，形成 的空間結構即不同于天然存在的人源細胞珠蛋白，也不同于以包含體形態表達的復性蛋白。 天然存在的人源細胞珠蛋白(hCygb)是由真核細胞表達的，經過了多重的修飾，而本發明rhCygb是由有修飾缺陷的系統內表達的，沒有經過這些修飾，雖然一級結構一樣，但是高級 結構已經發生了變化。本發明rhCygb的生物活性與天然存在的hCygb相比，保持了較高的生 物活性，并且可大量獲得，有利于工業化生產；與以包含體形式表達的復性蛋白相比，不僅 穩定均一，而且其生物比活性高了 50%。


圖1是本發明重組人源細胞珠蛋白純化后的SDS-PAGE電泳結果，其中，A是蛋白質分子 量Marker， B是純化后的本發明重組人源細胞珠蛋白。
圖2是本發明重組人源細胞珠蛋白N-terrainal氨基酸序列的測定結果。 圖3是本發明重組人源細胞珠蛋白C-terminal氨基酸序列的測定結果。
圖4是本發明重組人源細胞珠蛋白治療肝纖維化實驗中各組小鼠治療6周后血清ALT 水平比較柱形圖。
圖5是本發明重組人源細胞珠蛋白治療肝纖維化實驗中各組小鼠治療6周后血清AST 水平比較柱形圖。
圖6是本發明重組人源細胞珠蛋白治療肝纖維化實驗中各組小鼠治療6周后血清白蛋白 水平比較柱形圖。
圖7是本發明重組人源細胞珠蛋白治療肝纖維化實驗中各組小鼠治療6周后血清AKP 水平比較柱形圖。
圖8是本發明重組人源細胞珠蛋白治療肝纖維化實驗中各組小鼠治療6周后血清透明質 酸水平比較柱形圖。
圖9是本發明重組人源細胞珠蛋白治療肝纖維化實驗中各組小鼠治療6周后肝組織 MDA含量比較柱形圖。
圖10是本發明重組人源細胞珠蛋白治療肝纖維化實驗中各組小鼠治療6周后肝組織 GSH-Px含量比較柱形圖。
圖11是本發明重組人源細胞珠蛋白治療肝纖維化實驗中各組小鼠治療6周后肝組織羥 脯氨酸含量比較柱形圖。
圖12是本發明重組人源細胞珠蛋白預防肝纖維化實驗中各組小鼠預防6周后血清ATL 水平的比較柱形圖。
圖13是本發明重組人源細胞珠蛋白預防肝纖維化實驗中各組小鼠預防6周后血清ASL 水平的比較柱形圖。
圖14是本發明重組人源細胞珠蛋白預防肝纖維化實驗中各組小鼠預防6周后血清白蛋
6白水平的比較柱形圖。
圖15是本發明重組人源細胞珠蛋白預防肝纖維化實驗中各組小鼠預防6周后血清AKP 水平的比較柱形圖。
圖16是本發明重組人源細胞珠蛋白預防肝纖維化實驗中各組小鼠預防6周后血清透明 質酸水平的比較柱形圖。
圖17是本發明重組人源細胞珠蛋白預防肝纖維化實驗中各組小鼠預防6周后肝組織MDA 含量的比較柱形圖。
圖18是本發明重組人源細胞珠蛋白預防肝纖維化實驗中各組小鼠預防6周后肝組織 GSH-Px含量的比較柱形圖。
圖19是是本發明重組人源細胞珠蛋白預防肝纖維化實驗中各組小鼠預防6周后肝組織 羥脯氨酸含量的比較柱形圖。
具體實施例方式
為了更好地理解本發明，F面將通過具體的制備例子和效果實驗來進一步闡明本發明所 具有的技術效果。
1、本發明所述人源細胞珠蛋白的表達質粒的構建 (1 )提取H印G2細胞的總RNA，用引物1和引物2進行反轉錄PCR得到序列為SEQ N0.2 的DNA片段；
反轉錄PCR的反應條件如下94。Cl分鐘；58°C ; 1分鐘72°C 1分鐘；30個循環。
(2) 以序列為SEQN0.2的DNA片段為模板用引物2和引物4進行PCR反應得到序列 為SEQN0.3的DNA片段；
PCR反應條件如下94°C l分鐘；58°C ; 1分鐘；72°C 1分鐘；30個循環。
(3) 以序列為SEQN0.3的DNA片段為模板用引物3和4進行PCR反應得到序列為SEQ NO.l的DNA片段
PCR反應條件如下94°C l分鐘；58°C ; 1分鐘；72°C l分鐘；30個循環。
(4) 序列為SEQ NO.l的DNA片段用Afcol和〃iy7din酶切后克隆到載體pET-32a的表 達區，得到重組質粒PET-32a- hCygb;
上述步驟所用的引物均由Invtrogen公司合成，其DNA序列分別為 引物l: 5， - CTGGTATTGAGGGTCGCATGGAGAAAGTGCCA-3' ( SEQNO.4); 引物2: 5， - TCATCATCATCATTCTTCTGGTATTGAGGGTCGCA-3， ( SEQNO.5); 引物3: 5， - GATGGCCATATGCACCATCATCATCATCATTC-3， ( SEQNO.6);
7引物4: 5' - GCACTCGCTAAGCTTCTACGGCCCCGAAAGGG-3' ( SEQN0.7)。 2、本發明所述轉化體的制備
(1) BL21(DE3)感受態細胞購于TIANGEN公司
(2) 轉化
2.2.1從4。C冰箱中取200yl感受態細胞懸液，立即置冰上。加入重組質粒pET-32a-hCygb連接液，輕輕搖勻，冰上放置30分鐘。
2. 2. 2 42。C水浴中熱擊90秒，熱擊后迅速置于冰上冷卻3-5分鐘。
2. 2. 3向管中加入lml LB液體培養基(不含Amp),混勻后37'C振蕩培養1小時，使細菌恢 復正常生長狀態，并表達質粒編碼的抗生素Amp抗性基因。
2.2.4將上述菌液搖勻后取lOOul涂布于含Amp的篩選平板上，正面向上放置半小時， 待菌液完全被培養基吸收后倒置培養皿，37'C培養16-24小時。 (3)篩選
2. 3. 1每組連接反應轉化原液取100 n 1用無菌玻棒均勻涂布于含Amp的篩選平板上，37 'C下培養半小時以上,直至液體被完全吸收。
.2. 3. 2倒置平板于37'C繼續培養12-16小時，待出現明顯而又未相互重疊的單菌落時拿 出平板。
2.3.3用無菌牙簽分別挑取多個單菌落接種于含Amp 50yg/ml的5ml LB液體培養基 中，37'C下振蕩培養12小時。含有重組質粒pET-32a_ hCygb的轉化子可以在抗性培養基中正 常生長。保存篩選得到的含有重組質粒？￡1-323- hCygb的轉化子，用于后續的誘導表達。
(4)鑒定本發明采取的是最簡便快速的PCR鑒定。即提取轉化子的質粒作為PCP的 模板，以上文合成的引物1和引物4作為模板，進行PCR反應，可以產生與hCygb cDNA同 樣大小片段PCR產物，既說明是正確的轉化子。
3、 本發明所述重組人源細胞珠蛋白的獲得
U)培養取所得轉化體按1% (w/w)的接種量接到LB培養基中，在溶氧量為30°/。， 溫度為37'C的條件下培養至菌液OD,為0.6，然后在培養基中添加lmM的異丙基-e-D-硫 代半乳糖苷，3(TC培養12h,離心收集菌體。
(2) 融合蛋白的獲得將所收集的菌體先用pH值為8.0、濃度為lOmM的Tris-HC1緩 沖液懸浮，然后用超聲波破碎，離心，取上清，以60mL/h的流速上His Bind親和層析柱， 接著用1 XBinding Buffer洗滌柱床至基線，1 XWash Buffer洗滌柱床至基線，1 XElute Buffer洗脫融合蛋白。
(3) 融合子與目的蛋白的分離收集出現融合蛋白峰的洗脫液，用FXa酶切緩沖透析后按1U FXa : 100嗎融合蛋白的比例加入FXa，室溫下酶切12h。將酶切后的溶液以60mL/h 的流速上His Bind親和層析柱，此時含有His標簽的融合子由于親合作用與柱體結合，而 目的蛋白則不再與柱體發生親合作用。利用NaCl溶液進行梯度洗脫(NaCl濃度變化為 1%-99%)，收集第一個出現洗脫峰，既為目的蛋白。將所收集的洗脫峰用pH值為8.0、濃度 為10mM的Tris-HCl緩沖液透析，凍干法濃縮即可。所得蛋白用SD-PAGE電泳檢測蛋白質純 度，結果見圖l。
4、 本發明所述重組人源細胞珠蛋白(rhCyg)的鑒定
純化后的rhCygb利用Resource RPC柱(Global)進行反向色譜純化，流動相為A液(2% 乙腈，0.05%三氟乙酸)、B液(98%乙腈，0. 05%三氟乙酸)，利用色譜儀AKTA explorer (Pharmacia Biotech)進行洗脫、收集。收集的rhCygb樣品用于以下鑒定
A. rhCyg的N-terminal氨基酸序列利用儀器Protein N-terminal Sequencer (ABI491LC PE)，用HPLC的方法檢測，結果見圖2。
B. rhCygb的C-terminal氨基酸序列利用儀器Protein C-terminal Sequencer ( LTQ Finnigan)，用tandem mass spectrometry的方法檢測，結果見圖3。
結果顯示，rhCygb經過RPC純化后，純度大于95%， N-terminal 10個氨基酸序列為 NH2-M-E-K-V-P-G-E-M-E-1 ' C-terminal 23個氨基酸序列為E-V-G-W-V-Q-Q~V-P-N-A-T-T-P-P-A-T-L-P-S-S-G-P，均與理論值吻合。
5、 本發明所述重組人源細胞珠蛋白(rhCygb)穩定性的研究
將rhCygb配置成標準溶液(lmg/ml)，置于4'C保存，每隔24小時取樣，分別檢測rhCygb 蛋白標準溶液中的蛋白含量以及rhCygb的比活力。取按中國專利申請200710020563.7所記 載的方法制備的rhSTAP做對比。
rhCygb的比活力(即抗氧化活性)用T-A0C試劑盒(南京建成生物工程研究所)檢測， 具體方法如下
(1) 樣品的準備將rhCygb利用考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒(南京建成生物工程研究 所)檢測蛋白濃度，利用20mM Tris-HC1 (pH8.0)配置成lmg/ml的標準溶液。
(2) 設立0.1、 0.2、 0.3ml 3個劑量組，按照T-AOC試劑盒的說明進行加樣和操作。
(3) 將各檢測管在旋渦混勻器充分混勻，放置15rain，蒸餾水調零，lcni光徑，520nm 檢測各管吸光度(0D)值。
(4) 根據試劑盒的說明進行數據處理。
結果如表1和表2所示，本發明rhCygb比包含體形式表達的復性蛋白質具有更高的生物 活性，所以我們采用了比包含體形式表達的復性蛋白質少50%的給藥劑量進行動物實驗，同樣取得了較好的治療與預防效果。
表l本發明rhCyg的穩定性研究結果
時間(小時)24487296120144168
可溶性蛋白濃度(mg/ml)0.990.980.990.990.980.980.98
抗氧化活性(U/mg prot)181.5179,2178.4174.3176.9175.6176.3
表2 中國專利申請200710020563.7所述rhSTAP穩定性研究結果時間(小時)24487296120144168
可溶性蛋白濃度(mg/m)1.031,041.021.010.991.000.99
抗氧化活性(U/mgprot)82.181.482.280.681.479.079.7
6、本發明rhCygb治療肝纖維化效果的研究
取SD雄性大鼠，體重180 200g，室溫詞養，標準飲食，自由飲水，皮下注射用植物油 稀釋的25y。CCL，劑量2ml/kg,每周注射2次，并根據老鼠體重調整用量，共進行12周。
于造模第七周，大鼠眼眶靜脈叢取血，測定血清中AST,ALT含量，根據所得數據將模型 大鼠平均分為五組，即模型組，治療低劑量組(給藥劑量rhCygb 1.0mg/kg)，治療中劑量 組(給藥劑量rhCygb 2.0mg/kg)，治療高劑量組(給藥劑量rhCygb 4.0mg/kg)，陽性對 照組(給藥劑量甘利欣4.0mg/kg)。另外再設立一個iH常組。從第七周開始治療，低劑量 組、治療中劑量組、治療高劑量組和陽性對照組每天腹腔注射相應藥物。治療6周，末次給 藥24h后，眼眶靜脈叢取血3ml,分離血清后，測定ALT，AST,白蛋白，堿性磷酸酶(AKP)， 透明質酸。處死后，取每只大鼠同一部位肝臟，10%甲醛固定，石蠟包埋，HE染色，做病理 學檢査。再取一部分肝組織測定其谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)，丙二醛(MDA),羥脯氨酸 (Hyp)。
結果顯示
(1)與正常照組大鼠相比，大鼠皮下注射四氯化碳3個月后血清ALT，AST,堿性磷酸酶， 透明質酸水平升高明顯，而白蛋白比值有所降低，肝組織勻漿中MDA和羥脯氨酸水平明顯升 高，GSH-Px含量有所下降。提示四氯化碳己造成大鼠肝臟損傷，出現了肝硬化的癥狀。
(2) 與模型組大鼠相比，rhCygb治療六周后，治療組以及陽性對照組的實驗結果顯示， 對于血清ALT，AST,堿性磷酸酶，透明質酸升高有明顯的抑制，對于肝組織勻漿中MDA和羥 脯氨酸水平升高也有所抑制，同時減少了白蛋白，GSH-Px的下降(見圖4 11)。提示rhCygb 大鼠肝臟損傷具有明顯的治療作用。
(3) 治療低劑量組(給藥劑量:rhCygb 1.0mg/kg)，治療中劑量組(給藥劑量:rhCygb
102.0mg/kg)，治療高劑量組(給藥劑量rhCygb4.0mg/kg)的治療效果有區別，提示了 rhCygb 對肝硬化的治療作用具有劑量依賴關系。具體的表現為，隨劑量的增加，治療效果加強。
(4)外觀結果顯示，模型組肝臟病變明顯，顏色由正常的紅褐色變為棕黃色，表面粗糙， 有顆粒感，治療組與陽性組對肝臟病變具有明顯的保護作用，肝臟表面光滑，顏色為紅褐色。
(4) HE染色見模型組大鼠肝臟均出現慢性脂肪性變，并見散在肝細胞壞死，匯管區炎性 細胞浸潤，纖維結蒂組織有增生趨勢。而治療組可見肝組織脂肪變性顯著減輕，點狀壞死灶 與炎性細胞浸潤減少，纖維結締組織增生有明顯減輕。
以上結果說明
1、 皮下注射CCl4造成了大鼠的肝臟損傷，導致了肝硬化。
2、 rhCygb緩解了 CCl4造成了大鼠的肝臟損傷，對慢性四氯化碳大鼠肝硬化具有治療的 作用。
3、 rhCygb對慢性四氯化碳大鼠肝硬化的治療作用具有劑量依賴關系，劑量增加，治療 效果加強。
7、本發明rhCygb預防肝纖維化效果的研究
取SD雄性大鼠，體重180 200g，室溫飼養，標準飲食，自由飲水，皮下注射用植物油 稀釋的25% CC14，劑量2ml/kg，每周注射2次，并根據老鼠體重調整用量，將大鼠隨機分為5 組即模型組，預防低劑量組(給藥劑量rhCygb L0mg/kg)，預防中劑量組(給藥劑量 rhCygb 2.0mg/kg)，預防高劑量組(給藥劑量:rhCygb 4. Omg/kg)，陽性對照組(給藥劑量: 甘利欣4.0mg/kg)。另外再設立一個正常組。預防組從第一周開始給藥，預防周期12周，末 次給藥24h后，眼眶靜脈叢取血3ml，分離血清后，測定ALT, AST,白蛋白，堿性磷酸酶(AKP)， 透明質酸。處死后，取每只大鼠同一部位肝臟，10%甲醛固定，石蠟包埋，HE染色，做病理 學檢査。再取一部分肝組織測定其谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)，丙二醛(MDA),羥脯氨酸 (Hyp)。
結果顯示
(1)與正常照組大鼠相比，大鼠皮下注射四氯化碳3個月后血清ALT, AST,堿性磷酸酶 (AKP)，透明質酸水平升高明顯，而白蛋白比值有所降低，肝組織勻漿中MDA和羥脯氨酸水 平明顯升高，GSH-Px含量有所下降。提示四氯化碳己造成大鼠肝臟損傷，出現了肝硬化的癥 狀。
(2)與模型組大鼠相比rhCygb預防12周后，預防組以及陽性對照組的實驗結果顯示， 對于血清ALT，AST,堿性磷酸酶(AKP)，透明質酸升高有明顯的抑制，對于肝組織勻漿中MDA 和羥脯氨酸水平升高也有所抑制，同時減少了白蛋白，GSH-Px的下降(見圖12 19)。提示rhCygb大鼠肝臟損傷具有明顯的預防作用。
(3) 預防低劑量組(給藥劑量rhCygb 1.0mg/kg)，預防中劑量組(給藥劑量rhCygb 2.0mg/kg)，預防高劑量組(給藥劑量rhCygb4.0mg/kg)的預防效果有區別，提示了 rhCygb 對肝硬化的預防作用具有劑量依賴關系。具體的表現為，隨劑量的增加，預防效果加強。
(4) 外觀結果顯示，模型組肝臟病變明顯，顏色由正常的紅褐色變為棕黃色，表面粗糙， 有顆粒感，預防組與陽性組對肝臟病變具有明顯的保護作用，肝臟表面光滑，顏色為紅褐色。
(4) HE染色見模型組大鼠肝臟均出現慢性脂肪性變，并見散在肝細胞壞死，匯管區炎性 細胞浸潤，纖維結蒂組織有增生趨勢。而預防組可見肝組織脂肪變性顯著減輕，點狀壞死灶 與炎性細胞浸潤減少，纖維結締組織增生有明顯減輕。
以卜.結果說明
1、 皮下注射CCl4造成了大鼠的肝臟損傷，導致了肝硬化。
2、 rhCygb緩解了 CCl4造成了大鼠的肝臟損傷，對慢性四氯化碳大鼠肝硬化具有預防的 作用。
3、 rhCygb對慢性四氯化碳大鼠肝硬化的預防作用具有劑量依賴關系。劑量增加，預防 效果加強。
12序列表
〈110〉南方醫科大學
〈120> —種人源細胞珠蛋白的表達質粒及其構建方法 <160> 7
〈170〉 Patentln version 3.3
〈210〉 1
〈211〉 639
<212> 腿
〈213〉 human
<400> 1
gatggccata tgcaccatca tcatcatcat tcttctggta ttgagggtcg catggagaaa 60
gtgccaggcg卿tggagat cgagcgcagg gagcggagcg aggagctgtc cgaggcggag 120
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aagcacatgg aggatcccct ggagatggag cggagccccc agctgcggaa gcacgcctgc 300
cgagtcatgg gggccctcaa cactgtcgtg gagaacctgc atgaccccga caaggtgtcc 360
tctgtgctcg cccttgtggg gaaagcccac gccctcaagc acaaggtgga accggtgtac 420
ttca卿tcc tctctggggt cattctggag gtggtcgccg aggaatttgc cagtgacttc ■
ccacctgaga cgcagagagc ctgggccaag ctgcgtggcc tcatctacag ccacgtgacc 540
gctgcctaca aggaagtggg ctgggtgcag caggtcccca acgccaccac cccaccggcc 600
acactgccct cttcggggcc gtagaagctt agcgagtgc 639
〈210〉 2
〈211〉 605
<212> 歸
〈213〉 human
〈400〉 2ctggtattga gggtcgcatg g卿卿tgc ggagcgagga gctgtccgag gcgg卿gga atgccaactg cgaggacgtg ggggtggcca cggccaagca gt已cttc3gc cagttcaagc gcccccagct gcggaagcac gcctgccgag acctgcatga ccccgacaag gtgtcctctg tcaagcacaa ggtggaaccg gtgtacttca tcgccgagga atttgccagt gacttcccac gtggcctcat ctacagccac gtgaccgctg tccccaacgc caccacccca ccggccacac agtgc
caggcg卿t gg卿tcg已g cgc鄉gsgc 60
aggcggtgca ggctatgtgg gcccggctct 120
tcctggtgag gttctttgtg aacttcccct 180
acatggaggs tcccctggag atggagcgga 240
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tgctcgccct tgtggggaaa gcccacgccc 360
agatcctctc tggggtcatt ctggaggtgg 420
ctgagacgca gagagcctgg gccaagctgc 480
cctacaagga agtgggctgg gtgcagcagg 540
tgccctcttc ggggccgtag aagcttagcg 600
605
〈210〉 3
〈211〉 622
〈212〉 腿
〈213〉 human
〈400〉 3
tcatcatcat cattcttctg gtattgaggg gatcgagcgc agggagcgga gcgaggagct tatgtgggcc cggctctatg ccaactgcga ctttgtgaac ttcccctcgg ccaagcagt已 cctgg卿tg gagcggagcc cccagctgcg caacactgtc gtggagaacc tgcatgaccc gggga^gcc cacgccctca agcacaaggt ggtcattctg gaggtggtcg ccgaggaatt agcctgggcc aagctgcgtg gcctcatcta
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cagccacgtg accgctgcct acaaggaagt 540 14gggctgggtg cagcaggtcc ccaacgccac caccccaccg gccacactgc cctcttcggg 600 gccgtagaag cttagcgagt gc 622
〈210> 4
<211〉 32
〈212〉 腿 〈213〉人工序列
〈400〉 4
ctggtattga gggtcgcatg gagaaagtgc ca 32
〈210〉 5
〈211〉 35
<212〉 DNA
〈213〉 人工序列
<400> 5
tcatcatcat cattcttctg gtattgaggg tcgca 35
〈210〉 6
〈211〉 32
<212> 腿 〈213〉人工序列
〈400> 6
gatggccata tgcaccatca tcatcatcat tc 32
〈210〉 7
〈211〉 32
〈212〉 DNA <213>人工序列
〈400〉 7
gcactcgcta agcttctacg gccccgaaag gg 3權利要求
1、一種人源細胞珠蛋白的表達質粒，該質粒是將SEQ NO.1所示的DNA片段用NcoI和HindIII酶切后克隆到載體pET-32a的表達區得到。
2、 權利要求l所述的一種人源細胞珠蛋白的表達質粒的制備方法，該方法由以下步驟組成(1) 提取H印G2細胞的總RNA，用引物1和引物2進行反轉錄PCR得到序列為SEQN0.2 的DNA片段；(2) 以序列為SEQN0.2的DNA片段為模板用引物2和引物4進行PCR反應得到序列 為SEQN0.3的DNA片段；(3) 以序列為SEQ N0.3的DNA片段為模板用引物3和4進行PCR反應得到序列為SEQ NO.l的DNA片段；(4) 序列為SEQ NO.l的DNA片段用Afcol和歷'/ clin酶切后克隆到載體pET-32a的表 達區，得到重組質粒pET-32a- hCygb;所述引物1的序列為5， - CTGGTATTGAGGGTCGCATGGAGAAAGTGCCA-3，； 所述引物2的序列為5， - TCATCATCATCATTCTTCTGGTATTGAGGGTCGCA-3，； 所述引物3的序列為5' - GATGGCCATATGCACCATCATCATCATCATTC-3'; 所述引物4的序列為5' - GCACTCGCTAAGCTTCTACGGCCCCGAAAGGG-3，。
3、 一種轉化體，其特征在于該轉化體的宿主為大腸桿菌BL21(DE3)，導入的重組載體為 權利要求1所述的人源細胞珠蛋白的表達質粒。
4、 一種重組人源細胞珠蛋白，該蛋白由權利要求3所述的轉化體在異丙基-e-D-硫代半 乳糖苷的誘導培養下的表達產物經凝血因子FXa切割去除Trx標簽、His標簽和FXa識別序 列后獲得，其中所述的表達產物是由Trx標簽、His標簽、FXa識別序列和人源細胞珠蛋白依次連接構成的融合蛋白。
5、 權利要求4所述的一種重組人源細胞珠蛋白的制備方法，該方法由以下步驟組成(1) 將權利要求3所述轉化體在含異丙基-P -D-硫代半乳糖苷的LB培養基中誘導培養；(2) 收集菌體，將菌體破碎，取上清，用組氨酸標記親和層析柱分離出融合蛋白；(3) 所得融合蛋白用凝血因子FXa酶切，然后上組氨酸標記親和層析柱，用氯化鈉溶液 按1 99% (w/v)的梯度洗脫，收集出現第一個洗脫峰的洗脫液，最后用pH值為8.0、濃度 為10mM的Tris-HCl緩沖液透析，濃縮即可。
全文摘要
本發明提供了一種人源細胞珠蛋白的表達質粒，該質粒是將SEQ NO.1所示的DNA片段用NcoI和HindIII酶切后克隆到載體pET-32a的表達區得到。本發明所述人源細胞珠蛋白的表達質粒可在原核宿主中表達融合蛋白，該融合蛋白由Trx標簽、His標簽、FXa識別序列和人源細胞珠蛋白依次連接構成，用凝血因子FXa酶切去掉Trx標簽、His標簽和FXa識別序列即可獲得重組人源細胞珠蛋白，所得重組蛋白具有與天然人源細胞珠蛋白相同生物活性，對肝硬化有顯著的治療以及預防作用。
文檔編號C12N15/70GK101580846SQ200910040558
公開日2009年11月18日 申請日期2009年6月25日 優先權日2009年6月25日
發明者董文其, 威 魏 申請人:南方醫科大學